Une technique simplifiée pour

Aujourd'hui, nous démontrons une technique simplifiée permettant de prélever le tissu cornéen et le tissu rétinien d'un globe oculaire humain provenant de donneurs cadavériques. La technique décrite ici aidera à prélever un tissu de bonne qualité destiné à la transplantation, à des fins chirurgicales ou à la recherche scientifique, sans endommager les autres tissus du globe oculaire. Forts de 18 années d'expertise et de milliers de cornées transplantées chaque année, nous maintenons un haut niveau de qualité dans notre travail en développant continuellement de nouvelles techniques et en améliorant nos compétences au quotidien.

Pour y parvenir, nous exerçons d'abord sur la cornée, suivie des yeux rétiniens. La cornée est un tissu avasculaire qui permet la transmission de la lumière vers la rétine et, à cet effet, doit toujours conserver un bon degré de transparence. La cornée comprend cinq couches : l'épithélium, la membrane de Bowman, le stroma, la membrane de Descemet et l'endothélium.

Si la cornée est endommagée, elle peut être remplacée à l’aide d’une cornée donneuse appropriée. L’épichoroïde est la tunique intermédiaire située entre la sclérotique et la rétine, délimitée intérieurement par la membrane de Bruch, et est responsable de la circulation sanguine dans l’œil. Une éviscération adéquate de l’épichoroïde est tout aussi importante que l’ablation de la rétine.

La rétine aide à recevoir la lumière provenant de la cornée et du cristallin, puis la convertit en énergie chimique qui est finalement transmise au cerveau. À l’aide du nerf optique, qui est transparent et délicat, elle doit être énucléée de manière systématique afin d’obtenir un tissu de bonne qualité. Allumez le cabinet à flux laminaire.

Nettoyez le flux laminaire avec de l'alcool isopropylique à 70 %. Enfilez des vêtements de protection individuelle tels qu'une charlotte chirurgicale, des gants stériles et des manchettes. En utilisant une technique aseptique, préparez le champ stérile en plaçant un drap stérile et un plateau d'instruments pré-stérilisé.

Ouvrir de manière aseptique l'étui des instruments stériles et le retourner sur le champ stérile, en évitant toute contamination. Placer tous les matériaux et instruments stériles dans le champ stérile et positionner les bocaux oculaires contenant les globes oculaires de manière à ce qu'ils soient proches du bord du champ stérile. Pour plus de commodité, étiqueter les flacons contenant le milieu de stockage préparé à l'avance, poser le couvercle en polyol iodé sur le thiosulfate de sodium, et placer une solution tampon saline phosphate stérile.

En dehors de l'alimentation stérile, laissez les tissus oculaires et les solutions atteindre la température ambiante normale, car ils sont conservés au réfrigérateur à quatre degrés Celsius. Évitez les cycles répétés de réchauffement ou de refroidissement. Retirez les compresses et les éponges du bocal oculaire à l'aide de pinces stériles.

Placer le globe oculaire sur le couvercle et retirer les pansements supplémentaires. Prélever soigneusement le globe oculaire avec le nerf optique et immerger le globe dans du IPVP stérile. Décontaminer les globes oculaires dans du IPVP stérile pendant deux minutes.

Transférez le globe dans du sulfate de sodium stérile pendant une minute. Transférez les globes dans une solution tampon phosphate stérile et laissez-les jusqu’à leur utilisation. Sous la hotte à flux laminaire, lavez et retirez le globe oculaire du PBS, puis placez-le dans le champ stérile.

Enveloppez le globe oculaire avec le stéroïde, en laissant la cornée et environ cinq millimètres de sclère à partir de la cornée découverts ; le bulbe oculaire pouvant être simplement tenu à la main. En maintenant une pression adéquate, utilisez des ciseaux stériles. Retirez tous les résidus éventuels de la conjonctive sans endommager la cornée.

Utilisez une lame de scalpel jetable pour réaliser une incision sclérale de trois à quatre millimètres à partir de la région du limbe. Puis prolongez l'incision sur 360 degrés, en évitant de percer le tissu uvéal sous-jacent ou de provoquer une déformation de la courbure normale de la cornée. Effectuez quatre incisions importantes, en laissant quatre petits intervalles, de manière à éviter la sécrétion du corps vitré.

