Name: Imagerie de VIH-1 Enveloppe induite Synapse virologique et de signalisation sur bicouches lipidiques synthétiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Découvrez la formation de la synapse virologique induite par l'enveloppe du VIH-1 en utilisant la microscopie de fluorescence TIRF sur bicouches lipidiques synthétiques. Cette méthode permet de visualiser le recrutement de molécules de signalisation comme LCK.

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<ol><li>Bastiani, L., Laal, S., Kim, M., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+cell-dependent+alterations+in+envelope+components+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+virions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Host cell-dependent alterations in envelope components of human immunodeficiency virus type 1 virions.</a> J. Virol. 71, 3444-3450 (1997).</li>
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<li>Jolly, C., Mitar, I., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+an+intact+T-cell+actin+and+tubulin+cytoskeleton+for+efficient+assembly+and+spread+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Requirement for an intact T-cell actin and tubulin cytoskeleton for efficient assembly and spread of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 81, 5547-5560 (2007).</li>
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<li>Vasiliver-Shamis, G., Tuen, M., Wu, T., Starr, T., Cameron, T., Thomson, R., Kaur, G., Liu, J., Visciano, M., Li, H., Kumar, R., Ansari, R., Han, D., Cho, M., Dustin, M. L., Hioe, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+gp120+induces+a+stop+signal+and+virological+synapse+formation+in+noninfected+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120 induces a stop signal and virological synapse formation in noninfected CD4+ T cells.</a> J. Virol. 82, 9445-9457 (2008).</li>
<li>Zhu, P., Liu, J., Bess, J., Chertova, E., Lifson, J., Grise, H., Ofek, G., Taylor, K., Roux, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+three-dimensional+structure+of+AIDS+virus+envelope+spikes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distribution and three-dimensional structure of AIDS virus envelope spikes.</a> Nature. 441, 847-852 (2006).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent aucun conflit d&#39;intérêts.

