Etudier Checkpoint mitotique en illustrant le comportement dynamique des protéines Kinetochore et Motion chromosomique chez Vivre

L'objectif de cette expérience est de démontrer la visualisation des dynamiques protéiques et des profils de localisation in vivo dans des embryons de drosophile vivants par microscopie confocale en temps réel. Cette procédure est réalisée en premier lieu en récoltant des embryons à partir de souches de drosophiles maintenues en élevage. Ensuite, transférez les embryons sur une lame, puis retirez manuellement les chorions des embryons pour obtenir des embryons déchorionés.

Des embryons sont ensuite montés de manière organisée sur des lames préalablement préparées et, selon l'expérience, peuvent être micro-injectés avec des réactifs appropriés induisant le point de contrôle du fuseau. La dernière étape de cette procédure consiste à effectuer une imagerie en laps de temps d'embryons à l'aide d'une microscopie confocale. En définitive, l'imagerie en laps de temps et la microscopie focale sont utilisées pour montrer la protéine du point de contrôle du fuseau, la colocalisation des comportements chromosomiques et l'effet d'agents inducteurs du point de contrôle dans des lignées transgéniques de type oph liées au point de contrôle.

La méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la régulation du fuseau mitotique, telles que l'effet des mutations ou des délétions de protéines du point de contrôle du fuseau, grâce à l'utilisation de lignées géniques, sur la colocalisation des autres composants du point de contrôle, ainsi que les conséquences de ce phénomène sur la capacité du point de contrôle d'assemblage du fuseau à fonctionner efficacement. Les mouches transgéniques sont maintenues à 25 degrés Celsius dans des flacons en plastique contenant de la nourriture pour mouches, avec une couche supplémentaire de poudre de levure sèche à la surface. Le flacon est remplacé régulièrement toutes les deux à trois semaines, selon les conditions de croissance.

Pour préparer la nourriture pour mouches, chauffer une quantité appropriée de mélange pour nourriture de mouches en remuant constamment à l’aide d’une pompe péristaltique afin de dissoudre les composants, puis répartir de huit à dix millilitres de ce milieu sous forme de suspension dans chaque flacon en plastique. Une fois que la suspension a figé et atteint la température ambiante, boucher chaque flacon avec un bouchon en mousse de coton. Placer ces flacons de nourriture dans un plateau, les enfermer dans un sac en plastique et les conserver à quatre degrés Celsius pour une collecte d’œufs à petite échelle.

Transférez environ 50 paires de mouches adultes âgées de deux à trois jours dans un nouveau flacon contenant du milieu de culture, sur lequel a été ajoutée une poudre de levure sèche en surface pour la ponte des embryons. Incubez à 25 degrés Celsius, température maintenue dans cette expérience par la climatisation. Toutes les heures, transférez les mouches dans un nouveau flacon et laissez les embryons pendant 30 minutes.

Pour s'assurer que certains des embryons collectés se situent autour des cycles de division nucléaire huit à dix. La première heure de collecte est généralement écartée car elle contient souvent des embryons âgés qui ont été retenus dans les corps des femelles lorsque les conditions n'étaient pas favorables à la ponte. Par conséquent, seuls les embryons provenant du transfert à partir de la deuxième heure seront utilisés dans ces expériences.

Des lames de microscope et des lamelles de 50 sur 22 millimètres sont utilisées pour cette procédure. Commencez par prendre une lamelle et, à l’aide d’un pinceau fin humide, mouillez légèrement les quatre coins d’un côté avec une très petite quantité d’eau. Placez la lamelle sur une lame de microscope.

La tension superficielle capillaire provoquée par le fin film liquide devrait empêcher le couvre-objet de bouger. Appliquez une fine bande de colle à l'heptane au milieu du couvre-objet. L'heptane devrait s'évaporer en quelques secondes, laissant la colle sur le couvre-objet.

