TransFLP - Une méthode pour modifier génétiquement

L'objectif de cette procédure est de manipuler génétiquement le cray vio à l'aide de cette méthode rapide mais imparfaite, basée sur la transformation naturelle et la recombinaison « flip ». Ceci est réalisé en préparant tout d'abord une source adéquate de chitine, car la chitine est l'inducteur naturel de la transformation. Dans une deuxième étape, un ADN construct est généré par deux cycles de PCR, puis leur transformation naturelle est effectuée, permettant aux bactéries contenant le plasmide PBR flip d'absorber le fragment d'ADN amplifié par PCR et de l'intégrer dans leur génome.

Ensuite, une augmentation de température est utilisée pour induire l'enzyme lipase codée par le plasmide, permettant la suppression de la cassette de résistance aux antibiotiques encadrée par des sites de recombinaison flip (FRT). Dans la dernière étape, les bactéries sont débarrassées du plasmide codant pour la FLP. Finalement, une PCR et un séquençage sont utilisés pour démontrer que la manipulation génétique a été réalisée avec succès.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'utilisation de plasmides suicide pour manipuler génétiquement vire, est qu'elle est très rapide et efficace. Commencez par peser des échantillons de 50 à 80 milligrammes de flocons de chitine dans des tubes en plastique standard de 1,5 millilitre, puis, tout en laissant les couvercles des tubes ouverts, stérilisez les flocons au autoclave ; dès que l'autoclave a terminé, fermez immédiatement les couvercles et conservez les flocons stérilisés à température ambiante. Au moins six oligonucléotides sont nécessaires pour amplifier par PCR les régions d'ADN d'intérêt, ainsi que la cassette antibiotique flanquée de séquences FRT. Il est également recommandé d'inclure une paire d'amorces oligonucléotidiques situées à l'extérieur du fragment PCR inséré.

Ceci permet de vérifier l'intégration et l'excision correcte de la cassette de résistance aux antibiotiques flanquée par des séquences FRT, en utilisant avec précaution les oligonucléotides numéro deux, numéro trois, numéro quatre et numéro cinq. Les amorces deux et cinq doivent contenir au moins 28 paires de bases afin de pouvoir s'hybrider suffisamment à l'ADN génomique et aux amorces. Les amorces trois et quatre doivent être conçues en utilisant un plasmide contenant FRT comme matrice ; concevoir les amorces deux et cinq de manière à permettre un appariement étendu de bases complémentaires à l'extrémité 5' entre les amorces deux et trois, et entre les amorces quatre et cinq, respectivement.

Préparez maintenant le premier cycle de PCR en utilisant les oligonucléotides un et deux pour réaliser la première des trois réactions de PCR simultanées mais indépendantes, destinée à amplifier la région en amont de la région expérimentale d'intérêt des constructions conçues sur mesure. En parallèle, préparez la deuxième réaction de PCR en utilisant les oligonucléotides trois et quatre afin d'amplifier la cassette antibiotique encadrée par des séquences FRT. Par exemple, dans cette expérience, le gène A PH conférant la résistance à la canamycine a été utilisé.

Amplifiez simultanément la région d'ADN en aval en préparant la troisième réaction de PCR à l'aide des oligonucléotides cinq et six et de l'ADN génomique comme matrice. Ensuite, après purification des trois fragments de PCR, démarrez la réaction de PCR pour les trois échantillons en utilisant un mélange contenant des quantités équivalentes des trois fragments obtenus lors du premier cycle comme matrice afin d'effectuer un deuxième cycle de PCR. Cette amplification sera catalysée par les oligonucléotides un et six.

Le fragment d'ADN amplifié par PCR servira d'ADN transformant dans les expériences de transformation naturelle. Après avoir cultivé les cellules de V. cholerae dans un milieu enrichi en conditions aérobies à 30 degrés Celsius, récolter les bactéries par centrifugation à température ambiante.

Ensuite, transférez la culture bactérienne sur le cerf-volant en flocons et incubez la suspension cellulaire toute la nuit à 30 degrés Celsius. Puis, mélangez soigneusement au moins 200 nanogrammes de fragments issus de la deuxième série de PCR à la suspension de cellules bactériennes. En prenant soin de ne pas détacher largement les bactéries des surfaces de chitine, incubez cette solution à 30 degrés Celsius sans agitation pendant un jour supplémentaire.

Maintenant, vortexer vigoureusement la culture pendant au moins 30 secondes ; pour les bactéries contenant le plasmide PBR flip, étaler 100 à 300 microlitres de la solution cellulaire sur des boîtes de Petri doublement sélectives contenant de l'ampicilline ainsi que l'autre antibiotique présent dans les boîtes. Incuber les cultures bactériennes à 30 degrés Celsius jusqu'à l'apparition visible de colonies. Ensuite, isoler les transformants uniques à partir des boîtes sélectives.

Commencez cette étape en cultivant les bactéries sur des géloses LB contenant de l'ampicilline à 37 degrés Celsius pendant 16 à 24 heures. En tant qu'étape facultative, modifiez la température à 40 degrés Celsius pendant deux à trois heures, car l'expression de flip à partir du plasmide PBR flip est dé-réprimée à des températures plus élevées. Après huit heures supplémentaires d'incubation à 37 degrés Celsius, transférez les bactéries sur des géloses fraîches.

