TransFLP - Une méthode pour modifier génétiquement Vibrio cholerae Basé sur la transformation naturelle et FLP-recombinaison

Le but de cette procédure est de manipuler génétiquement la vio craie à l’aide de cette méthode rapide et déficiente, qui est basée sur la transformation naturelle et la combinaison de retournement. Ceci est accompli en préparant d’abord une source de chitine appropriée, car la chitine est l’inducteur naturel de la transformation. Au cours de la deuxième étape, une construction d’ADN est générée à l’aide de deux cycles de PCR et leur transformation naturelle est effectuée, permettant aux bactéries contenant le plasmide PBR d’absorber le fragment de PCR et de l’incorporer dans leurs génomes.

Ensuite, un changement de température est utilisé pour induire l’enzyme lipase codée par le plasmide pour l’élimination de la cible de recombinaison inversée ou de la cassette de résistance aux antibiotiques flanquée du site FRT. Dans la dernière étape, les bactéries sont guéries du plasmide codant pour le FLP. En fin de compte, la PCR et le séquençage sont utilisés pour montrer que la manipulation génétique a réussi.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l’utilisation de plasmides suicides pour manipuler génétiquement la vire, est que cette méthode est très rapide et efficace. Commencez par peser des échantillons de 50 à 80 milligrammes de flocons de chitine dans des tubes en plastique standard de 1,5 millilitre, puis gardez les couvercles des tubes ouverts, autoclavez les flocons après que l’autoclave a appelé immédiatement fermer les couvercles et stocker le kit d’autoclave dans des flocons à température ambiante au moins six oligonucléotides sont nécessaires pour amplifier les régions d’intérêt de l’ADN, ainsi que la cassette d’antibiotiques flanquée de la TRF par PCR. Il est également recommandé d’inclure une paire d’amorces oligonucléotidiques à l’extérieur du fragment de PCR inséré.

Cela permet de vérifier avec soin l’intégration et l’excision correcte de la conception de la cassette de résistance aux antibiotiques flanquée de la TRF, des oligonucléotides numéro deux, trois, quatre et cinq. Les amorces deux et cinq doivent contenir au moins 28 paires de bases pour pouvoir s’agenouiller suffisamment devant l’ADN génomique et les amorces. Trois et quatre doivent être construits avec un FRT contenant du plasmide comme modèle, concevoir les amorces deux et cinq pour permettre un appariement de bases complémentaires étendu à l’extrémité cinq entre les amorces deux et trois et les amorces quatre et cinq, respectivement.

Maintenant, pour la première série de PCR, utilisez les oligonucléotides un et deux pour préparer la première des trois réactions PCR simultanées, mais indépendantes, pour l’amplification de la région en amont de la région expérimentale d’intérêt des constructions conçues sur mesure. En parallèle, préparer la deuxième réaction PCR à l’aide des oligonucléotides trois et quatre pour amplifier la cassette d’antibiotiques flanquée de la TRF. Par exemple, dans cette expérience, le gène A PH codant pour la résistance canine a été utilisé.

Amplifier simultanément la région d’ADN en aval en préparant la troisième réaction PCR en utilisant les oligonucléotides cinq et six et l’ADN génomique comme modèle. Ensuite, démarrez la réaction PCR pour les trois échantillons après purification des trois fragments de PCR, utilisez un mélange avec des quantités égales des trois fragments obtenus lors du premier tour comme modèle pour effectuer un deuxième tour de PCR. Cette amplification sera catalysée par les oligonucléotides un et six.

Le fragment de PCR résultant servira d’ADN transformant dans les expériences de transformation naturelle. Après la croissance de cellules de choléra, milieu enrichi en aérobie à 30 degrés Celsius. Récoltez les bactéries par centrifugation à température ambiante.

Ensuite, transférez la culture bactérienne sur le cerf-volant en flocons et incubez la suspension cellulaire pendant la nuit à 30 degrés Celsius. Ensuite, mélangez soigneusement au moins 200 nanogrammes de fragments dérivés de la PCR du deuxième tour dans la suspension de cellules bactériennes. En prenant soin de ne pas détacher excessivement les bactéries des surfaces de la chitine, incubez cette solution à 30 degrés Celsius sans mouvement pendant un autre jour.

Maintenant, vortex, la culture vigoureusement pendant au moins 30 secondes pour les bactéries qui hébergent le plasmide de retournement PBR étale 100 à 300 microlitres de la solution cellulaire sur des plaques sélectives doubles contenant de l’ampicilline. En plus des autres antibiotiques dans les plaques, incubez les cultures de cellules bactériennes à 30 degrés Celsius jusqu’à ce que les colonies soient visibles. Isolez ensuite les transformants simples des plaques sélectives.

Commencez cette étape en cultivant les bactéries sur des plaques de gélose LB contenant de l’ampicilline à 37 degrés Celsius pendant 16 à 24 heures. En option, modifiez la température pendant deux à trois heures à 40 degrés Celsius, car l’expression du retournement du plasmide du retournement PBR est déprimée à des températures plus élevées. Après huit autres heures d’incubation à 37 degrés Celsius, transférez les bactéries dans des assiettes fraîches.

