Imagerie quantitative de Lineage spécifiques Toll-like Receptor la signalisation médiée par les monocytes et les cellules dendritiques à partir de petits échantillons de sang humain

L'objectif général de l'expérience suivante est de démontrer l'utilisation de la technologie de cytométrie en imagerie pour quantifier les mécanismes cellulaires de cellules immunitaires primaires provenant de cohortes de patients bien définies. Cela est réalisé en isolant d'abord des cellules mononucléées du sang périphérique, ou PBMC, à partir d'échantillons sanguins obtenus auprès de patients ou de volontaires sains. Après l'isolement, les cellules sont activées, puis marquées de manière fluorescente.

Ensuite, les cellules sont focalisées hydrodynamiquement, excitées par une lumière laser et imagées selon une intégration à retard temporel sur une caméra CCD. Enfin, les images sont acquises à l’aide du cytomètre à flux d’images et la quantification de NF kappa b est effectuée.

La translocation dans chaque image cellulaire est effectuée à l'aide du logiciel IDEAS. En fin de compte, les différences entre chaque groupe de sujets peuvent être déterminées par l'analyse de nuages de points, d'histogrammes et d'images cellulaires. L'avantage du cytomètre imageur est qu'il combine les données morphologiques et l'immunofluorescence.

Nous sommes en mesure d'analyser les voies de signalisation cellulaire de manière spécifique à la lignée, qu'il s'agisse de cellules uniques ou de populations, en partant d'un échantillon sanguin de petite taille. Cette méthode peut aider à répondre à des questions fondamentales en localisant et en quantifiant les intermédiaires de la signalisation. Par exemple, elle peut être utilisée pour étudier la translocation nucléaire médiée par des facteurs transparents ou pour examiner les effets du vieillissement sur la biologie cellulaire.

Un responsable de mon laboratoire démontrera la technique après avoir isolé des cellules mononucléées du sang périphérique obtenues auprès de volontaires humains. Resuspendre les PBMC récupérées à raison de 3 × 10⁶ cellules par 0,6 millilitre de milieu, puis transférer la suspension cellulaire dans des tubes de 1,5 millilitre. Ensuite, stimuler certaines des cellules avec un agent activateur tel que l'agoniste TLR8 R848 illustré ici, puis incuber toutes les cellules à 37 °C pendant 10 à 60 minutes dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone.

Après la période d'incubation, centrifuger les cellules pendant cinq minutes à 500 × g à température ambiante, éliminer le surnageant, étiqueter les cellules avec un cocktail d'anticorps de surface spécifiques des lignées monocytaire ou dendritique pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius, y compris des tubes de cellules marquées avec des conjugués monochromes destinés à servir de contrôles de compensation. Ensuite, fixer les cellules dans du PFA-PBS à 4 % pendant 10 minutes à température ambiante. Après avoir centrifugé les cellules pendant 10 minutes à 500 × g à température ambiante, resuspendre les pbmc dans du tampon de congélation et conserver les cellules à moins 80 degrés Celsius jusqu'au jour de l'analyse.

Décongelez rapidement les cellules dans un bain d'eau à 37 degrés Celsius, puis, après centrifugation pour éliminer le tampon de congélation, perméabilisez-les avec 100 microlitres de tampon BD Perm Wash. Ensuite, étiquetez-les avec des anticorps dirigés contre des composants intracellulaires de signalisation, tels que les anticorps anti NF-kappaB p65 illustrés ici, pendant 20 minutes à température ambiante. Après centrifugation pour former le culot, resuspendez les cellules dans 100 microlitres de tampon BD Perm Wash contenant de l'anticorps secondaire IgG de chèvre anti-lapin.

Alexa 647 et incuber les PBMC pendant encore 20 minutes à température ambiante. Juste avant l’imagerie, contre-tacher les cellules avec un colorant nucléaire en commençant par allumer l’appareil ImageStream, puis en lançant le logiciel Inspire. Ensuite, cliquer sur Charger le modèle par défaut, puis sélectionner Initialiser la fluidique.