À présent, mettre en culture parallèlement les clones sur des boîtes de gélose contenant un antibiotique et sur des boîtes sans antibiotique afin de tester la sensibilité aux antibiotiques, puis isoler une colonie unique sensible à l'antibiotique parmi les colonies obtenues. Commencer cette étape en faisant croître la culture pendant la nuit dans des conditions aérobies à 30 degrés Celsius, dans un milieu enrichi sans antibiotique. Le lendemain matin, préparer une nouvelle culture pendant trois à six heures en diluant la culture de la nuit au ratio d’un à cent dans un milieu frais dépourvu d’antibiotique ; en fin d’après-midi, réaliser un étalage ou une dilution en surface de la culture sur des boîtes de gélose LB ordinaire, puis incuber les boîtes pendant encore huit à seize heures à 30 degrés Celsius jusqu’à ce que les colonies deviennent visibles.

Dans cette première expérience visant à supprimer les gènes voisins CTXA et CTXB, les oligonucléotides destinés à la méthode trans flip ont été produits comme vient d'être démontré. La souche parentale, la souche intermédiaire portant la cassette de résistance aux antibiotiques flanquée de séquences FRT à la place du locus d'ADN d'origine de C-T-X-A-B, ainsi que la souche finale dépourvue de C-T-X-A-B et libérée de la cassette de résistance ont toutes été analysées pour leur génotype. Une PCR en bloc a été réalisée pour cette expérience à l'aide d'amorces qui ne s'hybridaient pas au fragment d'ADN amplifié servant à la transformation, mais uniquement à l'ADN chromosomique. Les fragments d'ADN amplifiés ont été séparés par électrophorèse standard sur gel d'agarose afin d'en déterminer la taille.

Dans la première voie, la souche de choléra de type B mondiale se situait à la taille de fragment attendue de 3 143 paires de bases. Dans la deuxième voie, le fragment d'AMP obtenu à partir de la souche delta C-T-X-A-B-F-R-T can. FRT se situait à 3 162 paires de bases.

Et sur la troisième piste, le fragment delta ctx A B FFR TP CR se situait à 1 769 paires de bases par rapport à l'échelle d'un kilobase. Dans le second exemple, où une île génomique entière a été supprimée, l'île de pathogénicité de Vibrio, ou VPI un, a été choisie comme cible pour cette expérience. La méthode trans flip a été modifiée en deux étapes.

Tout d'abord, l'intégration du gène de résistance à la kanamycine a été réalisée par un site FRT unique au début de l'îlot de pathogénicité un. Ensuite, un second cycle de transformation naturelle a été effectué, permettant l'insertion d'un marqueur supplémentaire de résistance aux antibiotiques, à savoir la résistance à la gentamicine suivie d'un second site FRT à l'extrémité de l'îlot de pathogénicité. Les paires d'amorces respectives sont indiquées au-dessus de chaque image de gel, et la méthode trans FLP a été poursuivie comme vient de l'être démontré.

Les souches parentales, intermédiaires et finales ont toutes été vérifiées par PCR de l'ADN génomique purifié dans la voie un. Le fragment de PCR de la souche sauvage de V. cholera a été analysé dans la voie deux. Le fragment de PCR résultant de la souche VPI un FRT peut GM FRT a été analysé.

Et dans la troisième voie, le produit de PCR dérivé de la souche delta VPI un FRT a été analysé. Les paires d'amorces sont indiquées au-dessus de chaque image de gel. La souche finale ne possède pas tout le VPI un.

Dans ce troisième exemple, une séquence de promoteur dépendant de la polymérase ARN A T sept a été intégrée en amont du gène T fox, un régulateur majeur de la transformation naturelle, en utilisant la méthode trans flip avec une légère modification par rapport au protocole standard. La séquence consensus du promoteur dépendant de la polymérase ARN T sept a été incluse sous forme de brins simples dans les oligonucléotides numéro quatre et numéro cinq, de sorte que cette séquence d'ADN soit conservée au sein du chromosome. Même après l'excision du cassette de résistance aux antibiotiques, le construit a ensuite été intégré dans une souche V colorisée contenant la polymérase ARN T sept.

Dans cette souche, l'expression du gène de la polymérase ARN T7 était contrôlée par le promoteur LAC UV5 afin de tester l'expression dépendante de la polymérase ARN T7 du gène T Fox. Des tests de transformation naturelle ont été réalisés dans du milieu LB. La souche parentale, dépourvue du promoteur dépendant de T7 en amont du gène T Fox, n'est pas naturellement transformable dans ces conditions en raison de l'absence de transcription de T Fox en milieu riche et en l'absence de son inducteur naturel, la chitine. Ce phénotype était indépendant de l'induction ou non de la polymérase ARN T7 par l'IPTG.

Cependant, la souche trans-flip générée, qui contient le promoteur dépendant de la polymérase ARN T7 en amont du gène de compétence T fox, était effectivement transformable naturellement dans un milieu enrichi en raison du passage du promoteur LAC UV5 dans le milieu LB. La polymérase ARN T7 produite transcrivait déjà T fox à partir du promoteur dépendant de la polymérase ARN T7 sans induction par l'IPTG. Ceci a initié la compétence naturelle et la transformation, confirmant ainsi le fonctionnement de la séquence du promoteur dépendant de la polymérase ARN T7 intégrée.

Ce phénotype a été significativement renforcé par l'induction complète de la polymérase ARN T7, suite à l'ajout de l'inducteur du promoteur LAC UV5, l'IPTG. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment manipuler génétiquement Vibrio cholerae en combinant la transformation naturelle induite par la chitine et la recombinaison « flip ». Une fois maîtrisée, cette technique permet de supprimer des gènes ou des îlots génomiques, ainsi que d'insérer des séquences d'ADN de manière ciblée en seulement quelques jours.