Des études antérieures ont VS visualisée dans le système conjugué de cellule à cellule, mais ces études n&#39;ont pas de fournir des images de résolution suffisamment élevée pour visualiser les structures supramoléculaires à la synapse. Dans notre laboratoire, nous avons utilisé le verre soutenu par système bicouche plane pour représenter la surface des cellules infectées exprimant le gp120 de l&#39;enveloppe du virus et la molécule d&#39;adhésion cellulaire ICAM-1. En collaboration avec la microscopie TIRF, qui détecte des signaux de fluorescence dans les 100-200 nm de la surface de la bicouche avec un fort rapport signal sur bruit, nous étions en mesure de détecter la ségrégation supramoléculaire de la gp120 de l&#39;ICAM-1 à la VS. En outre, la méthode immunomarquage norme peut être appliquée au système bicouche et a été utilisé ici afin de détecter et de quantifier le recrutement spécifique de Lck actif, mais pas Fionie, à la zone de gp120-contact à VS 15. Par conséquent, la bicouche plane offre un système expérimental pour l&#39;imagerie haute résolution de l&#39;interface synapse dans un plan 2D par la FRBR microscopie, ainsi que les méthodes d&#39;éclairage à grand champ ou confocale. Cependant, le système a aussi ses limites que l&#39;ajustement de mobilité ligand, out-of-plan de flexion, et les fluctuations des membranes biologiques ne sont pas reproduites par les bicouches planes. En outre, il s&#39;agit d&#39;un système in vitro et a donc d&#39;autres limitations, telles que le manque de molécules membranaires d&#39;autres qui seraient présents sur une cellule infectée et de la machinerie du cytosquelette qui réglemente la mobilité moléculaire et la motilité cellulaire. En outre, la dynamique et la distribution des molécules, telles que trimères contre monomères de la gp120, ne peuvent pas être représentés physiologiquement sur la bicouche. Néanmoins, même avec ces limitations, ce système est encore très précieux pour l&#39;étude du virus-cellule ou cellule-cellule interactions, et ces méthodes peuvent servir de guide utile aux chercheurs qui cherchent des images haute résolution pour détecter organisation supramoléculaire qui n&#39;est pas perceptible dans le système conjugué de cellule à cellule conventionnelle.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Son étiqueté gp120 du VIH </td><td> Don de M. Cho </td><td></td><td> DH12 </td></tr><tr><td> Son étiqueté gp120 du VIH </td><td> Technologie immunitaire </td><td></td><td> Divers X4 ou tropisme R5 </td></tr><tr><td> HSA </td><td> Williams Medical Company </td><td> 521302 </td><td> L&#39;albumine sérique humaine 25% </td></tr><tr><td> Amicon Ultra Filtres centrifuges </td><td> Millipore </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel-30K </td></tr><tr><td> Lck lapin mAb </td><td> Signalisation cellulaire </td><td> 2787 </td><td></td></tr><tr><td> p-Lck lapin pAb </td><td> Santa Cruz Biotechnology Inc </td><td> Sc-101728 </td><td> Tyr 394 </td></tr><tr><td> Fyn lapin mAb </td><td> Millipore </td><td> 04-353 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 2 °; Ab </td><td> Molecular Probes </td><td> A11034 </td><td> De chèvre anti-IgG de lapin (H + L) </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Molecular Probes </td><td> Un-20000 </td><td> carboxylique ester succinimidylique </td></tr><tr><td> FCS2 Chambre </td><td> Bioptechs </td><td> 060319-2-03 </td><td></td></tr><tr><td> Microaqueduct diapositives </td><td> Bioptechs </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> 30mm ronde w / trous </td><td> Bioptechs </td><td> 1907-08-750 </td><td> 0.75mm d&#39;épaisseur </td></tr><tr><td> Rectangle Joint </td><td> Bioptechs </td><td> 1907-1422-250 </td><td> 14x24 0,25 d&#39;épaisseur </td></tr><tr><td> Tubes