Name: Préparation dune souris Awake pour lenregistrement des réponses de neurones et linjection de traceurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: Apprenez à enregistrer les réponses neuronales chez la souris éveillée pour l'électrophysiologie. Cette méthode utilise un cadre stéréotaxique et une craniotomie pour isoler les unités simples sans effet des anesthésiques.

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Soutenu par la NSF subvention 0920060, NIH DC004395, NHMRC subvention 1009482, NSW Bureau de la science et de la recherche médicale, et la Passe Garnett et Rodney Williams Memorial Foundation.

1. Vue d&#39;ensemble d&#39;appui-tête <ol><li> Pour assembler un custom-built tête-post, insérer un 1/16 &quot;en acier inoxydable rouleau broches perpendiculairement dans un trou percé dans un 3/32&quot; tige en acier inoxydable pour former une croix. La pièce verticale de la tête-poste doit être d&#39;environ 20 mm et la pièce transversale horizontale d&#39;environ 15 mm. Appuyez sur une extrémité de la tige verticale à accepter une vis n ° 1-72. (Fig. 1). </li><li> Au cours de la chirurgie et l&#39;enregistrement, la tête-poste est fixée dans un laiton sur-mesure ou la barre de montage en aluminium avec un 1-72 # vis (Fig. 2). Le long morceau de la barre de montage devrait être d&#39;environ 90 mm de long et 5-10 mm de large. Le chef-poste s&#39;inscrit dans une rainure dans une extension de 15 mm au large de la longue barre qui est incliné à 45 degrés. Pour empêcher la rotation de tête, la traverse des niché tête de la poste dans une petite rainure sur le bas de la barre de montage. </li><li> La barre de montage en ensuite attaché à un bloc en aluminium sur mesure de montagek (fig. 3). Le bloc de montage est d&#39;environ 30 mm x 30 mm x 25 mm. Ce bloc de montage est fixé à un micromanipulateur afin que la position de la tête-poste ne peut être correctement placé le long de la ligne médiane et à Bregma. Le bloc de montage est fait de deux pièces emboîtées avec des vis. Un coupe-circuit dans le bloc permet à la barre de montage de glisser à l&#39;intérieur et être fixé avec les vis. La barre de montage est parallèle à la surface de la table. Pendant l&#39;enregistrement, fixer la barre dans un cadre personnalisé stéréotaxique (fig. 4). Le stereotax est conçu pour monter la barre dans la même position que dans le bloc de montage pendant la chirurgie. Cette disposition assure que la souris sera toujours aligné sur le cadre stéréotaxique à travers des sessions expérimentales. </li><li> Couper une tige de tungstène (diamètre 0,010 &quot;) à environ 5 mm de longueur, avec environ 1 mm coudé à 45 °. Ce tige sert de broche de terre (fig. 1). </li></ol> 2. Stéréotaxique Alignment pour craniotomie Remarque: Toutes les procédures décrites ci-dessous suivent standards techniques chirurgicales aseptiques et ont été approuvés par le soin des animaux l&#39;État de Washington University et le Comité d&#39;utilisation et l&#39;animal Comité d&#39;éthique de l&#39;Institut Garvan. <ol><li> Anesthésier la souris en plaçant dans une chambre d&#39;induction avec 5% d&#39;isoflurane. L&#39;absence d&#39;une réaction à la queue et / ou pincement de l&#39;orteil en sorte que l&#39;animal est entièrement anesthésié. </li><li> Placez la souris dans un cadre stéréotaxique rongeurs équipé d&#39;un adaptateur pour souris (Stoelting). Pour orienter la souris correctement, placer les dents à l&#39;intérieur du trou de la barre de morsure et serrer la pince le nez de sorte qu&#39;il soit bien ajusté. Placez la souris aussi droite que possible dans la barre de morsure et pince nez. Placez un masque fait à partir d&#39;un morceau de gants en latex sur le nez de la souris, et de garder l&#39;isoflurane à 5% jusqu&#39;à ce que le taux de respiration de la souris est d&#39;environ 1 respiration / sec. Tourner l&#39;isoflurane à 1,5 - 2,0%. Fixer la tête en utilisant til l&#39;oreille-bars en faisant attention à ne pas percer le tympan. Bars devrait être tendu mais pas pénétrer trop profondément dans les conduits