Les quatre entailles sont réalisées, en veillant à ne retirer aucun autre tissu. La présence de petites plaques sclérales peut entraver la coupe ; veillez donc à terminer l'excision de la sclérotique à l'aide de ciseaux de microchirurgie. Cette opération doit être effectuée sans endommager la choroïde, la rétine ni le corps vitré.

Inspectez l'incision pour vous assurer qu'elle est complète. Si l'incision a été réalisée correctement, le bord cornéo-scléral adhère au corps ciliaire uniquement au point correspondant à la cornée ; placez alors la couronne oculaire près du centre du plateau stérile. Terminez l'ablation de la cornée à l'aide de forceps stériles.

Immobilisez le rebord scléral et excisez le rebord cornéo-scléral de la lueur oculaire. Séparez délicatement tous les tissus adjacents restants du bouton cornéo-scléral. N'étirez jamais le rebord cornéo-scléral d'une manière qui pourrait provoquer une tension transversale de la cornée, ni ne le laissez retomber sur la chambre antérieure.

La densité des cellules endothéliales de la cornée est vérifiée à l’aide d’une solution hypotonique, et la mortalité cellulaire à l’aide de la coloration au bleu de trypan pendant environ une minute. Éliminer le bleu de trypan sur une gaze stérile et rincer les cornées dans du PBS stérile. Transférer dans une boîte de Pétri stérile remplie de solution de saccharose.

Cette solution permet de créer un environnement hypotonique et aide à identifier visuellement les cellules. Les cellules sont ensuite comptées au microscope optique avec un grossissement de cent fois et mesurées en nombre de cellules par millimètre carré. On recherche généralement des caractéristiques morphologiques liées à la densité cellulaire, telles que les limites intercellulaires, le polymorphisme, la dégénérescence, la dystrophie et la mortalité cellulaire.

L'épaisseur cornéenne est également une caractéristique importante pour la transplantation, tout comme un bon taux de transparence de la cornée prélevée. Un CLO cornéen stérile est utilisé pour fixer la cornée au niveau du limbe scléral, puis on courbe le CLO cornéen afin de s'assurer que l'ouverture du trou est suffisante pour verrouiller le limbe scléral. Transférez le limbe cornéoscléral à l’aide d’un embout cornéen vers un milieu de conservation cornéen préparé au préalable et maintenu à température ambiante. La cornée doit ensuite être conservée à 31 degrés SIU pendant les quatre semaines de préservation.

Le milieu de conservation subit plusieurs tests microbiologiques à l'aide d'un instrument B 9 2 4 0. Pendant le stockage, la cornée s'épaissit davantage que la taille habituelle requise pour la greffe. Les banques d'yeux utilisent des agents de gonflement D pour réduire l'épaisseur ; le 6 % Dextron T 500 est utilisé pour ramener la cornée à sa taille normale et servir de milieu de transport.

Nettoyez les instruments stériles avec l'appareil à ARN afin de créer un environnement exempt d'AR avant l'excision rétinienne. Préparez le champ stérile et assurez-vous que le globe oculaire est intact, seuls la cornée et le rebord scléral devant être retirés. Si le corps vitré germe et s'écoule, il devient difficile d'extraire le tissu rétinien.

Si le donneur a moins de 65 ans, la sclérotique est conservée dans de l'alcool à 70 % à des fins chirurgicales après les tests sérologiques. Dans de tels cas, la sclérotique n'est pas coupée ; seul le corps vitré est retiré et l'ensemble de la sclérotique est conservé pour l'excision rétinienne. Commencez par une petite incision près du côté cornéen de la sclérotique, puis progressez vers le nerf optique à l'aide de pinces et de ciseaux stériles.

Tenez la partie de la sclérotique à l’aide de pinces stériles et coupez avec les ciseaux en ligne droite vers la partie du nerf optique, morceau par morceau, en évitant d’endommager le corps vitré. Les bouchons choroïdiens doivent être séparés de la sclérotique car ils y sont adhérents. Coupez toute la sclérotique afin d’exposer le tissu choroïdien. Quoi ?

Une fois que la sclérotique est complètement coupée, séparez-la des tissus restants en effectuant une incision près du nerf optique ; une couche entière de choroïde recouvrant le corps vitré devient alors visible. Remplissez ces tubes stériles exempts d'ARN avec deux ml de RL ultérieurement à l’aide de deux paires de forceps stériles. Retirez délicatement la couche de choroïde en saisissant le nerf optique avec une paire de forceps et en enlevant la choroïde avec l’autre.

