Analyse phénotypique et isolement de cellules souches hématopoïétiques murines et Lineage-engagés progéniteurs

Ce vidéo montre un protocole d'isolement et de caractérisation phénotypique de progéniteurs hématopoïétiques à l'aide d'une séparation par billes magnétiques et d'un tri cellulaire activé par fluorescence. Premièrement, la patte arrière, le fémur, le tibia et la moelle épinière sont disséqués à partir d'une souris et homogénéisés afin d'obtenir une suspension de cellules de moelle osseuse. La population est ensuite enrichie en cellules exprimant C kit à l'aide d'un flux de microbilles magnétiques.

L'analyse cytométrique de la population enrichie démontre que cette méthode permet d'obtenir des cellules souches hématopoïétiques, des progéniteurs et une lignée hématopoïétique hautement purifiés, qui peuvent ensuite être utilisés pour des études fonctionnelles in vitro et in vivo. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le lavage osseux réside dans sa capacité à récupérer plus efficacement et plus rapidement les cellules de la moelle osseuse. Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie ou au diagnostic de l'inflammation, de l'auto-immunité, des immunodéficiences, des maladies dégénératives, des troubles métaboliques et des modèles de cancer immunitaire, car elle permet la caractérisation phénotypique et l'analyse fonctionnelle ex vivo des progéniteurs hématopoïétiques.

Ainsi, cette méthode peut fournir des informations sur la surveillance de l'hématopoïèse dans différentes conditions physiologiques et pathologiques. Elle peut également être utilisée pour étudier la signalisation en biologie cellulaire ainsi que l'expression des gènes régulée au cours du développement dans des sous-ensembles spécifiques de progéniteurs. Commencez par placer une souris euthanasiée dans un récipient en acier inoxydable.

Pulvériser l’abdomen et le dos avec de l’éthanol à 70 % afin de prélever les os qui serviront de source de cellules. À l’aide de ciseaux, pratiquer deux petites incisions dans la peau au niveau des pattes arrière ; à l’aide de pinces, désarticuler le fémur, puis retourner la souris ventre en haut et inciser la peau longitudinalement. Pour exposer la colonne vertébrale, retirer la colonne vertébrale.

Ensuite, à l’aide de ciseaux à pointe fine, retirez soigneusement tous les résidus de tissu mou de la colonne vertébrale. Utilisez de la gaze pour éliminer les résidus de tissu mou du fémur et du tibia.

Ensuite, placez les os dans un tube conique de 50 millilitres contenant 30 millilitres de RPMI.Medium supplémenté. Placez plusieurs filtres stériles aux quatre-cinquièmes dans un mortier stérile. Puis, à l’aide de pinces, transférez les os dans le mortier et recouvrez-les d’une autre couche de filtres afin d’assembler une surface de friction.

Placez ensuite un filtre de tamis à cellules de 40 microns dans un tube conique de 50 millilitres. Puis, à l’aide d’un pilon, brossez les os jusqu’à l’obtention d’une suspension cellulaire homogène. À l’aide d’une pipette, transférez la suspension dans le filtre cellulaire.

Ensuite, ajoutez cinq millilitres de RPMI frais supplémenté dans le mortier pour laver et récolter les cellules restantes en pipetant plusieurs fois. Puis ajoutez le RPMI dans le tube contenant le filtre. Répétez les deux dernières étapes jusqu’à ce que les os homogénéisés apparaissent clairs.

Une fois que la solution a traversé le filtre, transférez-la dans un nouveau tube de 50 millilitres et filtrez-la, puis répétez le processus afin d'éliminer les débris tissulaires résiduels. Centrifugez. Utilisez le tube à 500 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et retirez soigneusement le surnageant par aspiration. Veillez à ne pas perturber le culot cellulaire.

L'étape suivante de la procédure consiste à caractériser les phénotypes des progéniteurs hématopoïétiques. Commencez par resuspendre le culot cellulaire de chaque souris dans 15 millilitres de PBS contenant 2 % de FBS. Ensuite, centrifugez le tube à 500 × g pendant cinq minutes à 4 °C et retirez soigneusement le surnageant par aspiration.