auditifs. </li><li> Placez un coussin chauffant sous la souris. </li><li> Appliquer une pommade ophtalmique pour éviter que les yeux de se dessécher. </li><li> Rasage du cuir chevelu d&#39;entre les oreilles jusqu&#39;à les yeux avec un rasoir petite ou d&#39;une amende de point ciseaux. </li><li> Nettoyer et stériliser le cuir chevelu en les essuyant avec du chlore et de hexidine (ou bétadine) gommage suivi par l&#39;alcool rinçage répété 3 fois. </li><li> Pour enlever la peau sur le dessus du crâne faire une incision le long de la ligne médiane de l&#39;arrière de la tête aux yeux. </li><li> Grattez le périoste sur les bords de l&#39;incision avec un scalpel. Si nécessaire (en fonction de la cible expérimentale), soigneusement retirer la musculature à l&#39;arrière du cou avec une pince, permettant au muscle de se déchirer le long de fascicules à minimiser les saignements. Appliquer gelfoam dessous du tissu pour réduire au minimum le cuir chevelu d&#39;humidité et d&#39;empêcher la peau de se déplacer sur le crâne. </li><li> Sécher la surface du crâne avec un coton-tige imbibé d&#39;alcool isopropylique pour améliorer la visualisation des points de repère du crâne. </li><li> Aligner le crâne à la norme stéréotaxique coordonnées 13. Insérez une sonde à pointe fine dans le porte-électrode et l&#39;attacher à la micromanipulateur stéréotaxique. Une tige de métal aiguisé fonctionne bien à cet effet (Fig. 5). </li><li> Utilisez le point d&#39;identifier Bregma (Fig. 5A) et Lambda (Fig. 5B) sur le crâne. Déplacez la sonde va-et-vient entre ces deux points, en vérifiant que la coordonnée latérale-médiale pour chaque emplacement ne diffère pas de plus de 50 um. Repositionner la tête, au besoin en prenant soin de desserrer les boucles d&#39;oreilles bars, déplacement de la tête et des oreilles-bars latéralement, et en resserrant les oreilles-bars. </li><li> Vérifiez que la hauteur dorso-ventral à chaque emplacement ne diffère pas de plus de 50 um. Réglez la hauteur du nez-clamp, qui fera tourner le crâne autour de l&#39;axe des oreilles-bars,pour niveler la hauteur du crâne, si nécessaire. La hauteur de l&#39;oreille-bar peut aussi être nécessaire d&#39;ajuster. </li><li> Utilisez un atlas de 13 à identifier les coordonnées de la cible d&#39;intérêt (Fig. 5C) par rapport à Bregma. Marquez le crâne au-dessus de la cible (par exemple, un «X» ou d&#39;utiliser l&#39;encre de Chine pour dot quatre coins d&#39;un carré), où une craniotomie sera faite (Fig. 5D). </li></ol> 3. Chef-poste et d&#39;installation Broche de terre <ol><li> Utilisez gel de mordançage pour nettoyer le crâne. Utilisez l&#39;applicateur de frotter et de diffuser gel de mordançage sur la surface (10 sec). Laver à l&#39;eau et sécher complètement. Appliquer l&#39;apprêt de ciment dentaire à la surface du crâne à l&#39;aide de l&#39;applicateur. Fais adhésif avec nouvel applicateur. Cure de l&#39;adhésif avec une lumière UV-gun (1 cycle). </li><li> Choisir un emplacement pour la broche de terre qui est distale du site cible. Soigneusement portait un petit trou dans le crâne avec la pointe d&#39;un scalpel n ° 65 miniblade juste assez large pour l&#39;extrémité courte de la p-chausséepour entrer et se reposer sur les méninges. La broche de terre doit être orienté de sorte qu&#39;il est dirigée vers l&#39;extérieur à partir Bregma et le futur tête-après (Fig. 6A). </li><li> Fixer la tête-poste à la barre de montage et de bloquer et de joindre à la micromanipulateur. En déplaçant le micromanipulateur en trois dimensions, la position de la tête-post sur ​​Bregma, touchant tout juste le crâne (figure 6B). La base de la tête-post doit reposer à plat sur ​​le crâne. </li><li> En utilisant des sondes de dissection, appliquez une petite quantité de ciment dentaire autour de la tête-poste et la broche de terre (Fig. 6C). Appuyez sur le ciment vers le bas pour assurer un bon contact avec le crâne. Remarque: Ne pas utiliser de ciment trop ou il ne sera pas durcira de façon égale. Cure du ciment avec une lumière UV-gun (3-4 cycles à partir d&#39;angles