Surmonter Absence de réaction dans encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) souches de souris résistantes par transfert adoptif et une stimulation antigénique

L'objectif général de cette procédure est d'induire de manière constante et simple l'EAE chez n'importe quelle souche de souris, y compris celles réputées résistantes à l'induction de l'EAE. Cela est réalisé en immunisant d'abord des souris donneuses avec des protéines spécifiques de la myéline ou des antigènes peptidiques, émulsionnés dans un adjuvant complet de Freund. Dix jours plus tard, les ganglions lymphatiques des souris donneuses sont isolés et les cellules des ganglions lymphatiques sont réactivées in vitro en les cultivant avec le même antigène pendant quatre à cinq jours.

Les cellules sont ensuite transférées de façon adoptive dans des souris réceptrices naïves. Les souches de souris sensibles développeront une EAE en huit à quatorze jours afin d'induire une EAE dans une souche résistante. Quatorze jours après le transfert adoptif, les souris réceptrices sont ensuite immunisées avec un antigène dans l'adjuvant de Freund complet (CFA).

Grâce à cette méthode, l'EAE peut être induite chez des souches de souris résistantes. Le principal avantage du protocole de transfert adaptatif et de provocation pour induire l'EAE est qu'il permet une induction fiable de la maladie. Nous observons rarement moins de 100 % de maladie clinique.

Nous pouvons adapter le protocole pour induire la maladie chez des souches de souris sensibles, mais plus important encore, nous pouvons utiliser ce protocole pour induire l'EAE chez de nombreuses souches de souris auparavant considérées comme résistantes à la maladie. Démonstration des procédures. Aujourd'hui, notre chercheur principal adjoint, cha ching.

Commencez par préparer une solution de MBP à deux milligrammes par millilitre dans du PBS. Utilisez une seringue en verre munie d’un système de verrouillage pour prélever 100 microlitres de solution d’antigène par souris à immuniser.

À l’aide d’une seringue distincte, prélevez un volume égal d’adjuvant complet de Freund H 37 Ra. Ensuite, à l’aide d’un robinet trois voies, reliez les deux seringues et poussez alternativement les pistons pour mélanger l’antigène et l’adjuvant jusqu’à formation d’une émulsion. Pour vérifier que c’est bien le cas, transférez la solution dans l’une des seringues et déconnectez l’autre, vide.

Reculer légèrement le piston des seringues vides, puis expulser une goutte du mélange résiduel dans un bécher contenant de l'eau propre à température ambiante. Si la goutte se disperse, reconnecter les seringues et continuer à mélanger. Répéter le test si la goutte reste intacte et qu'une émulsion s'est formée, afin de recueillir l'émulsion.

Pour l'immunisation. Connecter une seringue en plastique d'un millilitre à la seringue en verre dont le piston a été retiré. Transférer soigneusement la solution dans la seringue en plastique en la remplissant jusqu'au bord.

Insérez ensuite le piston en plastique et expulsez une partie de l'émulsion afin qu'il reste exactement 1,2 millilitre. Il ne doit y avoir aucune bulle d'air piégée dans la seringue. Si cette procédure est effectuée correctement.

Déconnectez la seringue en plastique. Équipez-la d'une aiguille de calibre 26 et remplissez le volume mort de l'aiguille en poussant le piston jusqu'au repère d'un millilitre. Saisissez fermement le rachis cervical de la souris et maintenez la queue entre l'annulaire et l'auriculaire afin que le thorax et l'abdomen soient facilement accessibles. Par voie sous-cutanée.

Injectez 50 microlitres d'émulsion dans le thorax juste au-dessus de l'aisselle droite. Si l'injection est effectuée correctement, une petite bosse blanche sera visible au site d'injection. Répétez la procédure au-dessus de l'aisselle gauche, puis relâchez la queue et saisissez la patte droite, exposant ainsi le flanc droit de la souris.

Injectez 50 microlitres de solution juste sous la cage thoracique. Relâchez la patte droite. Tournez la souris de l'autre côté et répétez l'injection du côté gauche.

Sept à 10 jours après l'immunisation, récolter les ganglions lymphatiques des animaux euthanasiés. Placer d'abord la souris sur le dos, avec les membres étendus et fixés au plateau de dissection à l'aide d'épingles.

Pulvérisez de l'éthanol sur la souris. Ensuite, à l'aide d'outils stériles, faites une incision longitudinale dans la peau de la souris, depuis l'abdomen inférieur jusqu'au menton.

