Name: Cellules endothéliales co-culture de maturation de la médiation de lhomme les cellules souches embryonnaires à des cellules productrices dinsuline du pancréas dans une approche différenciation dirigée (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Découvrez la différenciation multi-étapes des cellules souches embryonnaires humaines en cellules productrices d'insuline via co-culture avec des cellules endothéliales. Cette méthode améliore significativement la maturation et le rendement cellulaire.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous reconnaissons le soutien de prix NIH Innovateur New DP2 116520 et ORAU Ralph Powe junior Prix Amélioration de la Faculté.

1. L&#39;entretien des cellules <ol><li> CSEh H1 (WiCell) ont été maintenues sur CSEh qualifiés Matrigel puits revêtus avec mTeSR1 médias, avec les médias changent tous les jours. Les puits ont été revêtus par une solution diluée matrigel, préparée par addition de 300 ul de matrigel CSEh dans 25 ml de DMEM: F12. 1 ml de cette solution matrigel a été ajouté à chaque puits d&#39;une plaque de six puits, ou 400 pi ajouté à chaque puits d&#39;une plaque 12 puits et on laisse manteau pendant 1 heure à température ambiante. Les cellules ont été repiquées au mécaniquement un facteur de division de 1:4 en grattant colonies fois qu&#39;ils ont atteint entre 1 et 1,5 mm de diamètre. </li><li> RHMVEC (technologies CVE) a été maintenue dans MCDB-131 médias avec les médias changent tous les jours. Les cellules ont été divisés par trypsinisation fois 80% de confluence a été atteint à un rapport de division de 1:3. Les cellules endothéliales entre les passages 3 et 7 ont été utilisés pour cette étude. </li></ol> 2. Préparation des solutions stock <ol><li> Activine A a été reconstitué à 50 ug / ml dans P stérileBS contenant 0,1% de sérum albumine bovine. La solution a été aliquotés et conservés à -20 ° C. </li><li> FEM a été reconstitué à 500 ug / ml dans l&#39;acide acétique stérile de 10 mM. La solution a été aliquotés et conservés à -20 ° C. </li><li> L&#39;insuline a été reconstitué à 10 mg / ml en ajoutant acidifié H 2 O (pH ≤ 2), préparé par addition de 0,1 ml d&#39;acide acétique glacial à 10 ml d&#39;eau. </li><li> DAPT a été reconstitué dans du DMSO à 18 mg / ml. Il a en outre été diluée à 300 uM de concentration dans un milieu DMEM: F12, aliquotés et conservés à -20 ° C. </li><li> KAAD-cyclopamine a été reconstitué dans du DMSO à 5mg/ml. Il a également été dilué à 2 uM de concentration dans un milieu DMEM: F12, aliquotés et conservés à -20 ° C. </li><li> All-trans rétinoïque a été reconstitué à 2,7 mg / ml dans de l&#39;éthanol à 95%. Il a en outre été dilués à la concentration 2 mM dans du DMEM: F12, aliquotés et conservés à -80 ° C. </li></ol> 3. Endoderme définitif (DE) et les cellules progénitrices du pancréas (PP) à induction <ol><li> Une fois hColonies ESC atteint entre 1 et 1,5 mm de diamètre, l&#39;induction DE été effectuée par addition du DMEM: F12 supplémenté avec B27, 0,2% de BSA, 100 ng / ml et une activine A wortmannine uM pendant 4 jours (jour 0-jour 4) avec des milieux changent tous les jours. </li><li> Après l&#39;induction DE était complète, l&#39;induction progénitrices du pancréas a été induite en changeant les médias pour DMEM: F12 supplémenté avec B27, 0,2% de BSA et KAAD-cyclopamine à 0,2 uM de concentration pendant 24 heures (Jour 4 Jour 5). </li><li> Après 24 heures les médias a été changé pour DMEM: F12 supplémenté avec B27, 0,2% de BSA, KAAD-cyclopamine à concentration de 0,2 uM et acide tout-trans rétinoïque une concentration de 2 uM pendant 3 jours avec les médias changent tous les jours (Jour 5 Jour 8) . </li></ol> 4. La maturation du pancréas <ol><li> Après l&#39;induction de PP, tous les groupes ont été modifiées pour les milieux de maturation composé de DMEM: F12 supplémenté avec B27, 0,2% de BSA, 10 mM Nicotinamide, 25 pg / ml d&#39;insuline, 30 nM Na 2 SeO 3 pg et 50 / ml de transferrine pour 2 days avec les médias changent tous les jours (Jour 8 Jour 10). </li><li> Après 2 jours dans un milieu de maturation, l&#39;étape de maturation finale est effectuée en parallèle en utilisant plusieurs conditions différentes pour effectuer des comparaisons. Différenciation a été induite dans les conditions suivantes: (i) à l&#39;aide cran inhibiteur de DAPT (ii) à l&#39;aide de co-culture des médias seulement, sans les cellules endothéliales que le contrôle et (iii) à l&#39;aide de contact co-culture avec des cellules RHMVEC. Les