multiples). </li><li> Appliquer la deuxième étape de ciment et construire la base autour de la tête-après et couvrent les rainures de la tête-après (Fig. 6D). </li></ol> 4. Craniotomie <ol><li> Localisez la craniotomie marque de référence, qui sera partiellement masqué par l&#39;amorce. Utiliser un scalpel # 65 pour marquer un carré de 3 mm x 3 mm autour de ce site et appliquez une goutte de la lidocaïne pour réduire la sensibilité et de minimiser les saignements. </li><li> Assurez-scores multiples de chaque côté de la place (jusqu&#39;à 10), en faisant attention de ne pas couper à travers l&#39;os et dans le cerveau (Fig. 7A). </li><li> Une fois le volet osseux devient lâche, utilisez la pointe du scalpel pour le soulever, laissant intacte la dure-mère (figure 7B). </li><li> Couvrir avec de la cire d&#39;os. </li></ol> 5. Post-chirurgie <ol><li> Éteignez l&#39;anesthésie au gaz et enlever la souris à partir du cadre stéréotaxique. </li><li> Utilisez un coton-tige à appliquer la pommade de lidocaïne autour peau exposée pour amortir la sensation autour de la plaie. Utilisez un autre coton-tige à appliquer Neosporin à la peau exposée. Injecter le kétoprofène (5 mg / kg IM ou IP en fonction des préférences individuelles des vétérinaires du IACUC) queun analgésique post-opératoire. Souris sera généralement lever et se déplacer à quelques minutes de l&#39;arrêt de gaz. </li><li> Placer la souris dans une cage au chaud et le moniteur jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit prêt à retourner au logement des animaux. </li><li> L&#39;animal doit être vérifié au moins une fois par jour après qu&#39;il a récupéré d&#39;une intervention chirurgicale. Surveillez les signes de la mauvaise alimentation et / ou d&#39;eau potable et le comportement apathique. Si la douleur est suspectée, de fournir kétoprofène toutes les 24 heures (même dose que à la fin de post-chirurgie) jusqu&#39;à ce que soulagés. La lidocaïne peut être appliqué localement sur la plaie, si l&#39;animal se gratte ou montre des signes d&#39;inconfort. Animaux généralement récupérer de la chirurgie sans complications ou de la douleur. </li></ol> 6. Injection d&#39;enregistrement et de Dye <ol><li> Attendez au moins un jour après la tête après chirurgie avant d&#39;utiliser la souris pour les enregistrements. </li><li> Placez la souris sur un dispositif de retenue de la mousse moulée sur le corps de la souris. La souris a déjà été adapté à cet appareil, réduisant ainsi son inquiétude. L&#39;adaptation est typiquepour manipuler la souris tous les jours après le sevrage et pendant environ une semaine avant la chirurgie et des expériences, placez la souris dans le dispositif de la mousse pendant 1-5 minutes. Suspendre dans le dispositif de cadre stéréotaxique (fig. 4). </li><li> Sécurisé tête-poste à la barre de montage, qui est maintenant fixée au cadre stéréotaxique (fig. 4). </li><li> Connectez-vous à la broche de terre avec un fil terminé par un objet contondant de calibre 22 pointe de l&#39;aiguille hypodermique. </li><li> Retirer la cire d&#39;os au cours de la craniotomie. Retirez-mère, si nécessaire en utilisant la pointe d&#39;un scalpel miniblade. </li><li> Entraînement électrode à l&#39;emplacement approprié stéréotaxique et commencer l&#39;enregistrement (Fig. 8). Pour seulement les enregistrements électrophysiologiques, une variété d&#39;électrodes peuvent être utilisées. Le choix d&#39;électrode est dépendante de l&#39;emplacement et le type d&#39;enregistrements requis. Le choix de l&#39;électrode pour les enregistrements de la souris se réveillent sera la même chose que ce qu&#39;un chercheur utilise dans une souris anesthésiée. Pour combinées avec des enregistrements électrophysiologiquescolorant / traceur injections, une électrode micropipette est utilisé à 10. La micropipette est rempli avec le colorant / traceur de choix de façon à pouvoir être injecté par iontophorèse à la fin de expériences électrophysiologiques. Électrodes Multibarrel peut également être utilisé afin que les manipulations pharmacologiques peuvent être