Tygon </td><td> Bioptechs </td><td> 20202275 </td><td> 1/16 &quot;(25ft) </td></tr><tr><td> Robinet à trois voies </td><td> BioRad </td><td> 7328103 </td><td></td></tr><tr><td> Deux voies Robinet </td><td> BioRad </td><td> 7328102 </td><td></td></tr><tr><td> Diapositive it I 0,2 Luer </td><td> Ibidi </td><td> 80168 </td><td></td></tr><tr><td> Couvrir verres </td><td> Ibidi </td><td> 10812 </td><td></td></tr><tr><td> Seringue de 1 ml </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> CHIENS-NTA </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 790404C </td><td></td></tr><tr><td> DOPC </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 850375C </td><td></td></tr><tr><td> Une lamelle en verre </td><td> Bioptechs </td><td> 40-1313-0319 </td><td> 40mm </td></tr><tr><td> Microscope TIRF </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> National Institutes of Health </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/~~V</a> </td></tr></tbody></table>

imagerie de vih-1 enveloppe induite synapse virologique et de signalisation sur bicouches lipidiques synthétiques

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Humaine de type virus de l&#39;immunodéficience 1 (VIH-1) infection survient le plus efficacement par l&#39;intermédiaire de cellules à 2,10,11 transmission de cellules. Cette cellule à cellule de transfert entre cellules CD4 + T comprend la formation d&#39;une synapse virologique (VS), qui est un F-actine cellulaire dépendante des cellules jonction formée lors de l&#39;engagement du VIH-1 enveloppe gp120 de la cellule infectée avec CD4 et le récepteur de chimiokine (CKR) CCR5 ou CXCR4 sur la cellule cible 8. En plus de la gp120 et ses récepteurs, des protéines membranaires autres, en particulier la molécule d&#39;adhésion LFA-1 et ses ligands, la famille ICAM, jouent un rôle dans la formation et la transmission du virus SV qu&#39;ils sont présents sur la surface des cellules infectées par un virus donneurs des cellules cibles et, ainsi que sur l&#39;enveloppe de VIH-1 virions 1,4,5,6,7,13. La formation VS s&#39;accompagne aussi d&#39;événements de signalisation intracellulaire qui sont transduits à la suite de la gp120-engrènement de ses récepteurs. En effet, nous avons récemment montré que les CD4 &lt;sup&gt; + d&#39;interaction des cellules T avec la gp120 induit le recrutement et la phosphorylation de molécules de signalisation associées à la signalosome TCR, y compris Lck, CD3ζ, ZAP70, LAT, SLP-76, ITK, et PLCγ 15. Dans cet article, nous présentons une méthode pour visualiser arrangement supramoléculaire et les événements de signalisation membrane proximal qui se déroulent lors de la formation VS. Nous profitons du verre soutenu par plane bi-couche du système comme un modèle réductionniste pour représenter la surface de cellules infectées portant l&#39;enveloppe virale gp120 et la molécule d&#39;adhésion cellulaire ICAM-1. Le protocole décrit les procédures générales pour la surveillance du VIH-1 gp120 induit VS assemblage et les événements d&#39;activation de signaux qui incluent i) bi-couche de préparation et d&#39;assemblage dans une cellule d&#39;écoulement, ii) l&#39;injection de cellules et immunofluorescence pour détecter des molécules de signalisation intracellulaires sur cellules en interaction par le VIH-1 gp120 d&#39;acquisition d&#39;image et ICAM-1 sur bi-couches, iii) par microscopie TIRF, unee iv) l&#39;analyse des données. Ce système génère des images à haute résolution de l&#39;interface VS-delà de celle obtenue avec le classique système de cellule-cellule, car elle permet la détection de groupes distincts de chaque composants moléculaires de VS long avec des molécules de signalisation spécifiques recrutés pour ces sous-domaines.