cellules ont été maintenues dans les médias DAPT ou de co-culture pendant une semaine (Jour 10-Jour 17) avec les médias changent tous les jours. <ol><li> Médias DAPT a été préparé par les milieux de maturation complétant avec 30 uM DAPT. Les cellules de ces groupes ont d&#39;abord été exposée à compléter MCDB131 pendant 24 heures, puis exposée aux médias DAPT pendant 6 jours (jour 11 jours 17). </li><li> Co-culture multimédia a été préparé par complétant MCDB 131-support avec B27, 0,2% de BSA, 10 mM de nicotinamide, 10 ng / ml EGF, 1 pg / ml d&#39;hydrocortisone, 10 mg EndoGro, 90 pg / ml d&#39;héparine. Pour la condition contrôle des médias les cellules différenciées ont été exposésà MCDB-131 milieu complet pendant 24 heures (jour 10-Day 11), après quoi les médias a été changé à la co-culture des médias pendant 6 jours (jour 11 jours 17) (pas de cellules endothéliales). </li><li> En cas de contact co-culture l&#39;état, un million de RHMVEC a été ajouté à des cellules différenciées dans complètes MCDB-131 médias (technologies VEC) pour 24 heures (jour 10-Jour 11) pour permettre la fixation. Après les médias 24 heures a été changé à la co-culture des médias pendant 6 jours (jour 11 jours 17) avec les médias changent tous les jours. </li></ol></li></ol> 5. qRT-PCR Analyse <ol><li> À la fin de chaque étape de la différenciation (endoderme; progénitrices du pancréas; îlot maturité) ont été lysées et l&#39;ARN a été extrait en utilisant l&#39;ARN NucleoSpin kit d&#39;extraction II selon les instructions du fabricant. </li><li> ARN de qualité a été analysée en vérifiant absorbance ARN à 260 nm et 280 nm, suivi par la quantification d&#39;ARN en utilisant un spectrophotomètre SmartSpec plus. </li><li> La transcription inverse a été réalisée à l&#39;aide ImProm II k transcription inverseil selon les instructions du fabricant. Toutes les réactions ont été réalisées avec 100 ng d&#39;ARN. </li><li> qRT-PCR a été réalisée en utilisant le système de Mx3005P QPCR (Agilent) et Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix selon les instructions du fabricant. Les amorces utilisées sont énumérées dans le tableau 1. L&#39;étape d&#39;initialisation a été effectuée à 50 ° C pendant 2 minutes, suivie par 95 ° C pendant 10 minutes. 50 cycles d&#39;amplification ont été réalisées comme suit: 95 ° C pendant 30 secondes, 54 ° C pendant 30 secondes et 72 ° C pendant 1 minute. </li><li> Changement pli de l&#39;expression des ARNm cible sur des cellules indifférenciées a été calculée à partir de valeurs de CT en utilisant les formules suivantes: ΔCT (Marker i) = CT (Marker i) - CT (GAPDH) Δ ΔCT (Marker i) = ΔCT (Marker i) (Exemple) - ΔCT (Marker i) (cellules indifférenciées) Expression relative (Marker i) = 2-ΔΔCT(Marqueur de i) </li></ol> 6. Immunocytochimie <ol><li> À la fin de chaque étape de la différenciation (endoderme; progénitrices du pancréas; îlot mature) cellules ont été fixées dans du formol à 4% pendant 15 minutes à température ambiante. </li><li> Cellules ont été perméabilisées fixes en utilisant 0,25% de Triton X-100 (TX) pendant 15 minutes. </li><li> Non-spécifique de coloration a été bloquée par une incubation dans le sérum âne de 10% en 0,05% TX pendant 30 minutes. </li><li> D&#39;incubation d&#39;anticorps primaire a été réalisée pendant une nuit à 4 ° C dans un tampon de blocage une dilution d&#39;anticorps recommandée (voir tableau 1). </li><li> Les cellules ont été lavées avec 0,05% de TX trois fois pendant 5 minutes. </li><li> D&#39;incubation d&#39;anticorps secondaire a été effectuée pendant une heure à température ambiante dans l&#39;obscurité avec des anticorps appropriés dilués dans un tampon de blocage. </li><li> Les cellules ont été lavées avec 0,05% de TX trois fois pendant 5 minutes. </li><li> Coloration nucléaire a été réalisée par incubation avec Hoescht tache au 1:1000 dilution en PBSpendant 5 minutes, suivie de 3 lavages avec du PBS. </li><li> Cellules fixées et colorées ont été imagées par Olympus IX81 microscope inversé et Metamorph logiciel d&#39;imagerie. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs Ajout de l&#39;activine A et Wortmannin à CSEh indifférenciées pendant 4 jours induit endoderme définitif tel que confirmé par qRT-PCR analyse des marqueurs DE Sox17, CXCR4, et Foxa2 et immunomarquage pour Sox17 comme illustré à la figure 2. Différenciation de cellules souches pancréatiques après l&#39;addition d&#39;acide rétinoïque et cyclopamine a été confirmée par qRT-PCR de marqueurs progénitrices pancréatiques et immunocoloration de PDX1 comme illustré à la figure 3. Au stade final de différenciation, contactez la co-culture avec des cellules RHMVEC fortement incités régulation à la hausse de l&#39;expression d&#39;insuline dans les CSEh dérivées de cellules souches pancréatiques. L&#39;efficacité de la différenciation induite co-culture a été analysé par la coopérationmparing avec la condition de contrôle en utilisant DAPT. DAPT a été utilisé comme un contrôle positif, car il est actuellement l&#39;une des méthodes les plus couramment utilisés pour parvenir à la maturation du pancréas. Depuis la co-culture a été effectuée dans un milieu modifiés complétées par des facteurs de soutien des cellules endothéliales, un contrôle supplémentaire a été réalisée avec les médias en l&#39;absence de cellules endothéliales afin de vérifier l&#39;effet des médias sur la différenciation. Les détails de cette analyse sont présentés dans la figure 4. <img alt="Figure 1." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig1.jpg" /> Figure 1. Multi-étape du protocole de différenciation des CSEh en cellules productrices d&#39;insuline exprimant. <img alt="Figure 2." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig2.jpg" /> Figure 2. Induction endoderme définitif de cellules souches embryonnaires humaines. A) qRT-PCR de marqueurs dans les cellules représentatives DE CSEh exposés à l&#39;activine A et Wortmannin pendant 4 jours. Résultats ar<html> e normalisé par rapport à CSEh indifférenciée. B) Sox17 coloration (vert) et DAPI (bleu) montrent une expression nucléaire de Sox17. La barre d&#39;échelle: 50 um. <img alt="Figure 3." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig3.jpg" /> Figure 3. Induction progénitrices du pancréas de la cellule souche embryonnaire de cellules dérivées endoderme. A) qRT-PCR de marqueurs dans les cellules pancréatiques début de CSEh dérivées endoderme exposés à l&#39;acide rétinoïque et cyclopamine pendant 4 jours après l&#39;induction DE. Les résultats normalisés par rapport à CSEh indifférenciée. B) PDX1 coloration (violette) et DAPI (bleu) montrent une expression nucléaire de PDX1. La barre d&#39;échelle: 50 um. &quot;&gt; <img alt="Figure 4." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig4.jpg" /> Figure 4. Stade de maturation du pancréas A) qRT-PCR analyse des hormones pancréatiques dans les CSEh après la maturation du pancréas en utilisant DAPT, contacter les médias de co-culture ou de co-culture (contrôle). Les résultats normalisés par rapport à CSEh indifférenciée. p valeurs obtenues par test t de Student. B) La co-culture avec Dil-Ac-LDL marqué RHMVEC (Rouge) montrent les régions où EC attachent à la plaque, si il ya des espaces vides (en haut), RHMVEC autre peut être trouvée en contact direct avec la différenciation ESC (en bas). C) C-peptide (vert) de coloration pour des cellules différenciées en utilisant la méthode de co-culture. La barre d&#39;échelle: 12,5 um (Haut) et 50 um (Bas) D) Immunomarquage de RHMVEC ne démontre aucune expression de l&#39;insuline dans le RHMVEC. <table border="1"><tbody><tr><td> Marqueur </td><td> Primer1 (5 &#39;à 3&#39;) &lt;/ Td&gt; <td> Primer2 (5 &#39;à 3&#39;) </td><td> Réf </td></tr><tr><td> Sox17 </td><td> CTCTGCCTCCTCCACGAA </td><td> CAGAATCCAGACCTGCACAA </td><td> 12 </td></tr><tr><td> CXCR4 </td><td> CACCGCATCTGGAGAACCA </td><td> GCCCATTTCCTCGGTGTAGTT </td><td> 4 </td></tr><tr><td> FOXA2 </td><td> GGAGCGGTGAAGATGGAA </td><td> TACGTGTTCATGCCGTTCAT </td><td> 12 </td></tr><tr><td> PDX1 </td><td> AAGTCTACCAAAGCTCACGCG </td><td> GTAGGCGCCGCCTGC </td><td> 4 </td></tr><tr><td> PTF1 </td><td> CATAGAGAACGAAACCACCCTTTGAG </td><td> GCACGGAGTTTCCTGGACAGAGTTC </td><td> 12 </td></tr><tr><td> HLXB9 </td><td> CACCGCGGGCATGATC </td><td> ACTTCCCCAGGAGGTTCGA </td><td> 4 </td></tr><tr><td> HNF6 </td><td> TGTGGAAGTGGCTGCAGGA </td><td> TGTGAAGACCAACCTGGGCT </td><td> 5 </td></tr><tr><td> PAX6 </td><td> CGAATTCTGCAGGTGTCCAA </td><td> ACAGACCCCCTCGGACAGTAAT </td><td> 5 </td></tr><tr><td> NKX6.1 </td><td> AGACCCACTTTTTCCGGACA </td><td> CCAACGAATAGGCCAAACGA </td><td> 5 </td></tr><tr><td> ISL1 </td><td> GATCTATGTCACCTCGCAAGG </td><td> TACAACCACCATTTCACTG </td><td> 12 </td></tr><tr><td> GLUCAGON </td><td> AGGCAGACCCACTCAGTGA </td><td> AACAATGGCGACCTCTTCTG </td><td> 4 </td></tr><tr><td> INSULINE </td><td> AAGAGGCCATCAAGCAGATCA </td><td> CAGGAGGCGCATCCACA </td><td> 12 </td></tr></tbody></table> Primaires Tableau 1. Utilisé pour des réactions qPCR.