faites. L&#39;électrode multibarrel est monté sur une micropipette d&#39;enregistrement unique (fig. 8). Ces techniques sont standard dans la littérature et ne sont pas différentes pour les enregistrements anesthésiés par rapport éveillé. </li><li> Les enregistrements peuvent être réalisés pendant 4-5 heures sur 3-4 jours consécutifs. </li><li> À la fin de la session d&#39;enregistrement, le colorant / traceur peut être injecté. Parce qu&#39;il n&#39;ya pas de récepteurs de douleur dans le cerveau, l&#39;injection iontophorétique de la teinture ou le traceur dans le cerveau est susceptible de provoquer l&#39;inconfort. Cependant, une fois les propriétés de réponse électrophysiologique de la région où l&#39;injection doit être faite sont caractérisés, l&#39;animal pourrait être anesthésiés avec l&#39;isoflurane fou l&#39;injection. Cela permettrait d&#39;éliminer toutes les sensations possibles indésirables. Parce que le colorant / traceur est déjà dans la micropipette, les fils actifs et la terre peut être commuté de l&#39;enregistrement électrophysiologique set-up pour le générateur de courant à injecter du colorant iontophorèse / traceur. Utiliser le protocole approprié pour la teinture / traceur dans l&#39;électrode. Retirer l&#39;animal de la contrainte et à la retenue headpost corps et revenir à sa cage. </li><li> A la fin de l&#39;expérience, suivre le protocole approprié pour l&#39;euthanasie et le traitement des tissus pour récupérer au site d&#39;injection et de l&#39;étiquetage. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs Une installation réussie de la tête-post permet à l&#39;expérimentateur pour enregistrer les réponses simples et plusieurs unités d&#39;un non anesthésié, la souris éveillée sur plusieurs jours. Le système de retenue permet à la stabilité des enregistrements électrophysiologiques de neurones isolés dans le cerveau. Excellente isolation des unités uniques et des réponses fortes tstimuli o peuvent être enregistrées à partir de la structure du cerveau même sur plusieurs jours, par exemple dans la souris colliculus inférieur (fig. 9A, le premier jour; figure 9B, deux jours). Avec une bonne tête après l&#39;installation, chaque souris sera toujours alignée sur l&#39;appareil de stéréotaxie et la souris stéréotaxique atlas, 13 résultant de la localisation fiable de noyaux du cerveau en particulier. Cette localisation permet fiables pour l&#39;injection de colorants et des traceurs dans les structures spécifiques après des jours d&#39;enregistrement multiples. Par exemple, pour évaluer en ordre descendant saillies du mésencéphale auditive à l&#39;tronc cérébral, biotinylé dextrane aminé (visualisée en utilisant comme chromogène diaminobenzidine) peut être injecté dans la souris colliculus inférieur (fig. 10A) après l&#39;identification des propriétés électrophysiologiques de réponse neuronales au niveau du site d&#39;injection (dans la Fig. 10A, un neurone a été enregistrée avec une meilleure fréquence de 51 kHz), et après le traitement des tissus, uneétiquetage nterograde dans le noyau cochléaire controlatéral dorsale peut être visualisé et tracée (Fig. 10B). Photomicrographies à plus haute résolution peut également être obtenu pour afficher les axones marqués antérograde et des bornes (Fig. 10C). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig1.jpg" /> Figure 1. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig2.jpg" /> Figure 2. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig3.jpg" /> Figure 3. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig4.jpg" /> Figure 4. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig5.jpg" /> Figure 5. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig6.jpg" /> <strong&gt; Figure 6. <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig7.jpg" /> Figure 7. <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig8.jpg" /> Figure 8. <img alt="Figure 9" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig9.jpg" /> Figure 9. <img alt="Figure 10" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig10.jpg" /> Figure 10.

