Isolement des cellules épithéliales mammaires à partir de trois dimensions de cellules mixtes Sphéroïde Co-culture

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir des cellules épithéliales à partir de cultures tissulaires tridimensionnelles composées de cellules mixtes afin d'analyser les effets des fibroblastes stromaux sur la biologie des cellules épithéliales. Cela est réalisé en établissant d'abord des cocultures stéroïdes tridimensionnelles de cellules mixtes. Les sphéroïdes sont ensuite séparés de la matrice de culture afin d'isoler les cellules épithéliales après coculture.

L'étape suivante consiste à repiquer les cellules épithéliales après la co-culture jusqu'à ce qu'elles soient prêtes pour l'analyse. En fin de compte, les effets de l'exposition aux fibroblastes en culture tridimensionnelle sur le comportement des cellules épithéliales peuvent être évalués par imagerie microscopique des cultures et analyse après la co-culture. Des cellules épithéliales, telles que l'imagerie de fluorescence de l'invasion matricielle et la migration Transwell illustrée ici, La procédure sera démontrée par Quin, un assistant de recherche de mon laboratoire, la veille de l'établissement des co-cultures.

Retirer le gel matre du congélateur et le décongeler sur de la glace dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le jour de l'expérience, placer le milieu de culture sur de la glace au moins une heure avant de le mélanger avec le gel matra. Pour diluer le gel matra décongelé.

Ajoutez la moitié du volume de milieu H Mac glacé nécessaire pour la co-culture dans un tube stérile placé sur de la glace. Ensuite, ajoutez au tube la même moitié du volume total de matrigel décongelé afin d'obtenir une dilution un-à-un, en gardant le tube sur la glice. Puis, déposez 50 microlitres du mélange de matrigel et de milieu au centre des puits désignés d'une plaque 24 puits et incubez la plaque dans une étuve à 37 degrés Celsius avec de l'air humidifié et 5 % de CO2 pendant 10 minutes.

Ensuite, ajouter un supplément de 450 microlitres de mélange de milieu de gel Matrigel dans les puits et incuber pendant encore 60 minutes. Pendant la seconde incubation, préparer une suspension un-à-un de fibroblastes et de cellules épithéliales à une concentration de 0,5 × 10⁵ cellules dans chaque 0,5 millilitre de milieu HME. Lorsque le mélange de milieu de Matrigel est solidifié, déposer délicatement la suspension cellulaire sur le dessus du gel et replacer la culture dans l’incubateur pendant deux jours.

Changer le milieu toutes les deux à trois journées en aspirant très doucement le milieu sur le côté de la cavité et en le remplaçant délicatement par du milieu HEC frais. Surveiller quotidiennement la formation des sphéroïdes au microscope, en prenant des images si nécessaire, en utilisant la microscopie optique ou la microscopie à fluorescence. Commencer par pipeter la culture de haut en bas 10 fois à l’aide d’une pipette en verre stérile de deux millilitres. Ensuite, transférer la culture à l’aide de la pipette en verre dans un tube conique stérile de 15 millilitres et centrifuger pendant 10 minutes à 350 ×g à température ambiante. Après la centrifugation, le stéroïde cellulaire sédimentera au fond du tube.

Utilisez une pipette Pasteur stérile pour retirer délicatement le gel Matrigel disrupté du dessus du tube d'essai. Préparation. Ajoutez maintenant un millilitre de milieu H-MAC au culot, puis pipetez de haut en bas deux à trois fois à l’aide d’une pipette en verre stérile de deux millilitres et transférez la culture dans une cavité d’une plaque de culture tissulaire à 24 puits. Laissez les cellules stéroïdes s’attacher à la boîte pendant au moins 48 heures avant de changer le milieu.

Au fil du temps, les cellules quittent la structure sphéroïde et se développent en monocouche après que les cultures cellulaires aient atteint 50 % de confluence. Passez-les selon un protocole standardisé vers une boîte de 35 millimètres pendant deux à quatre jours, puis repassez-les dans une boîte de 100 millimètres pendant trois à cinq jours avant toute analyse supplémentaire des cellules. Utilisez une pipette Pasteur stérile pour aspirer le milieu, puis retirez manuellement autant que possible les résidus de sphéroïdes fantômes. Dans les cocultures sphéroïdales tridimensionnelles de fibroblastes avec un silençage du TM1, comme illustré ici dans les figures D, E et F, on observe une invasion accrue de la matrice par les cellules épithéliales mémoire par rapport aux fibroblastes témoins des figures A, B et C. Remarquez les projections épithéliales qui envahissent la matrice dans les sphéroïdes contenant des fibroblastes avec silençage du TM1, indiquées par des flèches dans les figures D et F. Les fibroblastes présentant une surexpression ingénierie du TM1, montrés ici dans les figures J, K et L, induisent une invasion réduite par la lignée cellulaire de cancer du sein SUM159 par rapport aux fibroblastes témoins des figures G, H et I. Comparez l'absence de projections épithéliales dans les sphéroïdes contenant des fibroblastes ingénierisés avec surexpression du TM1 à celles contenant des fibroblastes témoins, indiquées par les flèches dans les figures G et I, une fois les cocultures sphéroïdales établies.

Les populations cellulaires peuvent être isolées des stéroïdes par repiquage dans un contexte bidimensionnel. Ce composé d'images montre des cultures observées en microscopie optique et en microscopie de fluorescence après leur isolement à partir d'une culture en matrigel. Le jour zéro correspond à l'imagerie effectuée immédiatement après l'isolement ; les jours un, deux et cinq indiquent les jours suivant l'isolement.

Observez comment la couronne de cellules quittant ce stéroïde augmente au fil du temps. Finalement, un stéroïde fantôme avec très peu de cellules subsiste, comme mis en évidence ici par la flèche. Très peu de stéroïdes restent après l'élimination des fantômes et un passage.

En fonction des taux de croissance relatifs des cellules testées. Des populations pures peuvent émerger par passages successifs ou peuvent être triées à l’aide de marqueurs cellulaires appropriés. Les échantillons sont analysés par cytométrie en flux dans cet exemple, en utilisant la fluorescence verte et la fluorescence rouge pour identifier respectivement les fibroblastes exprimant la GFP et les cellules épithéliales exprimant la mCherry, afin de déterminer les proportions relatives de cellules épithéliales et de fibroblastes.

Après leur isolement à partir d'une culture tridimensionnelle en co-culture, les cellules épithéliales conservent les propriétés conférées par la co-culture avec des fibroblastes pendant des périodes prolongées, offrant ainsi une opportunité suffisante pour l'analyse. Dans cet exemple, l'exposition à des fibroblastes déficients en TM1 a induit une migration accrue dans les cellules H max en co-culture, persistance qui s'est maintenue pendant plusieurs semaines après l'isolement de la co-culture tridimensionnelle, comparée à l'exposition à des fibroblastes témoins désignés ici par C suivant cette procédure. D'autres méthodes, telles que celles permettant d'analyser les modifications de l'expression génique et des marques épigénétiques, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant les effets des fibroblastes sur les cellules épithéliales.