Name: GC basé sur la détection de lacétate de Aldononitrile acide dérivé de glucosamine et de muramique pour la détermination des résidus microbienne dans le sol (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Découvrez l'analyse par chromatographie en phase gazeuse des dérivés aldonitrile acétate de glucosamine et d'acide muramique extraits du sol. Cette méthode permet de quantifier les résidus microbiens avec précision.

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Ce travail a été soutenu par des subventions de DOE des Grands Lacs Centre de recherche de la bioénergie (DOE BER Bureau de la science-DE-FC02 07ER64494). Nous sommes reconnaissants envers le Dr Xudong Zhang et ses membres du groupe pour des discussions techniques utiles et des commentaires précieux sur la finalisation du protocole.

1. Préparation de l&#39;échantillon et extraction d&#39;acide <ol><li> Lyophilisation des échantillons de sol après collecte sur le terrain. </li><li> Broyer et homogénéiser les échantillons de sol en utilisant un broyeur à boulets, broyeur du sol, ou d&#39;un mortier et un pilon. </li><li> Peser les échantillons de sol (contenant&gt; 0,3 mg N) dans un ballon de 25 ml d&#39;hydrolyse. </li><li> Ajouter 10 ml HCl 6M dans chaque flacon d&#39;hydrolyse, remplissez gaz N 2 dans les flacons, et fermer hermétiquement. </li><li> Hydrolyser à 105 ° C dans un incubateur pendant 8 heures en utilisant une minuterie automatique. </li></ol> 2. Purification de l&#39;échantillon <ol><li> Retirer les flacons de l&#39;incubateur et laisser refroidir à température ambiante. </li><li> Ajouter 100 ul d&#39;étalon interne myo-inositol (1 mg mL -1 dans l&#39;eau) dans chaque flacon, mélanger en remuant. </li><li> Mettre en place des entonnoirs en plastique se déversant dans 200 ml de poires en forme de flacons avec ST / NS 24/40 articulations, fixées sur des gobelets en plastique pour la stabilité. </li><li> Plier Whatman n ° 2 cercles qualitatives (11 cm de diamètre) en quarts et mis en entonnoirs. </li&gt; <li> Swirl chaque flacon d&#39;hydrolyse, et versez suspension dans l&#39;entonnoir pour filtrer (vous pouvez en outre rincer chaque flacon avec ~ 3 ml d&#39;eau). </li><li> Sécher le filtrat à l&#39;aide d&#39;un évaporateur rotatif à 45 ° C, application de vide. </li><li> Reprendre le résidu séché dans chaque flacon de poire avec 3 ~ 5 ml d&#39;eau (bain à ultrasons utiliser si vous le souhaitez), et verser dans un tube de 40 ml en téflon; rincer le ballon avec une seconde partie aliquote de l&#39;eau. </li><li> Ajuster le pH à 6.6 à 6.8 en utilisant une solution de KOH 1M à des ions métalliques précipiter et d&#39;autres molécules organiques. </li><li> Retirez le précipités par centrifugation à 2000 rcf pendant 10 minutes. </li><li> Verser le surnageant dans un tube de 40 ml en verre, couvrir l&#39;ouverture du tube avec du parafilm, congeler à -20 ° C, puis faire des trous dans le parafilm. </li><li> Lyophiliser le surnageant congelé pour éliminer tout le liquide. </li><li> Dissoudre le résidu avec 3 ml de méthanol sec, vortex soigneusement (utilisez bain à ultrasons si désiré); bouchon du tube, puis centrifuger à 2000 rcf pendant 10 minutes pour réglerles sels. </li><li> Transférer le surnageant dans un flacon de 3 ml de réaction conique; évaporer à sec par la machine RapidVap à 45 ° C (ou sous un léger courant d&#39;azote gazeux sec si désiré). </li><li> Pour chaque flacon, ajouter 100 ul de récupération standard N-méthyl-(1 mg mL -1 dans l&#39;eau) et 1 ml H 2 O, couvrir les bouches du flacon avec du parafilm, les congeler à -20 ° C, perforer le