<ol><li>Evans, E. F., Nelson, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+responses+of+single+neurones+in+the+cochlear+nucleus+of+the+cat+as+a+function+of+their+location+and+the+anaesthetic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The responses of single neurones in the cochlear nucleus of the cat as a function of their location and the anaesthetic state.</a> Exp. Brain Res. 17, 402-427 (1973).</li>
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<li>Suga, N., O'Neill, W. E., Manabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+sensitive+to+combinations+of+information-bearing+elements+of+biosonar+signals+in+the+mustache+bat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons sensitive to combinations of information-bearing elements of biosonar signals in the mustache bat.</a> Science. 200, 778-781 (1978).</li>
<li>O'Neill, W. E., Suga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+range-sensitive+neurons+in+the+auditory+cortex+of+the+mustache+bat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Target range-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat.</a> Science. 203, 69-73 (1979).</li>
<li>Suga, N., O'Neill, W. E., Manabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harmonic-sensitive+neurons+in+the+auditory+cortex+of+the+mustache+bat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Harmonic-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat.</a> Science. 203, 270-274 (1979).</li>
<li>Portfors, C. V., Felix, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2nd+Spectral+integration+in+the+inferior+colliculus+of+the+CBA%2FCaJ+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">2nd Spectral integration in the inferior colliculus of the CBA/CaJ mouse.</a> Neuroscience. , 136-1159 (2005).</li>
<li>Felix, R. A. 2nd, Portfors, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory%2C+inhibitory+and+facilitatory+frequency+response+areas+in+the+inferior+colliculus+of+hearing+impaired+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Excitatory, inhibitory and facilitatory frequency response areas in the inferior colliculus of hearing impaired mice.</a> Hear Res. 228, 212-229 (2007).</li>
<li>Portfors, C. V., Jonson, K. G., Roberts, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-representation+of+species-specific+vocalizations+in+the+awake+mouse+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Over-representation of species-specific vocalizations in the awake mouse inferior colliculus.</a> Neuroscience. 162, 486-500 (2009).</li>
<li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+KBJ+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , 3rd edn, Academic Press. NY. (2007).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

L&#39;avantage du système appuie-tête-poste pour des expériences électrophysiologiques et neuroanatomiques chez la souris, c&#39;est que les expériences peuvent être réalisées avec non anesthésiés, les souris éveillées, élimination de la contamination potentielle due à la réponse des médicaments anesthésiques. En outre, la mise en place peut être utilisé sur plusieurs jours pour permettre une utilisation plus efficace des animaux. La plupart des composants pour la tête-après sont disponibles...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Gel de mordançage pour le nettoyage du crâne avant de ciment dentaire </td><td> Henry Schein </td><td> 101-5396 </td><td> 12/pk avec des seringues 1,2 ml </td></tr><tr><td> Guide à l&#39;intention du ciment dentaire </td><td> Kerr OptiBond </td><td> 25881 </td><td> 8 bouteilles ml </td></tr><tr><td> Colle pour ciment dentaire </td><td> Kerr OptiBond </td><td> 25882 </td><td> 8 bouteilles ml </td></tr><tr><td> Applicateurs de ciment dentaire </td><td> Kerr OptiBond </td><td> 24680 </td><td> 200/pk </td></tr><tr><td> Ciment dentaire </td><td> Charisme, Heraeus Kulzer </td><td> 66000085 </td><td> Recharge Seringue 4gm </td></tr><tr><td> Rod tungstène (Broche de terre) </td><td> Systèmes AM </td&gt; <td> 717200 </td><td> 0,010 &quot;de diamètre </td></tr><tr><td> Lampe de polymérisation UV Economie </td><td> Henry Schein </td><td> CU-80 </td><td></td></tr><tr><td> Chef-post </td><td> Construit en interne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Barre de montage </td><td> Construit en interne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bloc de montage </td><td> Construit en interne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cadre stéréotaxique </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 902 </td><td></td></tr><tr><td> Souris et l&#39;adaptateur rat nouveau-né </td><td> Stoelting </td><td> 51625 </td><td></td></tr><tr><td> DeltaPhase Pad isotherme </td><td> Braintree Scientific, Inc </td><td> 39DP </td><td></td></tr></tbody></table>