<ol><li>De Vos, J., Assou, S., Tondeur, S., Dijon, M., Hamamah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Les+cellules+souches+embryonnaires+humaines+%3A+de+la+transgression+de+l%27embryon+humain+%C3%A1+la+m%C3%A9decine+r%C3%A9g%C3%A9n%C3%A9ratrice+de+demain%5BTitle%5D)+AND+%22Gyn%C3%A9cologie+Obst%C3%A9trique+%26+Fertilit%C3%A9%22%5BJournal%5D)">Les cellules souches embryonnaires humaines : de la transgression de l'embryon humain á la médecine régénératrice de demain.</a> Gynécologie Obstétrique & Fertilité. 37, 620-626 (2009).</li>
<li>Murtaugh, L. C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes%2C+Signals%2C+and+Lineages+in+Pancreas+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genes, Signals, and Lineages in Pancreas Development.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).</li>
<li>Kubo, A., Shinozaki, K., Shannon, J. M., Kouskoff, V., Kennedy, M., Woo, S., Fehling, H. J., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+definitive+endoderm+from+embryonic+stem+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture.</a> Development. 131, 1651-1662 (2004).</li>
<li>D'Amour, K. A., Bang, A. G., Eliazer, S., Kelly, O. G., Agulnick, A. D., Smart, N. G., Moorman, M. A., Kroon, E., Carpenter, M. K., Baetge, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotech. 24, 1392-1401 (2006).</li>
<li>Zhang, D., Jiang, W., Liu, M., Sui, X., Yin, X., Chen, S., Shi, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+differentiation+of+human+ES+cells+and+iPS+cells+into+mature+pancreatic+insulin-producing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulin-producing cells.</a> Cell Res. 19, 429-438 (2009).</li>
<li>Basma, H., Soto-Gutiérrez, A., Yannam, G. R., Liu, L., Ito, R., Yamamoto, T., Ellis, E., Carson, S. D., Sato, S., Chen, Y., Muirhead, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+Transplantation+of+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Hepatocytes.</a> Gastroenterology. 136, 990-999 (2009).</li>
<li>Phillips, B. W., Hentze, H., Rust, W. L., Chen, Q. -P., Chipperfield, H., Tan, E. -K., Abraham, S., Sadasivam, A., Soong, P. L., Wang, S. T., Lim, R., Sun, W., Colman, A., Dunn, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Differentiation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+into+the+Pancreatic+Endocrine+Lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Directed Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into the Pancreatic Endocrine Lineage.</a> Stem Cells and Development. 16, 561-578 (2007).</li>
<li>Kim, S. K., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+development+is+promoted+by+cyclopamine%2C+a+Hedgehog+signaling+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pancreas development is promoted by cyclopamine, a Hedgehog signaling inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 13036-13041 (1998).</li>
<li>Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+development+of+the+islets+of+Langerhans%3A+implications+for+the+treatment+of+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Growth and development of the islets of Langerhans: implications for the treatment of diabetes mellitus.</a> Current Opinion in Pharmacology. 1, 641-649 (2001).</li>
<li>Nikolova, G., Jabs, N., Konstantinova, I., Domogatskaya, A., Tryggvason, K., Sorokin, L., Fässler, R., Gu, G., Gerber, H. -P., Ferrara, N., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vascular+Basement+Membrane%3A+A+Niche+for+Insulin+Gene+Expression+and+%5Bbeta%5D%3E+Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The Vascular Basement Membrane: A Niche for Insulin Gene Expression and [beta]> Cell Proliferation.</a> Developmental Cell. 10, 397-405 (2006).</li>
<li>Yoshitomi, H., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+interactions+initiate+dorsal+pancreas+development+by+selectively+inducing+the+transcription+factor+Ptf1a%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell interactions initiate dorsal pancreas development by selectively inducing the transcription factor Ptf1a.</a> Development. 131, 807-817 (2004).</li>
