GC basé sur la détection de l'acétate de Aldononitrile acide dérivé de glucosamine et de muramique pour la détermination des résidus microbienne dans le sol

L'objectif général de cette vidéo est de fournir une description détaillée de l'analyse par GC des dérivés d'acétate de nitrile d'Aldon de la glucosamine et de l'acide muique extraits de sols. Le processus commence par une digestion acide, qui dégrade les polymères organiques et libère la glucosamine et l'acide muique. Les monomères de sucres aminés sont ensuite isolés et purifiés à partir de la solution mixte.

Cela est suivi par une dérivation afin de convertir ces oses aminés en nitriles acétates aldones volatils destinés à une analyse par chromatographie en phase gazeuse. La dernière étape de la procédure consiste en une extraction liquide-liquide et en la détermination par CG. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus montrant une séparation de base des oses aminés sous forme de nitriles acétates aldones, éluant entre les étalons de myo et d'acétol ainsi que de glutamine méthylée, par chromatographie en phase gazeuse avec détection par ionisation de flamme.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux autres méthodes réside dans son équilibre optimal entre précision, sensibilité, simplicité, bonne séparation graphique chromatique et stabilité lors du stockage des échantillons. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine du cycle mondial du carbone, comme la contribution des microorganismes SSE aux réserves de carbone stable dans les sols. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'accumulation de détritus microbiens dans les sols, elle peut également être appliquée à d'autres matrices telles que les systèmes océaniques, les tissus biologiques, voire des échantillons extraterrestres.

Pour commencer ce protocole, lyophilisez les échantillons de sol après leur prélèvement sur le terrain, puis broyez-les et homogénéisez-les à l’aide d’un broyeur à billes ou d’un mortier et d’un pilon. Pesez les échantillons de sol broyés dans des fioles de 25 millilitres destinées à l’hydrolyse. Ajoutez 10 millilitres d’acide chlorhydrique six molaire dans chaque fiole d’hydrolyse, puis remplissez avec du gaz azote avant de bien refermer.

Hydrolyser à 105 degrés Celsius dans une étuve pendant huit heures. À l’aide d’un commutateur automatique programmable, retirer les flacons de l’étuve et laisser refroidir à température ambiante.

Ajouter 100 microlitres d'étalon interne myo-acétol à chaque ballon. Mélanger par agitation. Installer des entonnoirs en plastique se vidant dans des ballons en forme de poire de 200 millilitres. Utiliser des joints de verre coniques normalisés de taille 24/40, placés sur des gobelets en plastique pour assurer la stabilité.

Replier les cercles en papier filtre Watman numéro 2 en quatre et les placer dans les entonnoirs. Agiter chaque ballon de l'hydrolyse et verser la suspension dans l'entonnoir. Pour filtrer chaque échantillon, sécher le filtrat à l'aide d'un évaporateur rotatif à environ 45 degrés Celsius sous vide.

Suspendre le résidu sec de chaque paire d’erlenmeyers avec trois à cinq millilitres d’eau et verser dans un tube en téflon de 40 millilitres. Rincer chaque erlenmeyer avec un deuxième aliquot d’eau. Ajuster le pH des échantillons à 6,6–6,8 à l’aide d’une solution d’hydroxyde de potassium à 1 molaire afin de précipiter les ions métalliques et d’autres molécules organiques. Ensuite, éliminer les précipités par centrifugation à 2000 × g pendant 10 minutes après la centrifugation.

Verser les surnageants dans des tubes en verre de 40 millilitres et couvrir les ouvertures des tubes avec du paraforme. Congeler les surnageants, puis percer des trous dans le paraforme. Lyophiliser les surnageants congelés pour éliminer tout liquide. Une fois les surnageants séchés, dissoudre le résidu avec trois millilitres de méthanol anhydre.

Vortexez soigneusement, capuchonnez les tubes, puis centrifugez à 2000 × g pendant 10 minutes. Pour précipiter les sels, transférez les surnageants dans des vials réactionnels coniques de trois millilitres et évaporez à sec à l’aide d’un appareil VA rapide à 45 degrés Celsius ou sous un courant doux d’azote sec. Une fois l’évaporation terminée, ajoutez 100 microlitres d’étalon de récupération et de méthylglutamine, ainsi qu’un millilitre d’eau à chaque vial.

Ensuite, congeler les échantillons avant de commencer la dérivation. Préparer les étalons comme décrit dans le protocole écrit, puis lyophiliser les échantillons et les étalons. Préparer le réactif de dérivation contenant 32 milligrammes par millilitre de chlorhydrate d'hydroxylamine et 40 milligrammes par millilitre.