parafilm, puis congeler à sec . </li><li> Faire des normes: ajouter 100 ul d&#39;acide muramique (0,5 mg mL -1 dans le méthanol), 100 pl de la glucosamine (1 mg mL -1 dans l&#39;eau), 100 pl myo-inositol (1 mg mL -1 dans l&#39;eau), 100 N-ul méthylglucamine (1 mg mL -1 dans l&#39;eau), et 1 ml H 2 O, parafilm chaque flacon, congeler à -20 ° C, perforer le parafilm, puis congelez-sec. </li></ol> 3. Dérivatisation <ol><li> Préparer le réactif de dérivatisation contenant 32 mg mL -1 de chlorhydrate d&#39;hydroxylamine et 40 mg mL -1 4-diméthylamino-pydans la pyridine pipéridine-méthanol (4:1 en volume / volume). </li><li> Ajouter 300 ul du réactif de dérivatisation à chacun des reactivials, fermer hermétiquement, et le vortex à fond. </li><li> Mettre les flacons dans 75-80 ° C bain-marie pendant 35 minutes (bien scellé les flacons pour éviter toute permettant d&#39;eau d&#39;entrer dans les flacons). </li><li> Retirer les flacons du bain-marie et laisser refroidir à température ambiante. </li><li> Ajouter 1 ml d&#39;anhydride acétique à chacun des reactivials mL 3, fermer hermétiquement, et le vortex à fond, puis les réchauffer au bain-marie 75-80 ° C pendant 25 minutes. </li><li> Retirer les flacons du bain-marie et laisser refroidir à température ambiante. </li></ol> 4. Séparation et évaluation <ol><li> Ajouter 1,5 ml de dichlorométhane à chaque flacon, le bouchon hermétiquement, et le vortex à fond. </li><li> Ajouter 1 ml d&#39;HCl 1M à chaque flacon, bouchon et vortexer vigoureusement afin de permettre aux solutions de s&#39;asseoir tranquillement jusqu&#39;à ce que les deux phrases distinctes, aspirer et jeter la partie supérieure (aqueuse) à partir de 1000 pipette ul. </li><li> Dans le même fashion, extraire la phase organique 3 fois, mais avec 1 ml de H 2 O (avec la dernière étape de lavage, de prendre un soin particulier à s&#39;assurer que tous les de la phase aqueuse supérieure a été enlevée). </li><li> Séchez la solution finale à l&#39;aide RapidVap à 45 ° C (ou à sec en utilisant de l&#39;azote gazeux si désiré). </li><li> Dissoudre dans 300 uL d&#39;acétate d&#39;éthyle-hexane (1:1 v / v) et le transfert de 2 mL à bouchon à vis d&#39;ambre flacons avec insert un petit volume et fermer hermétiquement. </li><li> Pour la quantification, l&#39;analyse par GC-FID en utilisant une colonne capillaire en silice fondue non polaire: 30 m de long, 0,25 mm de diamètre, épaisseur de film 0,25 um; phase stationnaire 5% phényl-, 95% de méthyl-polysiloxane (DB-5 ou équivalent) avec de l&#39;hydrogène ou de l&#39;hélium comme gaz porteur, à raison de 0,5 ml d&#39;écoulement -1 min constante. La chromatographie est meilleure sur des primes &quot;inertes&quot; phases et de gaz porteur d&#39;hydrogène, mais il est acceptable sur les variétés les plus courantes et à l&#39;hélium. Les paramètres de détection sont de 300 ° C; 400 ml min -1 air et 30 ml min -1 pour la fois l&#39;azote etgaz à effet de maquillage d&#39;hydrogène. L&#39;injection et les paramètres du four sont comme suit: 1 injection directe ul (30:1) avec l&#39;entrée GC fixé à 250 ° C; température initiale du four, à 120 ° C; maintenir 1 min; augmenter la température du four à 10 ° C min. -1 à 250 ° C; maintenir 2,5 min;. rampe à 270 ° C à 20 ° C min -1; tenir 2 minutes; rampe à 290 ° C à 20 ° C min -1, maintenez 5 min. Régler le débit du gaz porteur de telle sorte que l&#39;éluer inositol, la glucosamine et des dérivés d&#39;acide muramique à 250 ° C, et les N-méthylglucamine s&#39;élue à 270 ° C. </li></ol> 5. Validation Derivative <ol><li> Utilisez ionisation douce LC-ESI-TOF-MS pour identifier l&#39;ion moléculaire et de déterminer le poids moléculaire du dérivé. </li><li> Utilisez GC-EI-MS-SIM ou GC-EI-MSMS pour l&#39;amélioration de la sensibilité pour étudier les ions ciblés de la dérivée. </li><li> Utiliser plusieurs réactifs marqués par des isotopes pour la préparation des dérivés, et ensuite utiliser le décalage de massede ces dérivés marqués par des isotopes dans les États membres à enquêter sur l&#39;ion moléculaire et des fragments d&#39;ions. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Le protocole de la méthode comprend principalement quatre étapes: la digestion acide, la purification de l&#39;échantillon, et la détermination de dérivatisation GC (Figure 1). Un exemple de l&#39;analyse de la glucosamine et l&#39;acide muramique des stocks standard et à partir d&#39;un échantillon de sol est montré dans la figure 2. Ailleurs glucosamine et l&#39;acide muramique, la mannosamine et la galactosamine (deux isomères de glucosamine) peut également être déterminée simultanément en utilisant le procédé. Sur la base de facteurs de réponse de normes à l&#39;égard de l&#39;étalon interne myo-inositol, nous pouvons quantifier ces biomarqueurs dans des échantillons de sol. La norme de récupération a été utilisé pour surveiller le processus qualitativement dérivatisation. Les régimes pour la formation de l&#39;acétate de l&#39;acide aldononitrile dérivé de glucosamine et de muramique sont présentés dans la figure 3 </strong&gt;. Les structures proposées pour les produits dérivés ont été déterminées par GC-EIMS-SIM pour l&#39;amélioration de la sensibilité, ou d&#39;ionisation douce LC-ESI-TOF-MS 8; les structures proposées des fragments d&#39;ions formés sur l&#39;ionisation d&#39;électrons ont été étudiés en comparant les spectres d&#39;ions de l&#39; échantillons préparés avec des incorporations des isotopes différents 11. La figure 4 montre le décalage de masse de l&#39;ion dominante m / z 187 de l&#39;acétate de aldononitrile dérivé de la glucosamine dans trois scénarios, préparés avec des agents non-étiquetés, D-acétique anhydrite, et U -13 ° C-glucosamine. Autres informations et des explications détaillées peuvent être référés à notre récente des publications 8, 11. Cette stratégie pourrait servir de modèle pour étudier la chimie dérivée. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig1.jpg" /> Figure 1. Diagramme de mesure du protocole pour l&#39;analyse de la glucosamine et de l&#39;acide dans le sol muramiqueéchantillons. Le protocole contient principalement 4 étapes: la digestion acide, purification, dérivatisation GC et la détermination. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig2.jpg" /> Figure 2. GC-FID chromatogrammes des acétates aldononitrile de l&#39;inositol, de la glucosamine, l&#39;acide muramique, mannosamine, la galactosamine et méthylglucamine pour les normes et les sols. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig3.jpg" /> Figure 3. Systèmes pour la formation de l&#39;acétate de l&#39;acide aldononitrile dérivé de la glucosamine et muramique. Le numéro 1 représente la réaction nitrile. Le numéro 2 représente l&#39;acétylation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3767/3767fig4_lg.jpg"><img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig4.jpg" /></a> Figure 4. Les spectres de masse d&#39;acétate de aldononitrile dérivé de la glucosamine associée à la structuration d&#39;ions dominantees en mode AE préparé avec (A) des agents non marqués, (B) D-acétique l&#39;anhydrite, (C) en U -13 C-glucosamine. Star représente lourde isotopes atome ou un groupe d&#39;isotopes.