<li>Osafune, K., Caron, L., Borowiak, M., Martinez, R. J., Fitz-Gerald, C. S., Sato, Y., Cowan, C. A., Chien, K. R., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marked+differences+in+differentiation+propensity+among+human+embryonic+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Marked differences in differentiation propensity among human embryonic stem cell lines.</a> Nat. Biotech. 26, 313-315 (2008).</li>
<li>Banerjee, I., Sharma, N., Yarmush, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+co-culture+on+pancreatic+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Impact of co-culture on pancreatic differentiation of embryonic stem cells.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. 5, 313-323 (2010).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Au cours du développement du pancréas, de différenciation des cellules pancréatiques sont en étroite proximité avec les cellules endothéliales de l&#39;aorte; outre, les îlots pancréatiques sont densément vascularisé de promouvoir l&#39;échange rapide de glucose dans le sang et les hormones des îlots de Langerhans. Compte tenu de ces faits, il n&#39;est pas surprenant que les cellules endothéliales jouent un rôle important dans le processus d&#39;organogenèse du pancréas. Bien que l&#39;importance des cellules endothéli...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Les concentrations </td></tr><tr><td> mTeSR1 (avec supplément) </td><td> Technologies des cellules souches </td><td> 5850 </td><td></td></tr><tr><td> CSEh qualifiée matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 354277 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM: F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11330-032 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB-131 </td><td> Invitrogen </td><td> 10372019 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB-131 (complet) </td><td> Technologies VEC </td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td> B27 Supplément </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td><td></td></tr><tr><td> Activine A </td><td> R &amp; D </td><td> <a href="http://www.rndsystems.com/pdf/338-ac.pdf">338-AC</a> </td><td> 100ng/ml </td></tr><tr><td> Wortmannin </td><td> Invitrogen </td><td> W3144 </td><td> 1 uM </td></tr><tr><td> KAAD-Cyclopamie </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4116 </td><td> 0,2 um </td></tr><tr><td> Acide tout-trans rétinoïque </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R2625 </td><td> 2 pm </td></tr><tr><td> DAPT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5942 </td><td> 30 microns </td></tr><tr><td> Nicotinamide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N0636 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Sélénite de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td><td> 30 nM </td></tr><tr><td> Insuline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I1882 </td><td> 25 pg / ml </td></tr><tr><td> La transferrine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8158 </td><td> 50 pg / ml </td></tr><tr><td> EGF </td><td> R &amp; D </td><td> <a href="http://www.rndsystems.com/pdf/236-eg.pdf">236-EG</a> </td><td> 10ng/ml </td></tr><tr><td> EndoGro </td><td> Technologies VEC </td><td> ENDOGRO </td><td> 10mg </td></tr><tr><td> Héparine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> 90μg/ml </td></tr><tr><td> Hydrocortisone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H0888 </td><td> 1μg/ml </td></tr><tr><td> NucleoSpin II de l&#39;ARN </td><td> Macherey Nagel </td><td> 740955 </td><td></td></tr><tr><td> ImProm II Système de transcription inverse </td><td> Promega </td><td> A3800 </td><td></td></tr><tr><td> Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix </td><td> Straragene </td><td> 600548 </td><td></td></tr><tr><td> Sox17 polyclonal de chèvre IgG </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-17355 </td><td> 1/500 </td></tr><tr><td> PDX1 polyclonal de chèvre IgG </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-14662 </td><td> 1/500 </td></tr><tr><td> C-Peptide polyclonal de lapin </td><td> Signalisation cellulaire </td><td> 4593 </td><td> 1/500 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 d&#39;âne anti-IgG de lapin </td><td> Invitrogen </td><td> Un-21206 </td><td> 1/1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 d&#39;âne anti-IgG de chèvre </td><td> Invitrogen </td><td> Un-21447 </td><td> 1/1000 </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Réactifs et kits.