préparation d&#39;une souris awake pour l&#39;enregistrement des réponses de neurones et l&#39;injection de traceurs

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

Il est bien connu que l&#39;anesthésie modifie les propriétés de réponse de neurones dans différentes régions du cerveau. 13. Dans le système auditif, les propriétés fondamentales de la réponse neurones du tronc cérébral, y compris seuil, la spécificité de fréquence, et des bandes latérales inhibitrices sont modifiées de façon significative sous anesthésie 1-2. Ces observations invité physiologistes à chercher des moyens d&#39;enregistrer à partir de neurones isolés, sans les effets contaminants de l&#39;anesthésie. Un résultat a été une préparation décérébrée, où le tronc cérébral a été complètement sectionné au niveau du mésencéphale 4. Les inconvénients de cette préparation sont une chirurgie redoutable, l&#39;élimination de descendre les projections de l&#39;prosencéphale, et une incapacité à utiliser la stimulation sensorielle d&#39;examiner les structures au-dessus du mésencéphale. Une stratégie différente a été d&#39;implanter des réseaux d&#39;électrodes de façon chronique à enregistrer à partir de neurones isolés et des grappes plusieurs unités alors que l&#39;animal est éveillé et / ou de se comporter 5,6 </sup&gt;. Ces techniques ne sont cependant pas compatible avec l&#39;injection de traceurs colorants après la première électrophysiologiquement caractériser une structure du cerveau. Pour éviter toute altération des propriétés de réponse de neurones avec des anesthésiques lors de l&#39;enregistrement des propriétés de réponse électrophysiologique de neurones isolés, nous avons adapté une technique utilisée depuis longtemps appuie-tête des chauves-souris à la souris 7-9 10-12. En utilisant cette méthode, nous sommes en mesure de procéder à des enregistrements électrophysiologiques sur plusieurs jours chez la souris non anesthésié. A la fin des sessions d&#39;enregistrement, on peut alors injecter un colorant à reconstruire les positions d&#39;électrodes et des sites d&#39;enregistrement ou d&#39;injecter un traceur afin que les voies vers et à partir des loci d&#39;enregistrement peut être déterminée. Cette méthode permet de bien isolées enregistrements d&#39;un seul neurone sur plusieurs jours sans que les anesthésiques utilisation.

La caractérisation électrophysiologique des réponses neuronales est important pour comprendre le fonctionnement du cerveau et pour guider la mise en place de colorants pour voie de traçage. Cependant, de nombreuses études sont réalisées chez des animaux anesthésiés. Pour comprendre le fonctionnement du cerveau sans anesthésie, nous avons développé une méthode pour enregistrer les propriétés de réponse de neurones et d&#39;injecter des colorants chez la souris éveillée.

Préparation d&#39;une souris Awake pour l&#39;enregistrement des réponses de neurones et l&#39;injection de traceurs

Il est bien connu que l'anesthésie modifie les propriétés de la réponse neuronale dans diverses régions du cerveau.13. Dans le système auditif, la réponse fondamentale...

L'objectif général de cette procédure est d'enregistrer les réponses de neurones individuels chez une souris éveillée. Cela est réalisé en anesthésiant tout d'abord la souris par inhalation d'isoflurane, en plaçant la souris dans un cadre stéréotaxique pour rongeur et en exposant le crâne. La deuxième étape consiste à localiser la région cérébrale d'intérêt à l'aide de coordonnées stéréotaxiques et à marquer cette région en vue d'une craniotomie ultérieure.Ensuite, un embout crânien sur mesure est fixé sur le crâne et l'embout est placé dans une barre de fixation attachée à un micromanipulateur de l'appareil stéréotaxique. La dernière étape consiste à réaliser une craniotomie afin de permettre l'insertion d'une électrode dans le cerveau. Une fois que la souris s'est remise de l'intervention chirurgicale, elle est immobilisée dans un bloc de mousse.Le poteau de fixation est remis en place dans la barre de montage et fixé à un appareil stéréotaxique sur mesure, permettant l'insertion d'une électrode micropipette dans le cerveau. Cette procédure permet l'isolement d'unités individuelles. Des réponses intenses aux stimuli peuvent être enregistrées à partir de la même structure cérébrale pendant plusieurs jours consécutifs, et les tracés peuvent être utilisés pour examiner les projections ascendantes ou descendantes vers des régions identifiées physiologiquement, sans affecter les réponses par l'usage d'anesthésiques.