Cet article décrit une méthode pour visualiser la formation d&#39;une synapse enveloppe du VIH-1 induite par le verre virologique soutenu bicouches planaires par fluorescence à réflexion interne totale (TIRF) microscopie. La méthode peut également être combiné avec immunofluorescence pour détecter l&#39;activation et la redistribution des molécules de signalisation qui se produisent pendant le VIH-1 induite par l&#39;enveloppe formation de la synapse virologique.

Imagerie de VIH-1 Enveloppe induite Synapse virologique et de signalisation sur bicouches lipidiques synthétiques

L'infection par le virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) se produit le plus efficacement via une transmission de cellule à cellule2,10,11. Ce transfert de cellule à cellule entre ...

Cette méthode permet de créer des bicouches lipidiques qui imitent la surface d'une cellule infectée. Afin d'étudier la synapse virologique du VIH formée avec des lymphocytes T CD4 primaires humains, marquer d'abord les protéines d'intérêt avec des colorants fluorescents, puis former des bicouches lipidiques et laisser les cellules établir des synapses, fixer et colorer les cellules avec des anticorps fluorescents pour visualiser les molécules de signalisation. Ensuite, à l'aide de la microscopie par fluorescence en réflexion totale interne ou de la microscopie TIRF, acquérir des images des molécules de signalisation au sein des cellules en formation de synapse.Analyser les images de synapse pour délimiter la localisation des molécules de signalisation actives par rapport à la structure de la synapse virologique. Cette approche expérimentale peut indiquer si des protéines cellulaires telles que la protéine kinase spécifique des lymphocytes LCK sont recrutées au niveau de la synapse virologique du VIH. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en virologie et en immunologie du VIH, comme lesquels composants cellulaires sont impliqués dans la synapse virologique.Quel est le rôle dans la formation de la synapse et comment cela pourrait-il affecter le transfert du VIH d'une cellule à l'autre ? Ce système bier offre une vue en phase finale de la synapse, avec l'avantage de visualiser la synapse en haute résolution spatiale dans un seul plan. Les résultats illustrent clairement la structure synaptique, la formation du bier et l'assemblage de la cellule d'écoulement constituant un kinter, une forme d'art.Ici, nous démontrons la préparation du bilar sur la cellule d'écoulement bio-optique pour des études utilisant des virus infectieux ou des cellules infectées, ou lorsqu'il est nécessaire d'utiliser de petits volumes en raison de la limitation des réactifs. Des cellules d'écoulement jetables OB peuvent être utilisées avec la même procédure de préparation du bilar. Michael Kramer et moi allons démontrer une procédure pour marquer des protéines.Sélectionnez des colorants fluorescents tels que le LOR 4 88, qui se lient efficacement aux protéines, présentent une photostabilité suffisante pour l'imagerie en microscopie et correspondent aux longueurs d'onde d'excitation des lasers disponibles sur l'équipement microscopique. Commencez avec la protéine purifiée GP one 20 DH 12 marquée par une étiquette his. Échangez le tampon de la protéine contre du PBS stérile à l'aide d'une unité de filtration centrifuge dotée d'un seuil de coupure en poids moléculaire de 50 kilodaltons.Ensuite, vérifiez le pH et ajoutez du bicarbonate de sodium à pH 9,0 pour obtenir une concentration finale de 50 millimolaire en bicarbonate de sodium et un pH d'environ 8,5. Puis ajoutez un colorant fluorescent LOR 4 88 réactif moyen en excès molaire dix fois supérieur. Incubez ce mélange à l'abri de la lumière pendant 45 minutes à une heure.Poursuivez en éliminant l'excès de colorant à l'aide d'une unité de filtration centrifuge. Ajoutez du PBS stérile frais dans la colonne et continuez à laver la protéine du colorant libre. Ensuite, concentrez la protéine GP one 20 à environ un milligramme par millilitre.Mesurez la concentration de colorant fluorescent à 488 nanomètres. Déterminez également la concentration en protéines à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop, en utilisant le réglage pour les protéines et les marqueurs.Divisez les deux nombres pour déterminer l'intensité de fluorescence par molécule de protéine. Préparez une solution de piranha composée de 45 millilitres d'acide sulfurique et de 15 millilitres de peroxyde d'hydrogène à 30 % à l'aide de pinces en plastique. Immergez les lamelles pendant 15 minutes.Transférez les lamelles dans un bécher rempli d’eau purifiée PIKA. Lavez chaque lamelle sous un filet d’eau courante pendant deux minutes, une minute de chaque côté, puis placez-les sur un porte-lame pour les faire sécher. Procédez ensuite au montage des deux chambres optiques FCS comme décrit précédemment par Varona et al., 2008. Ensuite, captez et présentez le GP hiss un 20 à la surface du bicouche lipidique sans toucher la pointe au verre.Prélèvez cinq gouttes d'un microlitre de mélange de liposomes et déposez-les sur une lame micro-aqueduc afin de préparer cinq bicouches par cellule d'écoulement. Placez maintenant une lamelle sur les lipides. Ensuite, recouvrez l'anneau de rétention blanc avec une embase de serrage en acier inoxydable.Retournez l'appareil entier et scellez-le. Marquez ensuite l'emplacement des bicouches et incubez pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, fixez un tube muni d'un robinet à deux voies au tube de perfusion gauche.Remplir le tube relié à un robinet à trois voies avec de l'albumine sérique humaine à 1 % dans une solution saline tamponnée au HEPES, et vérifier que le montage ne contient aucune bulle. Relier ensuite ce tube au tube de perfusion droit et former un ménisque positif. Pousser doucement le tampon à travers la cellule d'écoulement pour bloquer le bicouche.Fixer une seringue d'un millilitre contenant 300 microlitres de caséine au chlorure de nickel micromolaire à l'entrée du robinet trois voies, puis pousser doucement le tampon à travers. Fermer les deux robinets avant de déconnecter la seringue. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante.Chargez maintenant 250 molécules de LOR 4 88 marquées par hiss et étiquetées GP un 20 par micron pour imiter la densité locale des agrégats présents à la surface de V un du VIH. Incubez pendant 30 minutes à l'obscurité à température ambiante, puis lavez par couches avec cinq millilitres de tampon H-B-S-H-S-A. Équilibrez la cellule d'écoulement à 37 degrés Celsius.À l’aide d’une seringue d’un millilitre, ajouter les lymphocytes T humains activés CD4 positifs dans 400 microlitres de solution d’albumine sérique humaine à 1 %, puis incuber pendant 45 minutes dans un incubateur à 37 degrés Celsius afin de permettre l’attachement des cellules par couche lipidique. Ensuite, pour fixer les cellules, ajouter du paraformaldéhyde à 2 %, puis incuber pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Laver trois fois avec un millilitre.Perméabiliser ensuite les cellules au PBS en injectant du Triton X-100 à 0,1 % pendant cinq minutes à température ambiante, après trois lavages d'un millilitre au PBS. Bloquer avec de la caséine contenant 5 % de sérum de chèvre pendant 25 minutes à température ambiante, puis laver trois fois au PBS. Ajouter ensuite l'anticorps primaire et 300 microlitres de tampon par chambre d'écoulement pendant 20 minutes à une heure.À température ambiante, après trois lavages au PBS, ajoutez l'anticorps secondaire marqué par un fluorochrome approprié dans le tampon. Dans l'expérience, l'échantillon contrôle par couche est traité uniquement avec l'anticorps secondaire afin de déterminer le niveau de signal non spécifique provenant de ce réactif. Incubez pendant 20 minutes à température ambiante, puis lavez trois fois avec un millilitre.Acquérir des images de tous les échantillons par réflexion totale interne en microscopie à fluorescence. Réaliser une analyse quantitative des images à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image, tel que ImageJ, dans l’onglet Analyser les mesures.Cocher les cases pour la surface et la valeur moyenne de gris. Sélectionner une région d'intérêt sur l'image qui soit un polygone ou une forme fermée tracée à main levée. Ensuite, sélectionner l'onglet analyser mesurer pour que le logiciel enregistre les données issues de cette mesure.Dans un tableau de résultats, configurez les mesures sur moyenne et surface, puis ouvrez les images pour une condition expérimentale pour chaque tracé cellulaire et mesurez la région d'intérêt ainsi que le tracé ; mesurez également une région de fond pour chaque condition expérimentale. Copiez les mesures et collez-les dans Excel. Une fois toutes les données recueillies, calculez l'intensité moyenne en unités arbitraires.Soustrayez l'intensité du fond de l'intensité moyenne, puis multipliez par la surface pour obtenir l'intensité intégrée de la protéine en unités arbitraires afin de mesurer l'activation et le recrutement des premières molécules de signalisation proximales à la membrane. En raison de l'interaction avec GP one 20 au niveau de la synapse virologique, des lymphocytes T primaires humains CD quatre positifs ont été introduits sur des bicouches portant G one 20 et ICAM one ; les cellules introduites sur des bicouches ne contenant que ICAM one ont servi de contrôle pour définir les niveaux basaux de signalisation. Après interaction des cellules avec des bicouches contenant GP one 20 et ICAM one, la protéine LCK a été recrutée à l'interface de la synapse virologique et colocalisée avec GP one 20.L'intensité moyenne de la LCK totale était plus élevée sur la bicouche contenant à la fois la GP un 20 et l'ICAM un que sur celle contenant uniquement l'ICAM un. Fait intéressant, les niveaux d'intensité intégrés étaient similaires. Pris ensemble.Ces données suggèrent que la LCK est redistribuée en un agrégat central. Après la liaison des cellules T CD4 positives à la GP120. Ici, les intensités moyennes et intégrées de la LCK phosphorylée sur la tyrosine 394, détectées par microscopie TURF, ont été imagées et quantifiées.Les résultats indiquent que la liaison de GP120 augmente la phosphorylation du résidu tyrosine 394 dans la boucle d'activation de LCK. En revanche, plus de Finn était présent dans la zone de contact des cellules sur des bicouches contenant uniquement ICAM-1 que sur des bicouches contenant à la fois GP120 et ICAM-1. Ainsi, Finn n'a pas été recruté au synapse virologique.Par conséquent, nous concluons que LCK et non Finn est la kinase active dans la synapse virologique induite par l'gp120 du VIH-1. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer des bilames chargés avec des protéines spécifiques, réaliser une coloration immunofluorescente sur les interactions entre cellules dans une chambre d'écoulement en utilisant la microscopie par réflexion totale interne, et effectuer une analyse de base. Ce système bilaminaire est également utile pour l'imagerie de cellules vivantes, où vous pouvez suivre la dynamique de la formation des synapses virologiques.En outre, les cellules peuvent être transfectées avec des protéines marquées par un fluorochrome, telles que les GFPs Z 70. Cela permet de suivre en temps réel les changements de distribution et le recrutement de molécules de signalisation vers la synapse.