cellules endothéliales co-culture de maturation de la médiation de l&#39;homme les cellules souches embryonnaires à des cellules productrices d&#39;insuline du pancréas dans une approche différenciation dirigée

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

Les cellules souches embryonnaires (ESC) ont deux caractéristiques principales: elles peuvent être indéfiniment propagées in vitro dans un état ​​indifférencié et elles sont pluripotentes, ayant ainsi le potentiel de se différencier en plusieurs lignées. Ces propriétés font CES extrêmement attractif pour la thérapie cellulaire à base et les applications de traitement de régénération 1. Toutefois, pour son plein potentiel à réaliser les cellules doivent être différenciées en phénotypes matures et fonctionnelles, ce qui est une tâche ardue. Une approche prometteuse dans l&#39;induction de la différenciation cellulaire est à suivre de près imiter le chemin de l&#39;organogenèse dans le cadre in vitro. Le développement du pancréas est connu pour se produire dans des stades spécifiques 2, à commencer par l&#39;endoderme, qui peut se développer dans plusieurs organes, y compris le foie et le pancréas. L&#39;induction endoderme peut être obtenue par modulation de la voie nodale par addition de l&#39;activine A 3 en combinaison avec plusieurs facteurs de croissance 4-7 </sup&gt;. Cellules endodermiques définitives sont alors soumis à l&#39;engagement du pancréas par inhibition de l&#39;inhibition Sonic Hedgehog, qui peut être obtenu in vitro par addition d&#39;Cyclopamine 8. La maturation du pancréas est médiée par plusieurs événements parallèles dont l&#39;inhibition de la signalisation Notch; l&#39;agrégation des progéniteurs pancréatiques en 3-dimensionnelles grappes; induction de la vascularisation; pour n&#39;en nommer que quelques-uns. De loin le plus de succès dans la maturation in vitro de l&#39;ESC dérivés des cellules progénitrices du pancréas ont été atteints par l&#39;inhibition de la signalisation Notch par la supplémentation DAPT 9. Malgré son succès, il en résulte un faible rendement de l&#39;phénotype mature avec des fonctionnalités réduites. Une zone moins étudié est l&#39;effet de signalisation des cellules endothéliales dans la maturation du pancréas, ce qui est de plus en plus apprécié comme un facteur important qui contribue à la maturation in vivo des îlots pancréatiques 10,11. L&#39;étude actuelle explore un tel effet de endothelial de signalisation cellulaire dans la maturation de l&#39;homme ESC dérivés des cellules progénitrices pancréatiques productrices d&#39;insuline dans l&#39;îlot des cellules semblables à. Nous rapportons un protocole multi-stade de différenciation dirigée où les CES de l&#39;homme sont d&#39;abord induite par l&#39;activine vers l&#39;endoderme A avec l&#39;inhibition de la voie de la PI3K. Spécification de cellules pancréatiques endodermiques est réalisée par l&#39;inhibition de la signalisation par Sonic Hedgehog cyclopamine avec l&#39;induction rétinoïde par addition d&#39;acide rétinoïque. La dernière étape de maturation est induite par la signalisation cellulaire endothéliale réalisée par une configuration co-culture. Alors que plusieurs cellules endothéliales ont été testés dans la co-culture, ici, nous présentons nos données avec des cellules de rat cardiaques microvasculaires endothéliales (RHMVEC), principalement pour la facilité de l&#39;analyse.

La présente étude décrit une approche différenciation dirigée dans l&#39;induction de la différenciation du pancréas de cellules souches embryonnaires humaines. D&#39;une grande importance est le fait que des cellules endothéliales de co-culture de maturation de la médiation sur les cellules souches embryonnaires humaines dérivées des progéniteurs pancréatiques en cellules exprimant l&#39;insuline.

Cellules endothéliales co-culture de maturation de la médiation de l&#39;homme les cellules souches embryonnaires à des cellules productrices d&#39;insuline du pancréas dans une approche différenciation dirigée

Les cellules souches embryonnaires (CSE) possèdent deux caractéristiques principales : elles peuvent être propagées indéfiniment in vitro à l'état indifférencié et elles sont...