Ensuite, utilisez un stylo diamanté pour découper une autre lame couvre-objet en petits carrés d'environ 1,5 millimètre de côté. Prenez un carré et placez-le à une extrémité de la bande de colle. Ce carré servira à ouvrir la pointe de l'aiguille lorsqu'une microinjection est nécessaire.

Prenez une autre lame de microscope et fixez-y un morceau de ruban adhésif double face d'une longueur de deux centimètres, puis retirez le papier de protection pour commencer la procédure d'encollage des embryons. Transférez les mouches dans un flacon frais contenant du milieu de culture à l’aide d’un pinceau fin et humide. Déposez environ 50 œufs sur le ruban adhésif double face de la lame préparée.

Utilisez une quantité appropriée de liquide pour permettre l'étalement des œufs. Lorsque le liquide s'est évaporé, les œufs adhéreront au ruban sous un microscope stéréo. Touchez délicatement les œufs plusieurs fois le long de leur axe longitudinal avec la face externe d'une des deux branches d'une pince jusqu'à ce que la coquille soit rompue et ouverte.

Laisser l'embryon dans la coquille en Corian pour éviter une déshydratation rapide. Poursuivre ce processus jusqu'à ce que 10 à 20 œufs aient été traités. Ensuite, prélever les embryons et les retirer un par un de la coquille en Corian, puis les placer délicatement en une bande verticale.

Sur la bande de colle. Aligner les embryons de manière que leur côté long soit antiparallèle au côté long de la bande de colle. Placer les embryons dans une chambre de dessiccation pendant trois à huit minutes.

Enfin, recouvrir les embryons d'une quantité appropriée d'huile de volter gauche au tennis afin d'éviter une déshydratation excessive avant la microinjection. La micro-ingestion constitue l'aspect le plus difficile de cette procédure. Afin de rendre la micro-ingestion aussi simple et efficace que possible, il convient de suivre le protocole spécifique relatif à la préparation des lames.

Les embryons doivent être soigneusement préparés afin d'être dans des conditions optimales pour la microinjection. Les aiguilles destinées à la microinjection des embryons sont préparées au préalable. À l’aide d’une micro-pipette fine, remplir une aiguille par l’arrière avec un à deux microlitres d’une concentration appropriée du réactif dans du tampon d’injection.

Monter l'aiguille dans le porte-aiguille sur un microscope confocal inversé Leica TCSP deux avec le tuyau de pression connecté au système de contrôle d'injection. Trouver un embryon sous l'objectif 40 fois. Ensuite, trouver l'ombre de l'aiguille sans changer le plan focal.

Cela s'accomplit en déplaçant l'aiguille au centre du champ de vision et en l'abaissant progressivement jusqu'au bon plan focal. Déplacez très délicatement la platine du microscope pour trouver le petit carré de lamelle préalablement monté à une extrémité de la bande de colle. Avancez très doucement l'extrémité de l'aiguille jusqu'à ce qu'elle touche le bord du petit carré de lamelle et la brise délicatement.

Déplacez la platine pour que les embryons réapparaissent dans le champ de vision et sélectionnez un embryon au stade d'âge approprié pour l'injection. Rapprochez délicatement l'embryon de l'aiguille et réajustez le plan de focalisation pour l'embryon et l'aiguille. Introduisez l'embryon dans l'aiguille.

Injectez une goutte de réactif sur le côté de l'embryon, puis éloignez l'embryon. Des images en lapse de temps ou des images uniques d'embryons vivants sont acquises à l’aide d’un système de microscopie confocale inversée Leica TCSS SP2 équipée d’un objectif à immersion dans l’huile de 40 fois. Lors de l’imagerie de plusieurs fluorophores présentant des spectres chevauchants et coexprimés dans le même embryon, chaque longueur d’onde d’émission des protéines fluorescentes est collectée séquentiellement.

Les images sont apparues ultérieurement lors de la configuration des intervalles de temps pour l'imagerie en accéléré. Ces facteurs doivent être pris en compte. Une image unique est généralement obtenue comme moyenne de deux lignes de balayage.