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Soutenu bicouches planaires sont des outils puissants qui peuvent être utilisés pour modéliser les interactions moléculaires dans une synapse immunologique. Ici, nous montrons des méthodes pour l'ancrage des protéines d'adhésion cellulaire connue pour moduler la formation des synapses au feuillet supérieur de la bilyer lipides et de visualiser la formation des synapses en microscopie TIRF.

Soutenu bicouches planaires pour la formation des synapses immunologiques Etude de et Kinapse

Le protocole décrit une approche à haut débit pour déterminer les structures des protéines membranaires par cryo-tomographie électronique et traitement d'images 3D. Il couvre les détails de la préparation des échantillons, collecte, traitement et interprétation des données, et se termine par la production d'une cible représentant de l'approche, le VIH-1 glycoprotéine d'enveloppe. Ces procédures de calcul sont conçues d'une façon qui permet aux chercheurs et aux étudiants de travailler à...

Détermination des structures moléculaires des glycoprotéines d&#39;enveloppe du VIH en utilisant microscopie cryo-électronique et automatisée Sous-tomogramme moyenne

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Visualizing Viral Structural Protein Assembly on Giant Unilamellar Vesicle Membranes

Cette vidéo présente une technique permettant de visualiser la formation de la synapse immunologique dans les cellules tueuses naturelles (NK) sur une bicouche lipidique supportée (SLB). Le SLB est d’abord marqué avec un ligand du récepteur d’activation des cellules NK marqué au fluorophore, suivi d’une incubation avec des cellules NK. Par la suite, les cellules sont colorées pour des granules lytiques d’actine polymérisés et de perforine positive. Cette approche permet de visualiser la...

Imagerie à super-résolution de la formation de synapses immunologiques de cellules NK sur une bicouche lipidique supportée

Cette vidéo présente une technique in vitro pour étudier la formation de synapses immunitaires entre les lymphocytes T humains primaires et les bicouches lipidiques supportées (SLB). Les protéines de surface des lymphocytes T interagissent avec les ligands respectifs immobilisés sur la SLB pour former une synapse immunitaire, suivie du mouvement des granules lytiques vers la synapse, qui est visualisé à l’aide de la microscopie à fluorescence.

Une technique in vitro pour étudier l’interaction des lymphocytes T avec des bicouches lipidiques planes soutenues

Cette vidéo montre l’imagerie de cellules vivantes de la topologie des synapses immunologiques, en étudiant les interactions entre les lymphocytes T et les cellules épithéliales porteuses d’antigènes fluorescents. La microscopie à fluorescence révèle un déplacement du cytoplasme rouge et des anneaux membranaires jaunes dans les cellules endothéliales, indiquant la formation de synapses immunologiques.

Évaluation de la topologie immunologique des synapses par l’imagerie de cellules vivantes

Comprendre les conformations des antigènes de surface viraux est nécessaire pour évaluer la neutralisation des anticorps et guider la conception d’immunogènes vaccinaux efficaces. Nous décrivons ici un test ELISA basé sur des cellules qui permet d’étudier la reconnaissance du VIH-1 trimérique Env exprimé à la surface des cellules transfectées par des anticorps anti-Env spécifiques.

Évaluation de conformation du VIH-1 trimère glycoprotéines d&#39;enveloppe l&#39;aide d&#39;un base de cellules test ELISA

Nous décrivons ici une combinaison de la technique de bicouche lipidique soutenue par du verre pour former des synapses immunologiques avec la technique d’imagerie à super-résolution de la microscopie à déplétion par émission stimulée (STED). L’objectif de ce protocole est de fournir aux utilisateurs les instructions nécessaires pour mener à bien ces deux techniques.

Super-résolution de l&#39;imagerie cellulaire Synapse immunologique Natural Killer sur un verre soutenu par Planar lipidique en deux couches

L’immunité adaptative est contrôlée par des 'synapses immunologiques' dynamiques formées entre les lymphocytes T et les cellules présentatrices d’antigènes. Ce protocole décrit des méthodes d’étude des cellules endothéliales à la fois en tant qu’APC physiologiques sous-étudiées et en tant que nouveau type de « modèle d’APC cellulaire planaire ».

Une cellule endothéliale Planar Modèle for Imaging Dynamics Synapse immunologique

Nous illustrons ici un essai de liaison membranaire in vitro dans lequel les interactions entre le Gag du VIH-1 et les membranes lipidiques sont analysées visuellement à l’aide de Gag marqué YFP synthétisé dans un système de traduction in vitro basé sur des germes de blé et de GUVs préparés par une technique d’électroformation.

Visualisation du VIH-1 Gag Reliure Giant unilamellaires vésiculaires (GUV) Membranes

Ce protocole image à la fois la formation de synapse immunologique et le trafic sécréteur polarisé suivant vers la synapse immunologique. Des conjugués cellulaires ont été formés entre une cellule Raji à impulsion de superantigène (agissant comme cellule de présentation d'antigène) et un clone de Jurkat (agissant comme lymphocyte T d'aide d'effecteur).

Imagerie de la synapse immunologique humaine

Découvrez la formation de la synapse virologique induite par l'enveloppe du VIH-1 en utilisant la microscopie de fluorescence TIRF sur bicouches lipidiques synthétiques. Cette méthode permet de visualiser le recrutement de molécules de signalisation comme LCK.

Imagerie de VIH-1 Enveloppe induite Synapse virologique et de signalisation sur bicouches lipidiques synthétiques

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