Surmonter Absence de réaction dans encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) souches de souris résistantes par transfert adoptif et une stimulation antigénique

L’objectif global de cette procédure est d’induire l’EAE de manière constante et facile dans n’importe quelle souche de souris, y compris celles réputées résistantes à l’induction de l’EAE. Ceci est accompli en immunisant d’abord les souris donneuses avec des protéines spécifiques de la myéline ou des antigènes peptidiques, émulsionnés dans un adjuvant complet de fres. 10 jours plus tard, les ganglions lymphatiques des souris donneuses sont isolés et les cellules des ganglions lymphatiques sont restimulées in vitro en les cultivant avec le même antigène pendant quatre à cinq jours.

Les cellules sont ensuite transférées adoptivement dans des souris receveuses naïves. Les souches de souris sensibles développeront l’EAE en huit à 14 jours pour déclencher l’EAE chez une souche résistante. 14 jours après le transfert adoptif, les souris receveuses ont ensuite été immunisées avec l’antigène dans le CFA.

En utilisant cette méthode, l’EAE peut être induite chez des souches de souris résistantes. Le principal avantage du protocole de transfert adaptatif et de provocation pour induire l’EAE est qu’il permet une induction fiable de la maladie. Il est rare de voir moins de 100 % de la maladie clinique.

Nous pouvons adapter le protocole pour induire la maladie et les souches de souris sensibles, mais plus important encore, nous pouvons utiliser ce protocole pour induire l’EAE dans de nombreuses souches de souris précédemment considérées comme résistantes à la maladie. Démonstration des procédures. Aujourd’hui, c’est notre associé de recherche principal, cha ching.

Commencez par préparer une solution de MBP de deux milligrammes par millilitre. Dans PBS. À l’aide d’une seringue en verre rodé munie d’un verrou à leurre, aspirer 100 microlitres de solution antigénique par souris à immuniser.

À l’aide d’une seringue séparée, prélever un volume égal d’adjuvant de Freud complet H 37 ra. Ensuite, à l’aide d’un robinet d’arrêt à trois voies, connectez les deux seringues et poussez les pistons d’avant en arrière pour mélanger l’antigène et l’adjuvant jusqu’à ce qu’une émulsion se forme. Pour vérifier que c’est le cas, transférez la solution dans l’une des seringues et débranchez la seringue vide.

Tirez les seringues vides, plongez-les légèrement vers l’arrière, puis déversez une goutte du mélange résiduel dans un bécher d’eau propre à température ambiante. Si la goutte se disperse, rebranchez les seringues et continuez à mélanger. Répétez l’essai si la goutte reste intacte et qu’une émulsion s’est formée pour recueillir l’émulsion.

Pour l’immunisation. Connectez une seringue en plastique d’un millilitre à la seringue en verre dont le piston a été retiré. Transférez soigneusement la solution dans la seringue en plastique, en la remplissant jusqu’au rebord.

Insérez ensuite le piston en plastique et expulsez un peu d’émulsion de sorte qu’il reste exactement 1,2 millilitre. Il ne doit pas y avoir de bulles d’air piégées dans la seringue. Si cette procédure est effectuée correctement.

Débranchez la seringue en plastique. Equipez-le d’une aiguille de calibre 26 et remplissez le volume vide de l’aiguille en poussant le piston jusqu’au repère d’un millilitre. Ébouriffez fermement la souris et tenez la queue entre l’annulaire et l’auriculaire afin que le thorax et l’abdomen soient facilement accessibles. Par voie sous-cutanée.

Injectez 50 microlitres d’émulsion dans le thorax juste au-dessus de l’aisselle droite. Si l’injection est effectuée correctement, un petit renflement blanc sera visible au site d’injection. Répétez la procédure au-dessus de l’aisselle gauche, puis relâchez la queue et saisissez le pied droit, en exposant le flanc droit de la souris.

Injectez 50 microlitres de solution juste en dessous de la cage thoracique. Lâchez le pied droit. Tournez la souris dans l’autre sens et répétez l’injection sur le côté gauche.

Sept à 10 jours après la vaccination. Prélever les ganglions lymphatiques d’animaux euthanasiés. Placez d’abord la souris sur le dos, les membres étirés et fixés à la planche de dissection à l’aide d’épingles.