Avec une moyenne de deux balayages d'images, il faut un minimum de 6,3 secondes pour balayer une image de cinq fois douze sur cinq fois douze pixels en mode balayage simultané, et 15,44 secondes en mode balayage séquentiel afin d'obtenir un bon rapport signal sur bruit. Le diaphragme est généralement réglé entre un et deux au, ou unité d'Airy, et la puissance du laser est ajustée au niveau le plus bas possible afin d'éviter tout photoblanchiment significatif. Ce film temporel représentatif montre le recrutement dynamique du noyau cinétique de CDC 20 et le mouvement des chromosomes dans des embryons vivants d'ophtalmies.

Des images en prise de vue instantanée ont été obtenues à partir d'un embryon transgénique initial coexprimant GFP-CDC20, montré en vert, et la histone RFP deux B montrée en rouge. Pendant les cycles de division nucléaire, sept à huit images ont été prises toutes les 10 secondes, et l'image où les cellules sont déjà en prophase est considérée comme le point zéro du temps. Cette figure montre les images de la vidéo en prise de vue instantanée : GFP-CDC20 peut être facilement observé sur les kinétochores en prophase et en prométaphase, comme indiqué par les flèches blanches sur les images trois et quatre respectivement, et persiste sur les kinétochores en métaphase et en anaphase, comme observé sur les images cinq et six respectivement.

Le G-F-P-C-D-C 20 est exclu du noyau interférentiel indiqué par la flèche blanche dans l'image un et pénètre dans le noyau au début de la prophase, comme illustré dans l'image deux. Les morphologies de la chromatine des images huit à quatorze ont été déterminées à l'aide de l'histone RFP deux B exprimée en co-expression comme marqueurs fusionnés. Les images sont présentées dans la rangée inférieure.

À l'aide de ce protocole, les fonctions du point de contrôle de l'assemblage du fuseau, ou SAC, peuvent être étudiées en manipulant les embryons par microinjection d'anticorps, de protéines marquées au fluorochrome ou de composés chimiques d'intérêt susceptibles de déclencher le SAC. Dans cet exemple, les embryons sont traités au colchicine afin de dépolymériser les microtubules, activant ainsi le SAC. GFP CDC 20 ou GFP MAD2 ont été utilisés. Deux signaux cinétiques du noyau ont servi de marqueurs de progression du cycle cellulaire.

Dans le panneau supérieur, les ARES indiquent les esci arrêtés sur les images deux à six. La zone marquée par une flèche sur l'image un indique l'état avant le traitement à la colchicine, où la protéine GFP-CDC20 est exclue du noyau en fin d'interface. Les images du panneau central montrent que, en l'absence de MAD2 endogène, la protéine GFP-CDC20 indiquée par les flèches sur les images sept à douze continue d'osciller entrant et sortant du noyau, ainsi qu'en s'associant et se dissociant de la plaque kinétochorienne.

Bien que la cytokinèse semble défectueuse, cela suggère un dysfonctionnement de la SAC empêchant l'arrêt des cellules en réponse au traitement par la colchicine. Un exemple de séparation défectueuse des noyaux filles est observé sur l'image 10. Enfin, dans le panneau inférieur, les flèches des images 14 à 18 indiquent des noyaux kinétiques arrêtés présentant une accumulation de protéines de fusion GFP MA deux, ce qui suggère que la GFP MA deux fonctionnelle compense le phénotype de défaut de la SAC dans l'embryon mutant MA deux.

La flèche dans l'image 13 indique l'accumulation de GFP MAD deux dans un noyau en fin d'interphase. Après avoir visionné ces vidéos, vous devriez bien comprendre comment récolter les embryons de deux logiciels à partir des tiges maintenues, désynchroniser manuellement les embryons avant de préparer les lames pour l'ingestion microscopique et réaliser un examen en temps réel, en laissant une imagerie par microscopie confocale.