Name: Simple Dispositifs microfluidiques pour In vivo Imagerie des C. elegans, Drosophila Et le poisson-zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Apprenez à fabriquer des dispositifs microfluidiques simples pour l'imagerie in vivo sans anesthésie de C. elegans, Drosophila et poisson-zèbre. Cette méthode utilise une membrane PDMS déformable pour immobiliser les organismes.

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Nous remercions le Dr Ray Krishanu pour les stocks de drosophile, Tarjani Agarwal pour maintenir un Drosophila cage, Peter Juo pour nuIs25 et CGC pour C. souches elegans. SPK fait jsIs609 dans le laboratoire de Michael Nonet l&#39;. Nous remercions Arpan Agnihotri (BITS Pilani) pour son aide dans imagerie time-lapse de transport mitochondries des animaux jsIs609 dans des dispositifs microfluidiques. Nous sommes reconnaissants au Dr Vatsala Thirumalai et Surya Prakash pour nous fournir des embryons de poisson zèbre. Nous remercions le Dr Krishna et CIFF au SPNE pour l&#39;utilisation du microscope confocal à disque rotatif soutenu par le Ministère de la Science et de la Technologie, Centre de nanotechnologie (n ° SR/55/NM-36-2005). Nous remercions également Kaustubh Rau, V. Venkatraman et Chetana Sachidanand pour les discussions. Ce travail a été financé par la DBT bourse post-doctorale (SM), l&#39;heure d&#39;été accélérée régime (SM) et une subvention de la TCD (SPK). SA a été soutenue par des subventions DST et le CSIR à SPK.

1. SU8 Fabrication Maître <ol><li> Concevoir les structures microfluidiques utilisant le logiciel Clewin et l&#39;imprimer en utilisant 65.024 traceur laser DPI avec taille minimum de 8 um sur le film du circuit imprimé. </li><li> Nettoyer 2 cm X 2 cm de plaquettes de silicium avec oxyde natif dans 20% KOH pour 1 min et rincer à l&#39;eau déminéralisée; une plaquette pour chaque couche de l&#39;écoulement et sa couche de contrôle correspondant. </li><li> Sécher les pièces avec de l&#39;azote gazeux et déshydrater sur une plaque chauffante à 120 ° C pendant 4 heures. Permettre aux pièces de se refroidir à la température ambiante avant de procéder à l&#39;étape suivante. </li><li> Morceaux de silicium lieu une à la fois sur le métier à filer et tourner mandrin sur le vide. Couvrir les surfaces de silicium avec ~ 20 pl hexaméthyldisilazane (HMDS) et les enrober à l&#39;aide d&#39;un. SPIN150 centrifugeuse à 500 tours par minute pendant 5 secondes puis 3.000 tours par minute pendant 30 sec </li><li> Couvrir des tranches de silicium complètement avec ~ 1,5 ml de SU8-2025 ( <a href="http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm" target="_blank">http://</a>www.microchem.com/Prod-SU82000.htm) et des plaquettes en utilisant le manteau SPIN150 centrifugeuse à 500 tours par minute pendant 5 secondes puis 2.000 tours par minute pendant 30 sec. Ce protocole de filage produit une épaisseur de photoréserve ~ 40 um qui est approprié pour la commande d&#39;écoulement et les couches pour les premiers stades larvaires de C. elegans. </li><li> ~ 1,5 ml de spin SU8-2050 en utilisant SPIN150 centrifugeuse à 500 tours par minute pendant 5 secondes puis 2.000 tours par minute pendant 30 secondes pour obtenir une épaisseur de résine photosensible ~ 80 um qui est adapté à la fabrication de la couche d&#39;écoulement de fin stades larvaires de C. elegans, la couche basale de débit pour Drosophila / poisson zèbre larves et leurs niveaux de contrôle correspondants. </li><li> Placez les morceaux de silicium sur plaque chauffante avec la couche SU8 couché sur le dessus. Souple cuire les morceaux de silicium recouvertes à 65 ° C pendant 1 min, puis 95 ° C pendant 10 min. Permettre aux pièces de se refroidir à la température ambiante avant de procéder à l&#39;étape suivante. </li><li> Placez les morceaux de silicium soft-cuits sur la scène d&#39;exposition avec SU8-2025 sur enduitface sur la face supérieure de la lampe UV. Utilisez le masque de photo avec la conception I (L1, figure 1B) et de la conception II (L2, figure 1B) pour la couche d&#39;écoulement et motif de couche de contrôle respectivement pour les premiers stades larvaires de C. elegans. Placer le masque photo sur le dessus de la couche de SU8 et assurer le masque est à plat contre la couche de revêtement. Ouvrez le volet de la lampe UV et d&#39;exposer les SU8 soft-cuits plaquettes à 200 Watt Lampe UV à travers le masque