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</ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Le présenté GC méthode basée sur l&#39;analyse de l&#39;acétate aldononitrile acide dérivé de la glucosamine et muramique fournit un procédé relativement rapide pour quantifier ces sucres aminés, des extraits du sol. Les dérivés sont chimiquement stables, et peut être déterminée dans une analyse. La méthode n&#39;est pas limitée à des échantillons de sol, et peuvent être simplifiées pour les échantillons de non-matrice du sol. La pompe à vide utilisée dans ce procédé est conçu pour être rési...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> L&#39;acide muramique </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2503-25MG </td></tr><tr><td> D-(+)-chlorhydrate de glucosamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1514-100G </td></tr><tr><td> N-méthyl-D-glucamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2004-500G </td></tr><tr><td> Le myo-inositol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A307003G025 </td></tr><tr><td> Le méthanol (à sec) </td><td> Acros Organics </td><td> AC326950010 </td></tr><tr><td> 4-diméthylamino-pyridine </td><td> Acros Organics </td><td> AC148270050 </td></tr><tr><td> L&#39;acétate d&#39;éthyle </td><td> VWR International </td><td> BJGC100-4 </td></tr><tr><td> Chlorhydrate Hydroxlamine </td><td> Fisher Scientific </td><td> H330-100 </td></tr><tr><td> Pyridine </td><td> Fisher Scientific </td><td> P368-500 </td></tr><tr><td> L&#39;anhydride acétique </td> &lt;td&gt; Fisher Scientific </td><td> A10-100 </td></tr><tr><td> Le dichlorométhane (chlorure de méthylène) </td><td> Fisher Scientific </td><td> D37-500 </td></tr><tr><td> Hexane </td><td> Fisher Scientific </td><td> H303-4 </td></tr><tr><td> L&#39;acide chlorhydrique (6M) </td><td> Fisher Scientific </td><td> S456-4 </td></tr><tr><td> Chlorhydrate d&#39;hydroxylamine -15 N </td><td> Icône de services </td><td> IN5280 </td></tr><tr><td> L&#39;anhydride acétique -2 H (D 6 C 4 O 3) </td><td> Acros Organics </td><td> AC174670050 </td></tr><tr><td> D-glucose-U -13 C </td><td> Cambridge isotope de laboratoire </td><td> CLM-1396-1 </td></tr><tr><td> D&#39;ammonium sufate -15 N </td><td> Cambridge isotope de laboratoire </td><td> NLM-713-1 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nom de l&#39;équipement </td><td> Entreprise </td><td> Type </td></tr><tr><td> Rapid-Vap </td&gt; <td> Labconco </td><td> 790002 </td></tr><tr><td> Vacum pompe </td><td> KNF Neuberger </td><td> D-79112 </td></tr><tr><td> Flacon hydrolyse </td><td> Fisher Scientific </td><td> 06 423 </td></tr><tr><td> Microtube dérivatisation </td><td> Fisher Scientific </td><td> 06-100E </td></tr><tr><td> GC </td><td> Hewlett-Packard </td><td> 6890 </td></tr><tr><td> MS </td><td> Hewlett-Packard </td><td> 5972 </td></tr><tr><td> LC-ESI-TOF-MS </td><td> Agilent </td><td> Un Agilent série 1200 système HPLC couplée à une LC Agilent / MSD-TOF </td></tr></tbody></table>

gc basé sur la détection de l&#39;acétate de aldononitrile acide dérivé de glucosamine et de muramique pour la détermination des résidus microbienne dans le sol

GC-based Detection of Aldononitrile Acetate Derivatized Glucosamine and Muramic Acid for Microbial Residue Determination in Soil

Les approches quantitatives à des micro-organismes qui caractérisent sont cruciales pour une meilleure compréhension de l&#39;état et la fonction microbiennes dans les écosystèmes. Les stratégies actuelles de l&#39;analyse microbienne comprennent à la fois traditionnels de laboratoire de la culture-dépendantes techniques et celles qui sont basées sur l&#39;extraction directe et la détermination de certains biomarqueurs 1, 2. Peu d&#39;entre la diversité des espèces microbiennes qui habitent le sol peuvent être cultivées, afin de la culture-dépendantes des méthodes introduire des biais importants, une limitation absente dans l&#39;analyse des biomarqueurs. L&#39;acide glucosamine, la mannosamine, la galactosamine et muramique ont été bien servis que les mesures à la fois de la vie et de la masse microbienne morts, de ces acides de