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que les propriétés de réponse des neurones ne sont pas influencées par les anesthésiques. Zachary Mako, étudiant diplômé de mon laboratoire, démontrera cette procédure. Pour préparer le dispositif de contention de la tête, commencez par assembler un embout crânien personnalisé en perçant un trou dans une tige en acier inoxydable de 15 millimètres (trois trente-deuxièmes de pouce). Insérez ensuite perpendiculairement dans le trou une goupille roulée en acier inoxydable de 20 millimètres.Pour former un filetage croisé, aléser une extrémité de la tige verticale afin d'accepter une vis numéro 1 72, comme illustré ici. Ensuite, préparer la barre de fixation. Ce composant d'appareillage se compose d'une barre allongée en laiton ou en aluminium d'environ 90 millimètres de longueur et de cinq à dix millimètres de largeur, ainsi que d'une barre plus courte de 15 millimètres de longueur fixée à l'extrémité de la barre longue selon un angle de 45 degrés.La barre plus courte présente une rainure découpée dans le bas et une rainure plus courte traversant la largeur ; insérez le poteau de fixation dans ces rainures de manière que la pièce transversale s'emboîte dans la rainure plus courte. Le bloc de fixation est composé de deux pièces en aluminium assemblées par des vis pour former un bloc d'environ 30 millimètres sur 30 millimètres sur 25 millimètres, avec une découpe permettant de maintenir la barre de fixation ; insérez la barre de fixation dans la découpe du bloc de fixation parallèlement à la surface de la table. Fixez le bloc de fixation à un micromanipulateur afin que la position du poteau de fixation puisse être précisément ajustée le long de la ligne médiane et d'une brima.Enfin, couper une tige en tungstène de 0,01 pouce de diamètre à environ cinq millimètres de longueur, avec environ un millimètre courbé à 45 degrés. Cette tige sert de broche de masse. Après avoir placé l'animal dans une chambre d'induction contenant 5 % de fluor, s'assurer que l'animal est complètement anesthésié en effectuant une pincée du orteil et en vérifiant l'absence de réaction.Une fois que la souris est complètement anesthésiée, placez-la dans le cadre stéréotaxique pour rongeur équipé d’un adaptateur pour souris, en insérant d’abord les dents dans l’orifice de la barre d’occlusion, puis serrez doucement la pince nasale jusqu’à ce qu’elle soit bien ajustée. Pour s’assurer que l’animal reste anesthésié, placez un masque facial fabriqué à partir d’un morceau de gant en latex sur le nez de la souris et maintenez un apport de 5 % d’isoflurane jusqu’à ce que la fréquence respiratoire atteigne environ un souffle par seconde.Après ce délai, réduire la concentration d'isoflurane à 1,5 à 2 %. Fixez ensuite la tête en insérant délicatement les barres auriculaires dans chaque conduit auditif. En prenant soin de ne pas percer le tympan, positionnez les barres auriculaires de manière qu'elles soient bien ajustées, sans pénétrer trop profondément dans les conduits auditifs. Placez un coussin chauffant en gel sous la souris.Appliquez ensuite délicatement un onguent ophtalmique pour éviter que les yeux ne s'assèchent. Utilisez un petit rasoir ou des ciseaux fins. Retirez les poils de l'espace situé entre les oreilles jusqu'aux yeux.Nettoyez et stérilisez maintenant le cuir chevelu avec une solution de chlorhexidine ou de Bétadine, suivie d'un rinçage à l'alcool répété trois fois. Pratiquez une incision le long de la ligne médiane, de l'arrière de la tête jusqu'aux yeux. Grattez l'endosté s'il est nécessaire jusqu'aux bords de l'incision à l'aide d'un scalpel.Retirer délicatement la musculature à l’arrière du cou avec une pince tout en laissant le muscle se détacher le long des gaines afin de minimiser les saignements. Appliquer un tampon en gel sous les tissus du cuir chevelu pour réduire l’humidité et empêcher la peau de glisser sur le crâne. Humidifier ensuite un applicateur en coton avec de l’alcool isopropylique et sécher la surface du crâne afin d’améliorer la visualisation des repères osseux.Une fois l'animal préparé, insérez une pointe fine, telle qu'une tige métallique aiguisée, dans le porte-électrode et fixez-la au micromanipulateur stéréotaxique. Déplacez la sonde en avant et en arrière entre le bgma et le Lambda, en veillant à ce que la coordonnée latéro-médiale de chaque position ne diffère pas de plus de 50 micromètres.Repositionnez délicatement la tête en utilisant les barres auriculaires selon les besoins. Vérifiez que la hauteur dorso-ventrale au niveau du Bgma et du Lambda ne diffère pas de plus de 50 microns. Ajustez la hauteur du serre-nez pour niveler l'inclinaison du crâne si nécessaire ; la hauteur des barres auriculaires pourrait également devoir être ajustée.Utilisez un atlas du cerveau de la souris pour identifier les coordonnées de la cible d'intérêt par rapport au bgma. Utilisez de l'encre de Chine pour marquer le crâne au-dessus de la cible où une craniotomie sera réalisée. Commencez par nettoyer le crâne en appliquant un gel de conditionnement