photo pendant 15 sec. </li><li> Utilisez le masque de photo avec la conception I (L1, figure 1B) et de la conception II (L2, figure 1B) sur SU8-2050 pièces revêtues (préparé à l&#39;étape 1.6) pour la fabrication de la couche d&#39;écoulement et de la couche de contrôle pour fin stades larvaires de C. elegans. Utiliser le masque photo avec le motif (L1, figure 1C) I et II de conception (L2, figure 1C) pour le débit de la couche basale et la couche de contrôle respectivement pour la drosophile / poisson zèbre larves sur des plaquettes revêtues de SU8-2050 (i préparéEtape n 1,6). Exposer les surfaces SU8 à travers le masque photo pour la lampe UV de 200 watts pendant 15 secondes. </li><li> Placer les morceaux de silicium exposées sur une plaque chauffante avec la couche enduite sur le dessus. Déposer cuire les tranches à 65 ° C pendant 1 min suivie de 95 ° C pendant 10 min. Permettre aux pièces de se refroidir avant de procéder à l&#39;étape suivante. </li><li> Développer les pièces en utilisant la solution SU8 développeur pendant 20 min. Rincer les morceaux dans de l&#39;alcool isopropylique (IPA) et sécher à l&#39;aide de l&#39;azote gazeux. </li><li> Placer les morceaux de silicium dans un dessicateur avec le motif sur le dessus SU8. Enduire les morceaux avec 50 pl de trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyle) silane vapeur dans un dessiccateur pendant 2 heures. </li></ol> Précautions: Prendre les précautions pour manipulation des produits chimiques au cours du traitement KOH, revêtement de résine photosensible et en développement. Silane revêtement en phase vapeur doit être effectué à l&#39;intérieur d&#39;un dessiccateur dans un endroit aéré. Protéger résine SU8 de plus de l&#39;exposition à la lumière. Utilisez des lunettes de protection UV avec une ligsource de ht. 2. Fabrication de moules PDMS <ol><li> Préparer 10:01 PDMS en combinant 50 g de Sylgard 184 de base avec 5 g de durcisseur dans un gobelet en plastique. Mélanger manuellement le contenu de ~ 3 min. Dégazer le mélange à l&#39;intérieur d&#39;un dessiccateur pour éliminer toutes les bulles d&#39;air formées pendant le mélange. </li><li> Versez un mélange de 5 mm d&#39;épaisseur PDMS sur les plaquettes de silicium avec SU8 modèle de conception II, pour la couche de contrôle, doucement pour éviter la formation de bulles d&#39;air. Dans le cas où des bulles se forment lors de la coulée, dégazer le PDMS sur le modèle SU8 dans le vide bas pour enlever toutes les bulles. </li><li> Placer les tranches de silicium avec SU8-2025 modèle de conception que j&#39;ai, pour la couche d&#39;écoulement, sur le mandrin spinner et allumez le vide pour les retenir. Couvrir les plaquettes avec ~ 1 ml de mélange PDMS et enrober les pastilles à l&#39;aide SPIN150 centrifugeuse à 500 tours par minute pendant 5 secondes puis 1.500 tours par minute pendant 30 sec. </li><li> ~ 1 ml manteau PDMS mélange sur des tranches de silicium avec l&#39;um 80 SU8-2050 modèle de conception I (L1, figure 1B), pour lacouche d&#39;écoulement pour fin stades larvaires de C. elegans en utilisant la centrifugeuse SPIN150 à 500 tours par minute pendant 5 secondes puis 1.000 tours par minute pendant 30 sec. Enduire une couche épaisse de mélange PDMS sur les morceaux de silicium avec SU8-2050 modèle de flux de couche de dessin I (L1, figure 1C) pour Drosophila / poisson-zèbre, en utilisant des larves SPIN150 centrifugeuse à 500 tours par minute pendant 35 sec. </li><li> Cuire des morceaux de PDMS avec revêtement en silicone de conception I et plaquettes avec un design correspondant II pour le contrôle de la couche contenant PDMS pour C. larves elegans et / ou la drosophile / poisson zèbre dans un four à convection d&#39;air chaud à 50 ° C pendant 6 heures. </li><li> Découper la pièce à partir de PDMS contenant le substrat de silicium du motif de SU8 C. II elegans et / ou la drosophile / poisson zèbre larves à l&#39;aide d&#39;une lame tranchante. Percer un trou de petit diamètre de ~ 1 mm au-dessus du réservoir principal reliant le piège dans le moule PDMS en utilisant un perforateur Harris. </li><li> Placez le poing PDMS bloc (contenant le moule 40 um d&#39;épaisseur pour le contrôlecouche L2) sur un plateau en matière plastique, moulé avec le côté de la couche de commande vers le haut. Placez la tranche de silicium revêtue PDMS contenant des 40 um d&#39;épaisseur SU8 conception que