Ce protocole décrit une différenciation en plusieurs étapes des cellules souches embryonnaires humaines, une approche efficace pour obtenir des cellules productrices d'insuline avec un rendement supérieur à celui des protocoles précédemment développés. Induire d'abord l'endoderme définitif à l'aide d'une activine A et d'un inhibiteur de la PI3K. Ensuite, pour favoriser l'induction de précurseurs pancréatiques, exposer les cellules à l'activine A et à l'acide rétinoïque. Puis réaliser une co-culture avec des cellules endothéliales afin de favoriser la maturation des précurseurs pancréatiques en cellules exprimant l'insuline.Passez à des analyses fonctionnelles par microscopie en immunofluorescence et par QPCR afin de démontrer l'expression du peptide C et la surexpression de l'insuline. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que not est qu'elle entraîne une plus forte surexpression de l'insuline ainsi qu'un rendement plus élevé en cpep exprimé par les cellules en culture. H une colonie de cellules souches embryonnaires humaines à une taille comprise entre un et 1,5 millimètre de diamètre pour les cellules CO à 12.Plaque de culture avec un millilitre par puits de Matrigel pour cellules souches embryonnaires humaines dilué dans du milieu D-M-E-M-F 12. Pendant ce temps, aspirez le milieu des cellules souches hématopoïétiques et remplacez-le par du milieu MTS-1. Ensuite, récoltez les cellules par raclage. Ajoutez-les dans un tube conique de 15 millilitres, ajoutez du milieu MTR-1 frais, puis ensemencez-les à un ratio de division de un à quatre dans les puits préalablement revêtus de Matrigel d'une plaque de 12 puits.Une fois que les cellules en prolifération atteignent un diamètre de un à 1,5 millimètre, la différenciation est initiée en ajoutant un milieu d'induction de l'endoderme définitif contenant de l'active in a et l'inhibiteur de la PI trois K. Poursuivre la culture de wart manin pendant quatre jours.Renouveler le milieu chaque jour. Passer à l'induction des progéniteurs pancréatiques en cultivant d'abord dans du D-M-E-M-F 12 complet contenant 0,2 micromolaire de KAAD, cyclodopamine pendant 24 heures. Ensuite, remplacer le milieu par du D-M-E-M-F 12 complet contenant 0,2 micromolaire de KAAD cyclodopamine et 2 micromolaires d'acide rétinoïque tout-trans, puis incuber pendant trois jours en renouvelant le milieu chaque jour.Incuber les cellules en milieu de maturation pendant deux jours avant d'effectuer l'étape finale de maturation, en tant que contrôle positif pour la maturation in vivo de cellules progénitrices pancréatiques dérivées de CSE, en présence de l'inhibiteur de la voie Notch DAPT, avant la séparation. Examiner les cellules endothéliales au microscope, puis trypsiner et compter les cellules pour la condition de co-culture par contact. Ajouter 1 million de cellules endothéliales microvasculaires cardiaques de rat aux cellules en différenciation dans le milieu MCDB 131 complet.Préparez également une culture témoin composée uniquement de milieu de co-culture avec nos cellules endothéliales. Placez toutes les conditions de traitement dans un incubateur pendant six jours avec un changement de milieu. Prélève quotidiennement des cellules échantillons à la fin de chaque stade du processus de différenciation.Extraire les ARN à partir de cellules endothéliales, de progéniteurs pancréatiques et d'îlots mûrs en utilisant le kit de purification d'ARN « nucleus spin E-R-R-N-A » selon les instructions du fabricant. À l'aide d'un spectrophotomètre Smart Spec Plus et d'une cuvette en quartz, déterminer la qualité de l'ARN par le rapport d'absorbance à 260 nanomètres par rapport à 280 nanomètres. Calculer également les concentrations des échantillons en utilisant 100 nanogrammes de matrice d'ARN par échantillon.Réalisez les réactions de RT en utilisant le kit d'imprégnation de transcription inverse. Passez ensuite à la mise en place de la QPCR en utilisant les amorces indiquées, chargez les réactions dans le thermocycleur et exécutez le programme de QPCR. Puis, à l'aide des valeurs de CT, calculez le changement relatif de l'expression de l'ARNm cible par rapport aux cellules non différenciées à la fin de chaque stade de différenciation.Fixer les cellules dans du formaldéhyde à 4 % pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, rendre les cellules perméables avec du Triton X-100 à 0,25 % pendant 10 minutes afin de bloquer la coloration non spécifique. Ajouter 10 % de sérum de âne dans du TX à 0,05 % pendant 30 minutes.Ensuite, ajoutez l'anticorps primaire dans le tampon de blocage et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius. Lavez les échantillons avec du Triton X 0,05 % pendant cinq minutes. Puis ajoutez l'anticorps secondaire dilué dans le tampon de blocage et incubez pendant une heure à température ambiante à l'abri de la lumière.Réaliser trois lavages de cinq minutes avec une solution contenant 0,05 %x pour maintenir les noyaux à la teinture de cheval à une dilution de un à 1000 dans du PBS. Incuber pendant cinq minutes, suivies de trois lavages avec du PBS. Acquérir des images des cellules fixées et colorées à l’aide d’un microscope inversé et d’un logiciel d’imagerie.L'ajout d'activine A et de Wnt3a à des cellules souches embryonnaires humaines non différenciées pendant quatre jours induit l'endoderme définitif. L'analyse Q-R-T-P-C-R a confirmé la présence des marqueurs attendus de l'endoderme définitif : SOX17, CXCR4 et FoxA2.La coloration immunohistochimique pour SOX17 en vert montre une colocalisation avec le noyau coloré en bleu par le DPI ici. La différenciation en cellules progénitrices pancréatiques, après l'ajout de cyclo, d'amines et d'acide rétinoïque, a été confirmée par RT-PCR quantitative des marqueurs des progéniteurs pancréatiques ainsi que par la coloration immunohistochimique pour PDX1. À la phase finale de différenciation, une coculture en contact avec des cellules endothéliales microvasculaires cardiaques de rat a fortement induit la surexpression de l'insuline dans les cellules progénitrices pancréatiques dérivées de cellules souches embryonnaires humaines.Les cocultures de L avec les CERMV marquées par l'AC-LDL montrent des régions où les CSE sont attachées à la plaque. S'il existe des espaces vides, d'autres CERMV peuvent être observées en contact direct avec les CSE en cours de différenciation, comme prévu. La coloration immunohistochimique des CERMV ne révèle aucune expression détectable d'insuline.La coloration par éptide est également un marqueur utile pour les cellules différenciées à l'aide de la méthode de co-culture après son développement. Cette technique a permis d'étudier les interactions entre cellules au cours du processus de différenciation des cellules souches, ce qui augmente manifestement la fonctionnalité du phénotype mature.

endothelial-cell-co-culture-mediates-maturation-human-embryonic-stem

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Un protocole d'isoler, les grappes de la culture, et de l'image cellules des îlots (CCI) dérivées de cellules pancréatiques fœtales humaines est décrite. La méthode décrit les étapes nécessaires pour générer CCI du tissu, de la culture en monocouche ou en suspension sous forme d'agrégats, et l'image des marqueurs de prolifération et les décisions du destin cellulaire du pancréas.

