Détection de l'aspergillose pulmonaire invasive chez les patients hémopathie maligne en utilisant la technologie de flux latéral-

L'objectif général de cette procédure est de démontrer l'utilisation d'un dispositif d'écoulement latéral pour la détection rapide de l'antigène diagnostique d'Aspergillus dans des fluides sériques humains et des lavages broncho-alvéolaires (LBA). Cela est réalisé en appliquant d'abord l'échantillon sérique ou LBA sur le port de libération du dispositif d'écoulement latéral. La deuxième étape consiste à laisser la solution migrer le long de la membrane.

La prochaine étape consiste à déterminer si le test est valide en examinant la ligne de contrôle interne. La dernière étape consiste à interpréter le résultat du test en examinant la ligne de test. En fin de compte, le dispositif d'écoulement latéral est utilisé pour détecter la présence d'antigène diagnostique d'Aspergillus dans des échantillons de sérum ou de liquide de lavage broncho-alvéolaire.

La DLA de l'aspergillus peut être utilisée comme test complémentaire pour le diagnostic de l'aspergillose pulmonaire invasive. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l'immunodosage enzymatique de l'aspergillus, du galacto, du mannan, le test panf, le test fundal, l'analyse du bêta-glucane et le test PCR de l'aspergillus réside dans le fait que c'est un test diagnostique rapide, effectué au point d'intervention, nécessitant des installations de laboratoire et une formation minimales. Bien que la DLA ait été développée pour la détection des espèces d'aspergillus, la technologie d'immunochromatographie peut également être appliquée à la détection d'autres agents pathogènes infectieux tels que les espèces de cetosporium, de fusarium et de riser.

En incorporant des anticorps monoclonaux spécifiques à ces organismes, la démonstration visuelle de cette méthode est essentielle. Étant donné que l'interprétation des résultats des tests d'immunochromatographie nécessite une familiarisation avec le format du test, pour recueillir le sérum à partir d'échantillons de sang non traités, laissez le sang coaguler à quatre degrés Celsius. Le sérum et les lavages broncho-alvéolaires, ou fluides BAL, doivent être stockés en aliquots à moins 20 degrés Celsius avant utilisation. Le stockage en aliquots limite le risque de dégradation de l'antigène cible par des congélations-décongélations répétées des échantillons lors de tests répétés. Pour préparer les échantillons de sérum et de BAL à tester, décongelez-les à température ambiante, puis maintenez-les sur glace. Mélangez soigneusement par vortex, puis centrifugez pendant une minute à 14 000 tr/min. Pour le test de routine des échantillons humains, diluez le sérum au rapport un pour un avec du milieu de culture tissulaire. Alternativement, et afin de dissocier l'antigène cible des complexes immuns sériques, diluez le sérum au rapport un pour deux avec du PBS contenant 4 % d'EDTA, chauffez pendant trois minutes dans un bain-marie bouillant, puis centrifugez pendant cinq minutes à 14 000 tr/min.

Les liquides de lavage broncho-alvéolaire humains ne nécessitent aucun prétraitement. Un échantillon de LBA, une fois décongelé, vortexé et centrifugé, constitue un échantillon pur qui peut être appliqué directement sur le dispositif d'écoulement latéral. Pour les tests, les dispositifs d'écoulement latéral, ou LFD, sont conservés à température ambiante, soit 23 degrés Celsius, température à laquelle ils restent stables pendant 12 mois.

Pour commencer le test, retirez les dispositifs de leurs pochettes et placez-les sur une surface plane. À l’aide d’une pointe de pipette stérile, appliquez 100 microlitres de sérum prétraité sur le port de libération du dispositif en quelques secondes. Le liquide doit migrer par action capillaire le long de la membrane de cellulose nitreuse dans la fenêtre d’observation.

De la même manière, appliquez 100 microlitres d'un échantillon de LBA pur sur le port de libération du dispositif. Laissez le test s'effectuer pendant 15 minutes à température ambiante, moment auquel les résultats du test doivent être enregistrés. Le test ne doit pas être laissé plus de 15 minutes avant l'enregistrement des résultats.