j&#39;ai sur le même plateau, avec le PDMS surface enduite orientée vers le haut. Insérez le bac dans la chambre de nettoyeur à plasma et mettez le vide pendant 2 min. Par la suite, la mise sous tension du plasma et abaisser la pression dans la chambre jusqu&#39;à ce que la chambre vire au rose pâle. Exposer les deux surfaces à 18 Watt air par plasma sous vide basse pendant 2 min. </li><li> Placez le bloc de poing PDMS retiré les 80 um d&#39;épaisseur SU8 maître modèle contenant II pour la fin stades larvaires de C. elegans ou larves de Drosophila / poisson zèbre sur un plateau en matière plastique, moulé avec le côté de la couche de commande vers le haut. Placez le correspondant de spin cuite couche de PDMS déposé sur la plaquette de silicium contenant 80 um d&#39;épaisseur conception I pour plus tard C. étapes elegans ou la drosophile / poisson zèbre larves simultanément sur ​​le même plateau avec le plat recouvert PDMS surface vers le haut. Utiliser le même protocole mentionné ci-dessus pour les exposer à l&#39;air plasma. </li><li> Placez les deux surfaces de plasma traités pour C. elegans et / ou la drosophile / poisson zèbre larves avec une légère pression et faites cuire au four les convection d&#39;air chaud à 50 ° C pendant 2 heures. </li><li> Découper les dispositifs asservis du substrat de silicium avec SU8 conception de C. I elegans et / ou la drosophile / poisson zèbre larves. Perforation des trous d&#39;accès à des réservoirs d&#39;entrée et de sortie du canal d&#39;écoulement. </li><li> Placer le moule PDMS collé sur un plateau en plastique pour C. elegans, avec le côté moulé de la conception de la couche d&#39;écoulement vers le haut. Clean lamelle de verre (22 X 22 mm, épaisseur n ° 1) et le placer sur le même plateau en plastique. Insérez le bac contenant moule PDMS et lamelle de verre à l&#39;intérieur de la chambre à plasma. Exposer la surface inférieure du dispositif de PDMS et lamelle de verre de 18 Watt plasma d&#39;air à basse pression pendant 2 min. Placez les deux surfaces de plasma traités avec gentle la pression et faire cuire au four les convection d&#39;air chaud à 50 ° C pendant 2 heures. </li><li> Stocker l&#39;appareil dans un environnement propre pour une utilisation future. </li></ol> 3. Étapes supplémentaires pour la drosophile / Zebrafish périphérique <ol><li> Exposer la surface de verre propre de taille 2 cm x 2 cm avec 50 pl de trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyle) silane vapeur dans un dessiccateur pendant 2 heures. </li><li> Spin ~ 1 ml de 10:1 mélange PDMS préparé à l&#39;étape 2.1, la surface du verre silanisé utilisant SPIN150 spinner à 500 tours par minute pendant 35 sec. Cuire les substrats de verre revêtus PDMS dans un four à air chaud à 50 ° C pendant 6 heures avec la surface revêtue vers le haut. Permettre à la couche de PDMS refroidir à température ambiante avant de procéder à l&#39;étape suivante. </li><li> Poinçon la couche de revêtement à l&#39;aide d&#39;un perforateur personnalisé construit en métal pointu au milieu du PDMS, pour former la couche d&#39;espacement PDMS. La forme du poinçon métallique est conçu semblable à la conception de flux de Drosophila / poisson zèbre (L1, figure 1C </strong&gt;). </li><li> Exposer la couche d&#39;espacement PDMS et l&#39;unique lié bloc (débit de la couche et la couche de contrôle, effectuée à l&#39;étape 2.9 pour Drosophila / poisson zèbre larves) à 18 watts d&#39;air plasma en utilisant nettoyeur à plasma à faible vide. Placez les deux surfaces de plasma traités ensemble et les faire cuire dans un four à air chaud à 50 ° C pendant 2 heures. </li><li> Couper le dispositif lié à partir de la vitre, les trous d&#39;accès à poinçonner les réservoirs d&#39;entrée et de sortie et elle liaison à une lamelle de verre (22 X 22 mm, épaisseur n ° 1) en utilisant un filtre à plasma tel que mentionné dans l&#39;étape 2,11. Cela permettrait de produire un dispositif d&#39;immobilisation pour les larves de premier stade drosophile avec une hauteur de canal de ~ 500 um. Pour embryons de poisson zèbre, dupliquez le calque entretoise PDMS procédé de fabrication d&#39;une étape de liaison supplémentaire. La double couche de PDMS-S produit une hauteur de canal de 900 um pour 30 hfp poisson zèbre larves. </li></ol> Précautions: Eviter les particules de poussière lors de la fabrication du dispositif. Deux plasma nettoyé la surfaces doivent être complètement exempte de poussière pour une bonne adhérence. Stocker les appareils dans un dessiccateur dans les situations où une salle spéciale propre n&#39;est pas disponible de manière à minimiser l&#39;accumulation de particules de poussière dans les appareils. 