dentaire sur la surface et en frottant pendant environ 10 secondes.Ensuite, rincer à l'eau et sécher complètement. Puis, appliquer l'apprêt adhésif pour le ciment dentaire sur la surface du crâne. À l'aide de l'application, utiliser ensuite un applicateur neuf pour répartir l'adhésif, puis polymériser l'adhésif avec un cycle d'une lampe à lumière UV.Identifier un emplacement situé distalement par rapport au site cible. Pour l'installation de la broche de mise à la terre, utiliser la pointe d'un scalpel miniature de taille 65 afin de percer soigneusement un petit trou dans le crâne. À ce stade, le trou doit être suffisamment large pour accueillir l'extrémité courte de la broche de mise à la terre.Insérez la broche de mise à la terre de manière qu'elle repose sur les méninges. Veillez à orienter la broche de sorte qu'elle pointe vers l'extérieur, éloignée du bgma et du site d'attachement du support de tête. Déplacez ensuite le micromanipulateur afin que le support de tête soit positionné au-dessus du bgma, en contact léger avec le crâne.La base du support pour la tête doit être posée à plat sur le crâne. Ensuite, utiliser des sondes de dissection pour appliquer une petite quantité de ciment dentaire autour du support pour la tête et de la broche de mise à la terre. Appuyer sur le ciment afin d'assurer un bon contact avec le crâne.Ensuite, polymériser à l'aide de trois à quatre cycles provenant d'un pistolet à lumière UV. Enfin, appliquer une deuxième couche de ciment afin d'épaissir la base autour du poteau de la tête et recouvrir les rainures du poteau de la tête, puis effectuer une polymérisation. Avant toute chose, localiser la marque de référence de la craniotomie, qui sera partiellement masquée par l'apprêt.Ensuite, utilisez un scalpel miniature à lame n°65 pour marquer un carré de trois millimètres sur trois millimètres autour de ce site. Appliquez une goutte de solution de lidocaïne afin de réduire la sensibilité. Effectuez maintenant plusieurs incisions sur chacun des côtés du carré, en prenant soin de ne pas couper l'os ni atteindre le cerveau.Une fois que le lambeau osseux devient lâche, utilisez la pointe du scalpel pour le soulever, en laissant intacte la dure-mère. Ensuite, recouvrez la zone de cire osseuse. Une fois la chirurgie terminée, éteignez l'isoflurane et libérez la souris du cadre stéréotaxique.Appliquer de la lidocaïne sur la peau exposée, puis appliquer une pommade néo-sporine, administrer une analgésie postopératoire selon les indications du vétérinaire, et replacer la souris dans sa cage d'origine. Après 24 heures, la souris peut être utilisée pour des enregistrements électrophysiologiques. Cette figure montre qu'une implantation réussie du support crânien permet à l'expérimentateur d'enregistrer des réponses unitaires simples et multiples chez une souris éveillée pendant plusieurs jours.Le système de contention permet d'obtenir des enregistrements électrophysiologiques stables de neurones uniques dans le cerveau. Une excellente isolation des unités simples et de fortes réponses aux stimuli peuvent être enregistrées à partir de la même structure cérébrale pendant plusieurs jours. Par exemple, dans le colliculus inférieur de la souris sur une période de deux jours, le panneau gauche montre les enregistrements obtenus le premier jour et le panneau droit le second jour, afin d'évaluer les projections descendantes du mésencéphale auditif vers le tronc cérébral auditif ; la dextrane biotinylée et l'amine, visualisées à l'aide de la Dino Bénadine comme chromogène, peuvent être injectées dans le colliculus inférieur de la souris, comme illustré ici après identification électrophysiologique des propriétés de réponse neuronale au site d'injection et après traitement des tissus.Le marquage antérograde dans le noyau cochléaire dorsal controlatéral peut être visualisé et représenté comme illustré ici. Des microphotographies à plus haute résolution peuvent également être obtenues afin d'observer les axones et terminaux fortement marqués. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'enregistrer les propriétés de réponse de neurones individuels et d'injecter des colorants ou traceurs pour des études neuroanatomiques chez une souris éveillée.Cette préparation élimine l'influence des anesthésiques sur les propriétés de réponse neuronale et permet d'effectuer des expériences sur plusieurs jours avec le même animal. La clé de la procédure consiste à s'assurer que le support crânien est solidement fixé au crâne et que la souris est bien immobilisée. Bien que cette vidéo ait illustré comment utiliser cette méthode pour enregistrer l'activité de neurones individuels du système auditif, d'autres régions du cerveau peuvent être étudiées à l'aide de cette technique.

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