L&#39;isolement, la culture, et de l&#39;imagerie de l&#39;homme causés par des amas de cellules pancréatiques

Le procédé de culture en trois dimensions décrite dans ce protocole récapitule le développement du pancréas de progéniteurs embryonnaires dispersées de pancréas de souris, y compris leur expansion substantielle, la morphogenèse et la différenciation dans un organe ramifié. Ce procédé se prête à l'imagerie, la perturbation fonctionnelle et la manipulation de la niche.

In Vitro pancréas organogenèse du dispersées progéniteurs embryonnaires de souris

Nous décrivons ici un protocole 4 étapes pour différencier les cellules souches embryonnaires humaines à NKX6-1 + progéniteurs pancréatiques in vitro. Ce protocole peut être appliqué à une variété de lignées de cellules souches pluripotentes humaines.

Différenciation efficace de pluripotentes cellules souches à NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; pancréatiques progéniteurs

Protocoles pour générer des lignes de mutants HPSC en utilisant la plate-forme iCRISPR et de différencier hPSCs dans les cellules ß-like glucose-sensibles sont décrits. La combinaison de la technologie d'édition génome avec une différenciation HPSC dirigée fournit une plate-forme puissante pour l'analyse systématique du rôle des déterminants de la lignée dans le développement humain et de la progression de la maladie.

Genome Montage et différenciation dirigée des hPSCs pour Interrogation Déterminants Lineage dans le développement du pancréas humain

Ce protocole présente une comparaison entre deux protocoles d’induction différents pour différencier les cellules souches de la pulpe dentaire humaine (hDPSC) vers des lignées pancréatiques in vitro: le protocole intégratif et le protocole non intégratif. Le protocole intégratif génère plus de cellules productrices d’insuline (PI).

In vitro Induction de cellules souches de pulpe dentaire humaine vers des lignées pancréatiques

Le présent protocole décrit une méthode améliorée pour augmenter la co-expression des facteurs de transcription PDX1 et NKX6.1 chez les progéniteurs pancréatiques dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) dans des monocouches planes. Ceci est réalisé en reconstituant la matrice fraîche, en manipulant la densité cellulaire et en dissociant les cellules endodermiques.

Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en précurseurs de cellules bêta pancréatiques dans un système de culture 2D

La différenciation des cellules souches en cellules d’îlots pancréatiques offre une solution alternative au traitement conventionnel du diabète et à la modélisation de la maladie. Nous décrivons un protocole détaillé de culture de cellules souches qui combine un kit de différenciation commercial avec une méthode préalablement validée pour aider à produire des îlots dérivés de cellules souches sécrétrices d’insuline dans une boîte.

Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en amas d’îlots pancréatiques producteurs d’insuline

Cet article présente un protocole de différenciation dirigée et d’analyse fonctionnelle des cellules de type β-cellules. Nous décrivons les conditions de culture et les passages optimaux pour les cellules souches pluripotentes humaines avant de générer des cellules pancréatiques productrices d’insuline. La différenciation en six étapes progresse de la formation définitive de l’endoderme à des cellules fonctionnelles de type β sécrétant de l’insuline en réponse au glucose.

Protocole optimisé pour la génération de cellules pancréatiques fonctionnelles sécrétant de l’insuline à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Nous proposons un protocole mini-invasif pour la transplantation intramusculaire d’îlots de cellules souches pancréatiques dérivées de cellules souches humaines dans des souris immunodéficientes pour une implantation in vivo et une analyse en aval.

Transplantation intramusculaire de cellules endocrines pancréatiques dérivées des cellules souches pluripotentes humaines chez la souris

Dans cette vidéo, nous montrons comment notre laboratoire passages couramment HUES humaine lignées cellulaires embryonnaires souches à la trypsine.

HUES repiquage souches embryonnaires humaines lignées cellulaires à la trypsine

Découvrez la différenciation multi-étapes des cellules souches embryonnaires humaines en cellules productrices d'insuline via co-culture avec des cellules endothéliales. Cette méthode améliore significativement la maturation et le rendement cellulaire.

Cellules endothéliales co-culture de maturation de la médiation de lhomme les cellules souches embryonnaires à des cellules productrices dinsuline du pancréas dans une approche différenciation dirigée (Vidéo) | JoVE Journal

Cellules endothéliales co-culture de maturation de la médiation de l'homme les cellules souches embryonnaires à des cellules productrices d'insuline du pancréas dans une approche différenciation dirigée

Explorer plus de vidéos