Quatre diméthylamino purine dans du méthanol de purine. Ajouter 300 microlitres du réactif de dérivation dans chacun des flacons réactifs, bien refermer et mélanger vigoureusement au vortex. Placer les flacons scellés dans un bain-marie à une température de 75 à 80 degrés Celsius pendant 35 minutes.

Retirer les vials du bain-marie et laisser refroidir à température ambiante. Ensuite, ajouter un millilitre d'anhydride acétique à chacun des vials réactifs de trois millilitres, bien refermer et vortexer soigneusement. Procéder ensuite à une seconde incubation dans un bain-marie à 75 à 80 degrés Celsius pendant 25 minutes.

Retirer les vials du bain-marie et laisser refroidir à température ambiante. Pour commencer la séparation et la mesure, ajouter 1,5 millilitre de dichlorométhane dans chaque tube, puis vortexer. Après avoir ajouté un millilitre d'acide chlorhydrique un molaire dans chaque vial et avoir vortexé soigneusement, laisser les solutions reposer sans perturbation jusqu'à ce que les deux phases se séparent.

Aspirez et jetez la phase aqueuse supérieure. De la même manière, à l’aide d’une pipette de 1000 microlitres, extrayez la phase organique trois fois, mais utilisez un millilitre d’eau lors de la dernière étape de lavage. Veillez particulièrement à retirer complètement toute la phase aqueuse supérieure.

Séchez la solution finale à l’aide d’un évaporateur rapide à 45 degrés Celsius ou à l’aide d’un courant d’azote gazeux, dissolvez chaque échantillon dans 300 microlitres d’acétate d’éthyle-hexane, puis transférez dans des vials ambrés de deux millilitres à bouchon vissé munis d’un insert de petit volume, et fermez hermétiquement pour la quantification analysée par chromatographie en phase gazeuse avec un détecteur à ionisation de flamme, en utilisant une colonne capillaire non polaire en silice fondue telle que DB cinq, comme indiqué dans le protocole écrit. Après l’exécution et l’analyse standard, ajustez le débit du gaz vecteur de sorte que les dérivés de l’acétol glucosamine et de l’acide mu amique éluent à 250 degrés Celsius et que le glutamine méthyl terminal éluât à 270 degrés Celsius.

Effectuez une injection de un microlitre avec un rapport de fractionnement de 30 :1, le détecteur de chromatographie en phase gazeuse étant réglé à 250 degrés Celsius, à l’aide d’un échantillonneur automatique après l’analyse par chromatographie en phase gazeuse. Enfin, procédez à la validation des dérivés en utilisant les méthodes de chromatographie et de spectrométrie décrites dans le protocole écrit. Des exemples d’analyse de la glucosamine et de l’acide urémique provenant d’étalons et d’un échantillon de sol sont présentés ici ; outre la glucosamine et l’acide muïque, deux isomères de la glucosamine, l’osamine et la galactosamine, peuvent également être déterminés simultanément par cette méthode, fondée sur la quantité exacte des étalons appliqués et les facteurs de réponse de chacun des deux étalons internes.

La quantité de ces biomarqueurs dans les échantillons de sol peut être déterminée. Le standard de récupération a également été utilisé pour surveiller qualitativement le processus de dérivation. Les schémas de formation de l'aldonitrile acétate, du dérivé de la glucosamine et de l'acide muique sont présentés ici.

Le numéro un représente la réaction de nitrile, et le numéro deux représente l'acétylation. Les structures proposées des fragments ioniques formés lors de l'ionisation par électrons ont été étudiées en comparant les spectres ioniques des échantillons préparés avec diverses incorporations d'isotopes. Ici, le décalage de masse de l'ion dominant du dérivé acétate de nitrile d'aldon de la glucosamine est montré dans différents scénarios.

Dans cet exemple, il a été préparé avec des agents non marqués ainsi qu'avec de l'anhydride acétique marqué isotopiquement et de la glucosamine marquée isotopiquement. L'étoile sur la structure chimique représente l'atome isotopique lourd ou le groupe isotopique. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir rigoureusement des conditions anhydres pendant la dérivation.

Les solvants organiques et la verrerie utilisés à cette étape doivent être secs. Bien que de nombreux fournisseurs vendent des solvants anhydres, ceux disponibles peuvent être séchés en les faisant passer à travers des colonnes contenant des réactifs déshydratants tels que le sulfate de magnésium. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la spectrométrie de masse par rapport isotopique peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la manière dont les macro-organismes réagissent, ou comment le carbone ou l'azote se renouvellent et s'accumulent dans les sols en différenciant les macro-organismes vivants et morts après leur développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la macro-écologie et de la biologie, chimie du sol, afin d'explorer la contribution des macro-organismes à la matière organique du sol et au piégeage dans les systèmes terrestres naturels ou gérés.