Ne pas perturber le culot. Reese a resuspendu le culot dans cinq millilitres de PBS contenant 2 % de FBS et a dénombré les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Une fois la concentration cellulaire déterminée, transférer un million de cellules dans chaque puits d’une plaque de 96 puits à fond rond.

Ensuite, centrifuger la plaque à 500 × g pendant cinq minutes. Pendant la centrifugation, préparer un mélange d'anticorps monoclonaux dirigés contre les marqueurs de surface énumérés ici dans du PBS et 2 % de FBS afin de marquer les cellules. Une fois la centrifugation terminée, éliminer le surnageant en inversant la plaque et ajouter 50 microlitres du mélange d'anticorps dans chaque puits.

Ensuite, utiliser une pipette multicanal pour aspirer et expulser plusieurs fois afin de dissocier les cellules en une suspension unicellulaire. Incuber les cellules pendant 20 minutes à l'obscurité à quatre degrés Celsius ; après l'incubation, laver les cellules deux fois avec 150 microlitres de PBS contenant 2 % de FBS. Puis centrifuger la plaque à 500 ×g pendant cinq minutes.

Ensuite, éliminez la senna en retournant la plaque. Puis, ajoutez 50 microlitres de streptavidine AP trois taille sept diluée au 1/300 dans du PBS contenant 2 % de FBS dans chaque puits, puis dissociez en une suspension monocellulaire à l’aide d’une pipette. Incubez les cellules pendant 10 minutes à l’abri de la lumière à quatre degrés Celsius, suivant l’incubation.

Lavez les cellules deux fois avec 150 microlitres de PBS et 2 % de FBS. Après centrifugation de la plaque, jetez le surnageant S et resuspendez les cellules dans 100 microlitres de PBS et 2 % de FBS, puis analysez les échantillons par cytométrie. Ensuite, pour trier des sous-ensembles sélectionnés de cellules hématopoïétiques, un enrichissement magnétique est effectué sur la moelle osseuse afin d'enrichir les cellules positives pour le marqueur sécrété. Resuspendez le culot cellulaire de moelle osseuse provenant d'au moins 10 souris dans un millilitre de solution tampon contenant un anticorps monoclonal anti-C kit conjugué à un PC, dilué au 1/50.

Incuber les cellules pendant 20 minutes à l'obscurité à quatre degrés Celsius après l'incubation. Laver les cellules deux fois avec 40 millilitres de solution tampon. Après centrifugation, retirer soigneusement le surnageant par aspiration.

Ensuite, ajoutez 50 microlitres de microbilles anti-A PC par souris directement dans le culot. Mélangez soigneusement et incubez 20 minutes à l'abri de la lumière à quatre degrés Celsius. Après l'incubation, lavez et centrifugez les cellules comme précédemment. Resuspendez ensuite le culot cellulaire dans quatre millilitres de solution tampon pour chaque groupe de trois souris, puis placez les colonnes LS max dans le champ magnétique d'un séparateur max adapté.

Préparez les colonnes en les rinçant avec quatre litres de solution tampon. Ensuite, appliquez la suspension cellulaire et récupérez les cellules non marquées qui traversent dans un tube de collecte. Lavez la colonne avec quatre litres de solution tampon, trois fois.

Ajouter un nouveau tampon lorsque le réservoir de la colonne est vide. Une fois que toute la solution a traversé, jeter l’écoulement, retirer les colonnes du séparateur et placer chacune d’elles au-dessus d’un tube conique de 15 millilitres. Prélever à la pipette quatre millilitres de solution tampon sur chaque colonne et éluire immédiatement les cellules marquées magnétiquement en enfonçant le piston dans la colonne.

Centrifuger les tubes à 500 ×g pendant cinq minutes. Retirer soigneusement le SUP natif par aspiration. Résuspendre chaque culot avec un millilitre de solution tampon et regrouper les culots dans un seul tube conique de 15 millilitres.