Vaporisez la souris avec de l’éthanol. Puis à l’aide d’outils stériles. Coupez une incision longitudinale dans la peau de la souris du bas-ventre jusqu’au menton.

Faites une autre incision à partir de l’abdomen le long d’une jambe. Puis vers le bas de l’autre. Décollez la peau de la souris et épinglez-la sur la planche de dissection.

Coupez également la peau le long des quatre membres. Ensuite, décollez et fixez la partie supérieure des lambeaux cutanés avec des épingles de chaque côté, les ganglions lymphatiques inguinaux et axillaires, qui sont normalement proches de l’aine ou des aisselles, doivent être visibles sous forme de petites masses opaques directement sous la peau. À l’aide de deux pinces fines, vous enlevez délicatement le tissu conjonctif au-dessus du premier ganglion lymphatique.

En prenant soin de ne pas perturber les vaisseaux sanguins dans le processus. Une fois que le tissu conjonctif a été éliminé, placez une paire de pinces sous le ganglion lymphatique et retirez-la du corps. Transférez le ganglion lymphatique dans une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant du PBS stérile et récoltez les trois autres ganglions lymphatiques de la même manière.

Une fois que tous les ganglions lymphatiques ont été prélevés, transférez la boîte de Pétri dans une cagoule de biosécurité. À l’aide du dos d’un piston de seringue stérile. Homogénéisez les ganglions lymphatiques pour libérer les cellules afin d’éliminer les débris, filtrez la suspension à travers un treillis en nylon dans un tube conique.

Ajustez ensuite le volume à 50 millilitres avec du PBS stérile et centrifugez les cellules pendant 10 minutes. Après la centrifugation, remettre les cellules en suspension dans un petit volume de milieu de culture cellulaire préchauffé et compter les cellules viables. Ajustez la concentration à quatre fois 10 à six cellules par millilitre.

Ensuite, plaquez les cellules à deux millilitres par puits dans une plaque de 24 puits. Ajouter l’antigène MVP dans chaque puits de manière à obtenir une concentration finale de 100 microgrammes par millilitre. Une fois l’antigène ajouté.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant cinq jours. Une fois que les cellules ont été restimulées, récoltez-les en les pipetant doucement de haut en bas et transférez-les dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifugez les cellules à 1000 tr/min pendant 10 minutes et remettez la pastille en suspension dans un petit volume de PBS stérile.

Ensuite, comptez les cellules et ajustez la concentration de cellules viables à 2,5 fois 10 à la huitième cellule par millilitre avec PBS. Tirez les cellules vers le haut dans une seringue et ajustez-la avec une aiguille de calibre 26 pour effectuer le transfert adoptif. Injectez 0,2 millilitre de cellules par voie intraveineuse dans la queue de chaque souris pour défier les souris résistantes des semaines après le transfert adoptif.

Injecter aux animaux 200 microgrammes d’antigène dans un volume de 200 microlitres d’émulsion de la même manière que l’immunisation des souris donneuses a été effectuée. Sept à 10 jours après le défi, la maladie paralytique se développera et sa progression pourra être surveillée. La maladie commence par une faiblesse de la queue.

Lorsque la queue est flacide, la maladie est classée, une maladie est classée. Deux, si la souris développe une paralysie d’un membre postérieur, et trois, si les deux membres postérieurs sont paralysés. Le grade quatre est lorsque les deux membres avant sont paralysés.

En cinquième année, la souris est plus abondante. Et en sixième année, la souris est morte. Comme le montre ici, sept à 14 jours après la provocation, les souris développeront une maladie paralytique monophasique, qui peut être classée à l’aide des critères classiques de l’EAE.

Bien que les souris puissent se rétablir, elles ne rechuteront pas spontanément. L’induction de la maladie nécessite un défi spécifique à l’antigène. La provocation avec l’AFC seul ou un antigène non pertinent ne permet pas de provoquer la maladie.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la méthode de transfert adoptif et de provocation pour induire l’EAE. En combinant le transfert adaptatif de cellules ganglionnaires spécifiques de l’antigène avec un défi antigénique stimulant, on peut facilement induire l’EAE dans n’importe quelle souche de souris. Cette méthode nous permet de s’affranchir des mécanismes de résistance inhérents à certaines souches de souris, et permet donc d’étudier la résistance aux maladies. Aussi.

Cette technique devrait être facilement adaptée pour étudier tout processus de maladie auto-immune.