Effectuez une autre incision depuis l'abdomen jusqu'à une patte. Ensuite, faites de même sur l'autre patte. Retirez la peau de la souris et fixez-la sur la planche de dissection.

Coupez également la peau le long des quatre membres. Ensuite, retirez délicatement la partie supérieure des lambeaux de peau et fixez-les avec des épingles de chaque côté. Les ganglions lymphatiques inguinaux et axillaires, situés normalement près de l'aine ou des aisselles, doivent être visibles sous forme de petites masses opaques directement sous la peau. Utilisez deux pincettes fines pour retirer doucement le tissu conjonctif situé au-dessus du premier ganglion lymphatique.

En prenant soin de ne pas perturber les vaisseaux sanguins au cours du processus. Une fois que le tissu conjonctif a été éliminé, placer une paire de forceps sous le ganglion lymphatique et l'écarter du corps. Transférer le ganglion lymphatique dans une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant du PBS stérile et récolter les trois autres ganglions lymphatiques de la même manière.

Une fois tous les ganglions lymphatiques prélevés, transférez la boîte de Pétri dans une hotte de sécurité biologique. À l’aide de l’extrémité arrière du piston d’une seringue stérile, homogénéisez les ganglions lymphatiques afin de libérer les cellules. Pour éliminer les débris, filtrez la suspension à travers une maille en nylon dans un tube conique.

Ensuite, ajustez le volume à 50 millilitres avec du PBS stérile et centrifugez les cellules pendant 10 minutes. Après la centrifugation, resuspendez les cellules dans un petit volume de milieu de culture cellulaire préchauffé et comptez les cellules viables. Ajustez la concentration à quatre fois 10 puissance six cellules par millilitre.

Ensuite, ensemencer les cellules à raison de deux millilitres par puits dans une plaque de 24 puits. Ajouter l'antigène MVP à chaque puits afin d'obtenir une concentration finale de 100 microgrammes par millilitre. Une fois l'antigène ajouté.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant cinq jours. Une fois que les cellules ont été restimulées, les récolter en pipetant doucement de haut en bas et les transférer dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifuger les cellules à 1000 tr/min pendant 10 minutes et resuspendre le culot dans un petit volume de PBS stérile.

Ensuite, compter les cellules et ajuster la concentration de cellules viables à 2,5 × 10⁸ cellules par millilitre à l’aide de PBS. Aspirer les cellules dans une seringue et fixer une aiguille de calibre 26 pour effectuer le transfert adoptif. Injecter 0,2 millilitre de cellules par voie intraveineuse dans la queue de chaque souris afin de provoquer une réponse chez les souris résistantes des semaines après le transfert adoptif.

Injectez les animaux avec 200 microgrammes d'antigène dans un volume de 200 microlitres d'émulsion, de la même manière que l'immunisation des souris donneuses a été réalisée. Sept à 10 jours après le défi, une maladie paralytique se développera et sa progression peut être surveillée. La maladie commence par une faiblesse de la queue.

Lorsque la queue est flasque, la maladie est classée au stade un. Deux, si la souris développe une paralysie d’un membre postérieur, et trois, si les deux membres postérieurs sont paralysés. Le stade quatre correspond à une paralysie des deux membres antérieurs.

Au stade cinq, la souris est plus abondante. Et au stade six, la souris est morte. Comme indiqué ici, de sept à quatorze jours après le défi, les souris développeront une maladie paralytique monophasique, qui peut être évaluée à l'aide des critères classiques de la EAE.

Bien que les souris puissent se rétablir, elles ne feront pas de rechute spontanée. L'induction de la maladie nécessite un défi spécifique à l'antigène. Un défi avec l'adjuvant de Freund complet (CFA) seul ou avec un antigène non pertinent ne parvient pas à induire la maladie.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre la méthode de transfert adoptif et de provocation pour induire l'EAE. En combinant le transfert adoptif de cellules des ganglions lymphatiques spécifiques à un antigène avec un rappel antigénique stimulateur, il est facile d'induire l'EAE chez n'importe quelle souche de souris. Cette méthode nous permet de contourner les mécanismes de résistance propres à certaines souches de souris, et permet ainsi l'étude de la résistance à la maladie. Aussi.

Cette technique devrait pouvoir être facilement adaptée pour étudier tout processus de maladie auto-immune.