la glucosamine (le plus abondant) et muramique (uniquement à partir de la cellule bactérienne) sont des constituants les plus importants dans les systèmes sol 3 , 4. Cependant, le manque de connaissances sur l&#39;analyse limite la vulgarisation large entre pairs scientifiques. Parmi tous les exipiquer les méthodes d&#39;analyse, de dérivatisation à aldononitrile acétates suivie par GC-analyse basée sur a émergé comme une bonne option par rapport à l&#39;équilibre de façon optimale la précision, la sensibilité, la simplicité, une bonne séparation chromatographique, et la stabilité sur 5 stockage de l&#39;échantillon. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour une analyse fiable et relativement simple de la glucosamine et l&#39;acide muramique à partir du sol après leur conversion à acétates aldononitrile. Le protocole comprend principalement quatre étapes: la digestion acide, la purification de l&#39;échantillon, et la détermination de dérivatisation GC. La procédure étape par étape est modifiée conformément à l&#39;ancien publications 6, 7. En outre, nous présentons une stratégie visant à valider la structure de l&#39;ion moléculaire du dérivé et ses fragments d&#39;ions formés sur l&#39;ionisation d&#39;électrons. Nous avons appliqué GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS et réactifs marqués par des isotopes pour déterminer le poids moléculaire de l&#39;acétate aldononitrile dérivé de glucosamine et de muracide amique; nous avons utilisé le changement de masse de l&#39;isotope-étiquetés dérivés dans le spectre des ions d&#39;enquêter sur des fragments d&#39;ions de chaque dérivés 8. En plus de l&#39;élucidation théorique, la validation de l&#39;ion moléculaire du dérivé et ses fragments d&#39;ions sera utile aux chercheurs qui utilisent δ 13 C ou des fragments d&#39;ions de ces biomarqueurs dans les études biogéochimiques 9, 10.

Nous décrivons un protocole de la méthode pour l&#39;analyse par GC-base des dérivés de l&#39;acétate de aldonitrile glucosamine et d&#39;acide muramique extrait du sol. Pour élucider le mécanisme chimique, nous présentons également une stratégie visant à confirmer la structure de l&#39;instrument dérivé et les fragments d&#39;ions formés sur l&#39;ionisation d&#39;électrons.

GC basé sur la détection de l&#39;acétate de Aldononitrile acide dérivé de glucosamine et de muramique pour la détermination des résidus microbienne dans le sol

Les approches quantitatives pour caractériser les micro-organismes sont cruciales pour une compréhension plus large de l'état et de la fonction microbiens au sein des écosystèmes.

L'objectif général de cette vidéo est de fournir une description détaillée de l'analyse par GC des dérivés d'acétate de nitrile d'Aldon de la glucosamine et de l'acide muique extraits de sols. Le processus commence par une digestion acide, qui dégrade les polymères organiques et libère la glucosamine et l'acide muique. Les monomères de sucres aminés sont ensuite isolés et purifiés à partir de la solution mixte.Cela est suivi par une dérivation afin de convertir ces oses aminés en nitriles acétates aldones volatils destinés à une analyse par chromatographie en phase gazeuse. La dernière étape de la procédure consiste en une extraction liquide-liquide et en la détermination par CG. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus montrant une séparation de base des oses aminés sous forme de nitriles acétates aldones, éluant entre les étalons de myo et d'acétol ainsi que de glutamine méthylée, par chromatographie en phase gazeuse avec détection par ionisation de flamme.Le principal avantage de cette technique par rapport aux autres méthodes réside dans son équilibre optimal entre précision, sensibilité, simplicité, bonne séparation graphique chromatique et stabilité lors du stockage des échantillons. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine du cycle mondial du carbone, comme la contribution des microorganismes SSE aux réserves de carbone stable dans les sols. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'accumulation de détritus microbiens dans les sols, elle peut également être appliquée à d'autres matrices telles que les systèmes océaniques, les tissus biologiques, voire des échantillons extraterrestres.Pour commencer ce protocole, lyophilisez les échantillons de sol après leur prélèvement sur le terrain, puis broyez-les et homogénéisez-les à l’aide d’un broyeur à billes ou d’un mortier et d’un pilon. Pesez les échantillons de sol broyés dans des fioles de 25 millilitres destinées à l’hydrolyse. Ajoutez 10 millilitres d’acide chlorhydrique six molaire dans chaque fiole d’hydrolyse, puis remplissez avec du gaz azote avant de bien refermer.Hydrolyser à 105 degrés Celsius dans une étuve pendant huit heures. À l’aide d’un commutateur automatique programmable, retirer les flacons de l’étuve et laisser refroidir à température ambiante.Ajouter 100 microlitres d'étalon interne myo-acétol à chaque ballon. Mélanger par agitation. Installer des entonnoirs en plastique se vidant dans des ballons en forme de poire de 200 millilitres. Utiliser des joints de verre coniques normalisés de taille 24/40, placés sur des gobelets en plastique pour assurer la stabilité.Replier les cercles en papier filtre Watman numéro 2 en quatre et les placer dans les entonnoirs. Agiter chaque ballon de l'hydrolyse et verser la suspension dans l'entonnoir. Pour filtrer chaque échantillon, sécher le filtrat à l'aide d'un évaporateur rotatif à environ 45 degrés Celsius sous vide.Suspendre le résidu sec de chaque paire d’erlenmeyers avec trois à cinq millilitres d’eau et verser dans un tube en téflon de 40 millilitres. Rincer chaque erlenmeyer avec un deuxième aliquot d’eau. Ajuster le pH des échantillons à 6,6–6,8 à l’aide d’une solution d’hydroxyde de potassium à 1 molaire afin de précipiter les ions métalliques et d’autres molécules organiques. Ensuite, éliminer les précipités par centrifugation à 2000 × g pendant 10 minutes après la centrifugation.Verser les surnageants dans des tubes en verre de 40 millilitres et couvrir les ouvertures des tubes avec du paraforme. Congeler les surnageants, puis percer des trous dans le paraforme. Lyophiliser les surnageants congelés pour éliminer tout liquide. Une fois les surnageants séchés, dissoudre le résidu avec trois millilitres de méthanol anhydre.Vortexez soigneusement, capuchonnez les tubes, puis centrifugez à 2000 × g pendant 10 minutes. Pour précipiter les sels, transférez les surnageants dans des vials réactionnels coniques de trois millilitres et évaporez à sec à l’aide d’un appareil VA rapide à 45 degrés Celsius ou sous un courant doux d’azote sec. Une fois l’évaporation terminée, ajoutez 100 microlitres d’étalon de récupération et de méthylglutamine, ainsi qu’un millilitre d’eau à chaque vial.Ensuite, congeler les échantillons avant de commencer la dérivation. Préparer les étalons comme décrit dans le protocole écrit, puis lyophiliser les échantillons et les étalons. Préparer le réactif de dérivation contenant 32 milligrammes par millilitre de chlorhydrate d'hydroxylamine et 40 milligrammes par millilitre.Quatre diméthylamino purine dans du méthanol de purine. Ajouter 300 microlitres du réactif de dérivation dans chacun des flacons réactifs, bien refermer et mélanger vigoureusement au vortex. Placer les flacons scellés dans un bain-marie à une température de 75 à 80 degrés Celsius pendant 35 minutes.Retirer les vials du bain-marie et laisser refroidir à température ambiante. Ensuite, ajouter un millilitre d'anhydride acétique à chacun des vials réactifs de trois millilitres, bien refermer et vortexer soigneusement. Procéder ensuite à une seconde incubation dans un bain-marie à 75 à 80 degrés Celsius pendant 25 minutes.Retirer les vials du bain-marie et laisser refroidir à température ambiante. Pour commencer la séparation et la mesure, ajouter 1,5 millilitre de dichlorométhane dans chaque tube, puis vortexer. Après avoir ajouté un millilitre d'acide chlorhydrique un molaire dans chaque vial et avoir vortexé soigneusement, laisser les solutions reposer sans perturbation jusqu'à ce que les deux phases se séparent.Aspirez et jetez la phase aqueuse supérieure. De la même manière, à l’aide d’une pipette de 1000 