Séparez partiellement la choroïde et découpez-la pour faciliter son retrait. La couche choroïdienne peut être coupée à l’aide de ciseaux en évitant d’endommager la rétine. Placez la couche choroïdienne excisée dans la solution RNA later et conservez-la à quatre degrés Celsius pendant 24 heures.

Retirer toute la choroïde supplémentaire afin d'exposer le tissu rétinien. Une fois que la couche entière de choroïde est retirée, une couche transparente de rétine apparaît. Clairement, la couche de choroïde possède une membrane de Bruch interne, qui pourrait également être retirée, mais il est difficile de l'identifier à l'œil nu.

De la même manière, utilisez deux pincettes pour retirer la couche rétinienne. Il est facile d'isoler une grande quantité de rétine si elle est excisée près du nerf optique. Toutes les couches de l'œil peuvent désormais être observées.

Placer la rétine excisée dans la solution RNA Later et la conserver à quatre degrés Celsius pendant 24 heures. Nettoyer la zone de travail à l’aide d’alcool isopropylique à 70 %. Les cellules endothéliales colorées au bleu de trypan peuvent être observées sous un grossissement de cent fois au microscope inversé.

Une cornée appropriée avec plus de 200 cellules par millimètre carré est généralement conservée pour une utilisation ultérieure. Le fait de les classer selon une qualité allant de moyenne à excellente sera utile pour des études comparatives. Habituellement, une fois que la cornée est prête pour la greffe, l'épaisseur et la transparence sont notées, et une cornée appropriée est utilisée pour une kératoplastie pénétrante, où toute la cornée est transplantée.

La mortalité cellulaire est vérifiée en observant les cellules colorées en bleu et exprimée en pourcentage de cellules mortes. Une mortalité cellulaire globale supérieure à 2 % est considérée comme inadéquate pendant la conservation. Si la densité cellulaire est inférieure à 2200 cellules par millimètre carré ou si des lésions dues à la mortalité sont présentes, la cornée peut être utilisée pour une kératoplastie lamellaire antérieure.

Si le stroma antérieur est endommagé et que la cornée présente une bonne densité de cellules endothéliales, la cornée pourrait être utilisée pour une kératoplastie lamellaire postérieure. L'épaisseur de la cornée augmente généralement durant la culture d'organe. Le milieu de transport aide à retrouver sa forme et sa structure normales.

De plus, la culture d'organes favorise la réépithélialisation de la cornée et, grâce à sa longue période de conservation, permet une sélection adéquate du donneur. Analyses microbiologiques et sérologiques. Elle offre un temps suffisant pour organiser une intervention chirurgicale et permet de vérifier la densité et la morphologie des cellules endothéliales lorsque cela n'est pas possible en raison d'un délai post-mortem élevé.

Ainsi, si la procédure est suivie telle que décrite, les cornées peuvent être excisées sans aucun dommage aux autres tissus. Si la cornée n'est pas adaptée à la greffe, elle peut être utilisée à des fins de recherche afin de développer un nouveau milieu et des conditions de conservation pour étudier les maladies de la surface oculaire, isoler les cellules souches limbiques et étudier l'effet des médicaments sur la cornée. Pour la rétine, nous pouvons éviter la contamination croisée des échantillons d'ARN avec des tissus centraux et préserver l'intégrité de l'ARN, ce qui est d'une importance fondamentale.

Ces tissus indispensables à des fins de recherche visent à caractériser le transcriptome des tissus oculaires, à isoler des cellules souches pour des projets de médecine régénérative et à évaluer les différences histologiques entre les tissus provenant de sujets normaux ou atteints. Une fois le tissu rétinien prélevé, il peut être utilisé à diverses fins, et par conséquent, les étapes et conditions suivantes de conservation peuvent différer en fonction de l'objectif. Par exemple, le tissu rétinien peut être placé dans des tubes contenant des réactifs de stabilisation de l'ARN tels que le r nator ou le thisis buffer pour l'extraction de l'ARN ou de l'ADN, ou dans du displaced ou de la trypsine pour l'isolement des cellules.

Solutions de fixation avant l'inclusion des tissus dans du paraffine ou du OCT pour l'immunohistochimie. Merci d'avoir regardé cette vidéo et bonne chance dans vos recherches.