Ensuite, cliquez sur le menu de la galerie d'images et sélectionnez tout. Appuyez maintenant sur exécuter la configuration pour commencer l'acquisition d'images des billes, puis sélectionnez le canal de champ clair. Une fois que les billes de vitesse sont en cours d'exécution, cliquez sur démarrer tout sous l'onglet d'assistance pour étalonner et tester l'instrument.

Une fois le système ImageStream calibré, appuyez sur flush, verrouillez et chargez pour introduire l'échantillon le plus brillant dans l'appareil. Réglez ensuite la puissance du laser de manière à ce que chaque fluorochrome ait une valeur maximale de pixel comprise entre 104 000 comptes, telle que mesurée sur les diagrammes de dispersion. Définissez ensuite les critères de classification des cellules.

Cliquez maintenant sur Exécuter, puis sur Acquérir afin de collecter et enregistrer le fichier de données de l'expérience. Pour analyser les fichiers de données, ouvrez d'abord Ideas. À l'aide du logiciel analytique, créez des fichiers d'images compensés, puis appliquez un tri sur les événements présentant une intensité normale du colorant nucléaire et un rapport d'aspect élevé pour le colorant nucléaire. Pour distinguer les cellules uniques dans la région R1 des débris ou des événements multicellulaires, les monocytes se situent dans la région définie pour les cellules positives pour CD14. Les cellules dendritiques myéloïdes, caractérisées par une forte expression de CD11c, une faible expression de CD4 et des marqueurs lin1 négatifs, se trouvent dans la région R3.

Enfin, utilisez le logiciel Ideas pour déterminer la colocalisation du facteur de transcription cytoplasmique NF kappa B avec le colorant nucléaire. Une forte corrélation entre NF kappa B et le colorant nucléaire, indiquant une colocalisation des deux marqueurs, se traduit par un score de similarité élevé et reflète le degré d'activation de la cellule. Le pourcentage d'événements présentant une forte similarité entre différents groupes de traitement ou populations de patients peut être comparé afin d'évaluer l'efficacité fonctionnelle relative des cellules selon l'approche Ideas.

Des logiciels peuvent ensuite être utilisés pour afficher des images de cellules issues de segments clés des histogrammes de population. ImageStream permet le tri par fenêtrage de sous-ensembles cellulaires directement à partir de pbmc et l'imagerie des réponses cellulaires à partir de populations cellulaires fenêtrées mais non triées. Ici, l'effet de la signalisation TLR sur la localisation nucléaire de NF kappa BP 65 dans les cellules dendritiques myéloïdes lin one, négatives pour CD four, faiblement positives pour CD 11 C et positives pour CD 11 C a été quantifié au départ.

Un pourcentage élevé de cellules non stimulées présentant le facteur de transcription NF kappa BP 65 dans le cytoplasme a été observé. Après stimulation, les cellules traitées ont montré un score de similarité significativement plus élevé entre NF Kappa BP 65 et la coloration nucléaire au PI, indiquant que NF Kappa BP 65 s'est translocalisé dans le noyau suite à la stimulation. Des images numériques acquises simultanément pour les populations cellulaires non traitées ou stimulées par R 8 48 illustrent des cellules représentatives ainsi que l'intensité de la translocalisation de NF kappa B dans le noyau cellulaire. Remarquez l'intensité plus marquée de la coloration de NF Kappa B et du PI dans le groupe stimulé par R 8 48 par rapport aux cellules non traitées.

Nous avons utilisé cette technique sur des cellules provenant de donneurs d'âges différents et avons mis en évidence des différences dans les voies d'activation de NF-kappa B médiées par les TLR. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une journée, avec un temps supplémentaire nécessaire pour l'analyse des images, permettant ainsi d'obtenir à la fois des images de localisation et des statistiques au niveau de la population. De plus, nous pouvons imager directement les réponses de plusieurs populations cellulaires sans séparation physique. Le cytomètre imageur peut être appliqué largement à de nombreux mécanismes cellulaires et devrait s'avérer très utile dans la recherche translationnelle.