microlitres, extrayez la phase organique trois fois, mais utilisez un millilitre d’eau lors de la dernière étape de lavage. Veillez particulièrement à retirer complètement toute la phase aqueuse supérieure.Séchez la solution finale à l’aide d’un évaporateur rapide à 45 degrés Celsius ou à l’aide d’un courant d’azote gazeux, dissolvez chaque échantillon dans 300 microlitres d’acétate d’éthyle-hexane, puis transférez dans des vials ambrés de deux millilitres à bouchon vissé munis d’un insert de petit volume, et fermez hermétiquement pour la quantification analysée par chromatographie en phase gazeuse avec un détecteur à ionisation de flamme, en utilisant une colonne capillaire non polaire en silice fondue telle que DB cinq, comme indiqué dans le protocole écrit. Après l’exécution et l’analyse standard, ajustez le débit du gaz vecteur de sorte que les dérivés de l’acétol glucosamine et de l’acide mu amique éluent à 250 degrés Celsius et que le glutamine méthyl terminal éluât à 270 degrés Celsius.Effectuez une injection de un microlitre avec un rapport de fractionnement de 30 :1, le détecteur de chromatographie en phase gazeuse étant réglé à 250 degrés Celsius, à l’aide d’un échantillonneur automatique après l’analyse par chromatographie en phase gazeuse. Enfin, procédez à la validation des dérivés en utilisant les méthodes de chromatographie et de spectrométrie décrites dans le protocole écrit. Des exemples d’analyse de la glucosamine et de l’acide urémique provenant d’étalons et d’un échantillon de sol sont présentés ici ; outre la glucosamine et l’acide muïque, deux isomères de la glucosamine, l’osamine et la galactosamine, peuvent également être déterminés simultanément par cette méthode, fondée sur la quantité exacte des étalons appliqués et les facteurs de réponse de chacun des deux étalons internes.La quantité de ces biomarqueurs dans les échantillons de sol peut être déterminée. Le standard de récupération a également été utilisé pour surveiller qualitativement le processus de dérivation. Les schémas de formation de l'aldonitrile acétate, du dérivé de la glucosamine et de l'acide muique sont présentés ici.Le numéro un représente la réaction de nitrile, et le numéro deux représente l'acétylation. Les structures proposées des fragments ioniques formés lors de l'ionisation par électrons ont été étudiées en comparant les spectres ioniques des échantillons préparés avec diverses incorporations d'isotopes. Ici, le décalage de masse de l'ion dominant du dérivé acétate de nitrile d'aldon de la glucosamine est montré dans différents scénarios.Dans cet exemple, il a été préparé avec des agents non marqués ainsi qu'avec de l'anhydride acétique marqué isotopiquement et de la glucosamine marquée isotopiquement. L'étoile sur la structure chimique représente l'atome isotopique lourd ou le groupe isotopique. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir rigoureusement des conditions anhydres pendant la dérivation.Les solvants organiques et la verrerie utilisés à cette étape doivent être secs. Bien que de nombreux fournisseurs vendent des solvants anhydres, ceux disponibles peuvent être séchés en les faisant passer à travers des colonnes contenant des réactifs déshydratants tels que le sulfate de magnésium. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la spectrométrie de masse par rapport isotopique peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la manière dont les macro-organismes réagissent, ou comment le carbone ou l'azote se renouvellent et s'accumulent dans les sols en différenciant les macro-organismes vivants et morts après leur développement.Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la macro-écologie et de la biologie, chimie du sol, afin d'explorer la contribution des macro-organismes à la matière organique du sol et au piégeage dans les systèmes terrestres naturels ou gérés.

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GC basé sur la détection de l'acétate de Aldononitrile acide dérivé de glucosamine et de muramique pour la détermination des résidus microbienne dans le sol

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