Comme cela pourrait biaiser l'interprétation des résultats, une réaction faible ne sera pas améliorée en prolongeant la période d'incubation. La bandelette réactive comprend une ligne de contrôle interne indiquée par la lettre C sur le boîtier en plastique et une ligne de test indiquée par la lettre T. La ligne de contrôle doit toujours apparaître, indépendamment de la présence de l'antigène d'Aspergillus dans l'échantillon de sérum ou de LBA. Cela indique que le test a correctement fonctionné si l'antigène d'Aspergillus est présent dans l'échantillon de sérum ou de LBA.

La ligne de test apparaîtra également dans les 15 minutes suivant l'application de l'échantillon. Les intensités des réactions de test, de Lyme, sont proportionnelles aux concentrations de l'antigène cible dans les échantillons de sérum et de VAL. L'aspect le plus délicat de cette procédure est l'interprétation des résultats du test.

Les résultats du test rapide doivent être lus au bout de 15 minutes et comparés à l'exemple représentatif montré ici. Cette figure présente des exemples typiques de résultats faibles positifs, positifs modérés et fortement positifs au test rapide, obtenus avec des échantillons de LBA et de sérum. Toute ligne de test positive dans l'échantillon de sérum, quelle que soit son intensité, indiquerait une aspergillose invasive ou une maladie IPA, en raison de la présence d'antigène circulant d'Aspergillus dans la circulation sanguine. Toute réaction positive dans l'échantillon de LBA, quelle que soit son intensité, indiquerait une germination des spores et un développement d'hyphes potentiellement pathogènes dans les poumons.

En l'absence d'antigène d'Aspergillus, aucune ligne de test n'apparaîtra et le résultat est enregistré comme négatif. Ce tableau présente les résultats des tests par LFD utilisant des liquides de lavage broncho-alvéolaire provenant de patients atteints de leucémie myéloïde aiguë ou de LMA, diagnostiqués selon les critères diagnostiques du groupe d'étude de l'Organisation européenne pour la recherche et le traitement du cancer et de l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses. Ce tableau inclut les données cliniques et psychologiques correspondantes, ainsi que les résultats d'un test PCR spécifique ASPERIA pour chaque patient.

Conformément aux lignes directrices E-O-R-T-C-M-S-G de 2002, les patients 12, 13 et 16 ont été diagnostiqués avec une aspergillose pulmonaire invasive possible sur la base de facteurs liés à l'hôte et de critères cliniques ou d'une positivité au GM. Selon les lignes directrices révisées de 2008 de l'E-O-R-T-C-M-S-G, les facteurs liés à l'hôte associés uniquement à une positivité au GM, ou les facteurs liés à l'hôte associés uniquement à des critères cliniques, n'indiqueraient pas une infection fongique invasive possible, sauf en présence d'éléments probants provenant respectivement des données cliniques et de la mycologie. Le patient six a été diagnostiqué avec une aspergillose pulmonaire invasive probable selon les deux versions des lignes directrices, de 2002 et de 2008, en raison de facteurs liés à l'hôte, de signes cliniques majeurs et mineurs, ainsi que d'une positivité au GM.

Enfin, notez que ni le test LFD ni le test PCR ne sont actuellement inclus dans les recommandations E-O-R-T-C-M-S-G pour les échantillons de LBA des patients six et douze, mais il existe un fort accord entre ces deux tests et le test commercial de galactomannane indiquant la présence d'antigène et d'acide nucléique d'Aspergillus suite à cette procédure. D'autres méthodes comme le test immunoenzymatique de galactomannane, le test panf, le test de bêta-glucane fongique ou les tests PCR d'Aspergillus peuvent être réalisés en parallèle pour confirmer une infection fongique invasive. N'oubliez pas que manipuler du sérum sanguin humain et des liquides de LBA peut présenter un danger extrême, et que les opérateurs de l'appareil doivent toujours être vaccinés contre des maladies telles que l'hépatite B et la tuberculose.I.