Maintenant, limitez les clones en parallèle sur des plaques de gélose contenant des antibiotiques et sans antibiotiques pour tester la sensibilité aux antibiotiques, puis isolez une seule colonie sensible aux antibiotiques. Commencez cette étape en cultivant la culture pendant la nuit dans des conditions aérobies à 30 degrés Celsius, enrichissez le milieu sans antibiotiques. Le lendemain matin, cultivez une nouvelle culture pendant trois à six heures en diluant la culture pendant la nuit dans un rapport de un à 100 dans un milieu frais sans antibiotiques dans la traînée ou la dilution en plaque de la culture sur des plaques de gélose LB ordinaires, puis incubez les plaques pendant huit à 16 heures supplémentaires à 30 degrés Celsius jusqu’à ce que les colonies soient visibles.

Dans cette première expérience, il visait à supprimer les gènes voisins CTXA et CTXB. Les oligonucléotides pour la méthode trans flip ont été générés, comme cela vient de le démontrer, la souche parentale, la souche intermédiaire hébergeant la cassette de résistance aux antibiotiques flanquée de la FRT au lieu du locus d’ADN d’origine de C-T-X-A-B et la souche finale supprimée pour C-T-X-A-B et libérée de la cassette de résistance ont tous été testés pour leur génotype. Une PCR en gros a été réalisée pour cette expérience à l’aide d’amorces qui ne se sont pas agenouillées sur le fragment de PCR transformant. mais uniquement à l’ADN chromosomique. Les fragments de PCR ont été séparés par électrophorèse standard de l’aérogel pour déterminer leur taille.

Dans la première voie, la souche mondiale de choléra de type B a été localisée à la taille de fragment attendue de 3 143 paires de bases. Dans la deuxième voie, le fragment de PCR dérivé de la souche delta C-T-X-A-B-F-R-T peut. Le TRF était situé à 3 162 paires de bases.

Et dans la voie trois, le fragment delta ctx A B FFR TP CR était situé à 1 769 paires de bases par rapport à l’échelle d’un KB. Dans le deuxième exemple dans lequel un îlot génomique entier a été retiré, l’îlot de pathogénicité de Vibrio ou VPI a été choisi comme cible de cette expérience. La méthode trans flip a été modifiée en deux étapes.

Tout d’abord, l’intégration du gène de résistance à la kanamycine a été réalisée par un seul site FRT au début de PI one. Ensuite, un second cycle de transformation naturelle a été effectué, permettant l’insertion d’un marqueur de résistance aux antibiotiques supplémentaire, à savoir la résistance à la gentamycine, suivi d’un second site de TRF à l’extrémité de l’îlot de pathogénicité. Les paires d’amorces respectives sont indiquées au-dessus de chaque image de gel et la méthode trans FLP a été poursuivie comme nous venons de le démontrer.

Les souches parentales, intermédiaires et finales ont toutes été vérifiées par PCR de l’ADN génomique purifié dans la première voie. Le fragment PCR de la souche sauvage de choléra de type V a été analysé dans le couloir deux. Le fragment de PCR résultant de la souche VPI une boîte FR GM a été exécuté.

Et dans la troisième voie, le produit PCR dérivé de la souche delta VPI one FRT a été analysé. Les paires d’amorces sont indiquées au-dessus de chaque image de gel. La souche finale n’a pas l’intégralité de la souche VPI.

Dans ce troisième exemple, la séquence promotrice dépendante de l’ARN polymérase A T sept a été intégrée en amont avec le gène T fox, un régulateur majeur de la transformation naturelle à l’aide de la méthode trans flip avec une légère modification par rapport au protocole standard. La séquence consensus du promoteur dépendant de l’ARN T sept a été incluse sous forme de surplombs dans les oligonucléotides numéro quatre et numéro cinq, de sorte que cette séquence d’ADN a été maintenue dans le chromosome. Même après l’excision de la cassette de résistance aux antibiotiques, la construction a ensuite été intégrée dans une souche d’ARN polymérase T sept contenant une souche colorisée V.

Dans cette souche, l’expression du gène de l’ARN polymérase T sept a été pilotée par le promoteur LAC UV cinq pour tester l’expression dépendante de l’ARN polymérase T sept de T Fox. La souche parentale dépourvue du promoteur dépendant de T sept précédant le gène T Fox n’est pas naturellement transformable dans ces conditions en raison de l’absence de transcription de T FOX dans un milieu riche et en l’absence de son inducteur naturel, la chitine. Ce phénotype était indépendant du fait que l’ARN polymérase T sept ait été induite artificiellement par l’IPTG ou non.

Cependant, la souche générée par trans flip, qui contient le promoteur dépendant de l’ARN polymérase T sept en amont de la compétence Gene T Fox, était en effet naturellement transformable en milieu enrichissant en raison de la fuite du promoteur LAC UV cinq dans le milieu LB. L’ARN polymérase T sept produite a déjà transcrit T FOX à partir du promoteur dépendant de l’ARN polymérase T sept sans induction par IPTG. Cela a initié la compétence naturelle et la transformation confirmant la fonctionnalité de la séquence promotrice dépendante de l’ARN polymérase T sept intégrée.

Ce phénotype a été significativement amélioré par l’induction complète de l’ARN polymérase T sept due à l’ajout de l’inducteur du promoteur LAC UV cinq IPTG. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de manipuler génétiquement le choléra VI en utilisant une combinaison de transformation naturelle induite par la chitine et de recombinaison flip. Une fois maîtrisée, cette technique permet de supprimer des gènes ou des îlots génomiques, ainsi que d’intégrer des séquences d’ADN de manière dirigée en quelques jours seulement.