Une fois la population de cellules positives pour le kit marin enrichie, colorer et trier les cellules par cytométrie en flux. Les progéniteurs hématopoïétiques et les cellules souches hématopoïétiques provenant d'une suspension de moelle osseuse enrichie en cellules positives pour le kit marin à l'aide de billes magnétiques, et les CSH-LT et THSC ont été triées selon l'expression de molécules de surface comme décrit dans cette vidéo. Cette figure montre un exemple de la procédure de sélection électronique pour quantifier les progéniteurs lymphoïdes communs en tant que linin.

Observer les cellules à faible expression de l'interleukine sept R positive. Cellules Lin négatif, CD34 positif, SCAR1 positif et Lin négatif, CD34 positif, SCAR1. Cellules faibles provenant du portillon CD34 positif.

Les progéniteurs myéloïdes communs sont identifiés comme des cellules FC gamma R.Low CD 34 positives. De même, à partir du phénotype C kit positif, les progéniteurs granulocytaires et monocytaire sont identifiés comme des cellules FC gamma élevées CD 34 positives, tandis que les progéniteurs mégacaryocytaires et érythrocytaires sont identifiés comme des cellules FC gamma faibles CD 34 négatives. À partir des cellules LKS huit L-T-H-S-C et S-T-H-S-C, on obtient respectivement des cellules CD 34 négatives et CD 34 positives. Ainsi, deux populations enrichies et hautement purifiées sont obtenues, qui sont physiologiquement présentes en faible nombre, afin d'évaluer l'impact de l'auto-immunité sur l'hématopoïèse des cellules souches hématopoïétiques provenant de souris témoins et de souris atteintes de maladie inflammatoire de l'intestin.

Ont été colorés avec l'anticorps KI 67 et le DPI, comme on peut le voir ici. Les cellules en cycle sont à peine, voire pas du tout, détectables dans le compartiment des cellules souches hématopoïétiques LKS CD 34 négatives des témoins sains. En revanche, ce même sous-ensemble cellulaire est significativement augmenté au cours de la MII, et un nombre important de CSH est détecté dans les phases SG deux M du cycle cellulaire.

Cela suggère donc que l'inflammation chronique médiée par les lymphocytes T détermine l'entrée des cellules souches hématopoïétiques (CSH) dans le cycle cellulaire. Afin d'évaluer la présence d'ATP stocké dans des vésicules, les cellules CD34 négatives provenant de souris saines ont été marquées avec le composé liant les nucléotides, la quinine, et une analyse au rouge nucléaire par microscopie confocale sur cellules vivantes révèle que, dans les CSH mais pas dans les précurseurs myéloïdes granulocytaires (GMP), des vésicules positives à la quinine sont visibles dans le cytoplasme, permettant de déterminer si les CSH sont sensibles à l'ATP extracellulaire. La réponse calcique des cellules souches hématopoïétiques triées, chargées avec le fluorophore 4 0 2 et stimulées par l'ATP et l'ionomycine, a été analysée comme indiqué ici. Les tracés individuels d'élévation du calcium montrent qu'une augmentation du calcium cytosolique dans les CSH à long terme (LT-HSC) s'observe suite à l'activation de récepteurs P2 purement anergiques.

Après exposition à un TP, car l'augmentation du calcium cytosolique induit la libération de l'ATP vésiculaire. Cette expérience suggère qu'un TP peut réguler sa propre libération à partir des CSH et démontre que cette procédure peut être utilisée pour des études fonctionnelles des CSH. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler les cellules souches neurone topo et les progéniteurs engagés dans une lignée destinés à des tests fonctionnels. Suite à cette procédure, d'autres méthodes, comme la reconstitution de souris receveuses non irradiées, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que le potentiel de reconstitution des cellules souches hématopoïétiques purifiées à partir d'un état C ou d'un environnement inflammatoire.