4. Utilisation PDMS Membrane <ol><li> Connecter une extrémité d&#39;un tube de micro-flex (diamètre intérieur ~ 1,6 mm, diamètre extérieur 4,8 mm ~) à un régulateur d&#39;alimentation en azote gazeux sous pression et l&#39;autre extrémité au réservoir principal de collecteur à travers une aiguille de calibre 18 (diamètre extérieur ~ 1,25 mm) collé au tube. Un robinet 3-voies utilisées dans le milieu de la connexion du tube permet l&#39;application ou la libération de la pression sur la membrane. </li><li> Remplir le tube relié au dispositif de PDMS avec une colonne de 10 cm d&#39;eau distillée avant de le raccorder au réservoir de la trappe principale d&#39;un C. elegans et / ou de larves de drosophile / poisson zèbre. </li><li> Activer la soupape de la fourniture d&#39;azote à 14 psi lire et contrôler la membrane du piège principal de déviation vers èmee canal d&#39;écoulement à faible grossissement d&#39;un microscope inversé. Longueur de la colonne d&#39;eau dans le tube de micro-flex est comprimé lorsque le robinet à 3 voies est ouverte. Bords de la membrane dévié, sont visibles en lumière transmise (figure 1I et 1J). Déviation membrane provoque un déplacement des particules de poussière / bulles sous la membrane de PDMS et les pousse aux limites du canal. </li><li> Attendez que le liquide remplit avant le microcanal complètement sans bulles d&#39;air. </li><li> Relâcher la pression à l&#39;aide du robinet 3-voies pour détendre la membrane à sa position de repos. </li></ol> 5. Insertion C. Les larves elegans, la drosophile et le poisson-zèbre dans l&#39;appareil et les immobiliser sous la membrane flexible PDMS <ol><li> Remplir le canal d&#39;écoulement avec un tampon M9 [3 g KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4, H 2 O à 1 L, stériliser par autoclaving] pour C. elegans 18 ou 1X PBS [8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4, 0,24 g de KH 2 PO 4, H 2 O à 1 L, stériliser à l&#39;autoclave] pour Drosophila / 19 pour le poisson-zèbre larves 10 min avant un expérience. </li><li> Localiser un seul C. elegans de passage obligé sur une plaque NGM 18 (ou larves de premier stade drosophile de la plaque de gélose oeuf ou manuellement dechorionated 30 larves du poisson zèbre hpf en milieu liquide 20) à l&#39;aide d&#39;un microscope stéréo à faible grossissement. Choisissez un seul animal en utilisant un petit volume de solution tampon dans un embout micro. Utiliser un embout de micro avec son extrémité coupée pour accueillir plus la drosophile ou poisson zèbre dans le tampon. </li><li> Poussez le seul organisme à travers l&#39;entrée du canal d&#39;écoulement. Régler la pression de pipetage pour positionner l&#39;animal individuel dans le piège principal. </li><li> Augmenter la pression de la membrane de PDMS lentement à la position de l&#39;animal contre la chanfrontière nel et l&#39;immobiliser avec 14 psi pour C. elegans, 7 psi pour la drosophile et 3 psi pour les larves de poisson zèbre. </li><li> Positionner l&#39;animal immobilisé au centre du champ de vision microscopique. Utiliser un microscope inversé au niveau désiré pour le champ lumineux haute résolution ou l&#39;imagerie par fluorescence. Acquérir une ou time-lapse images de fluorescence à la cadence prédéfinie. </li><li> Relâcher la pression piège et contrôler la locomotion de l&#39;animal pendant 5-10 min à faible grossissement. </li><li> Rincer l&#39;animal et insérer un animal frais de répéter les étapes ci-dessus. </li><li> Lavez tous les animaux à partir du réservoir de déchets en utilisant de l&#39;eau distillée appliqué à l&#39;aide d&#39;une seringue. Sécher le canal en poussant l&#39;air à l&#39;aide d&#39;une seringue pour une réutilisation ultérieure. </li></ol> Précautions: Animaux nécessitant une pression élevée de pipetage à l&#39;écoulement à l&#39;intérieur du canal principal tendent à montrer locomotion pauvre / santé après la libération du piège et doivent être évités pour imaGing. Nettoyer le canal d&#39;écoulement pour toute trace de tampon pour éviter le colmatage du canal par les cristaux. Si l&#39;huile est utilisée pour l&#39;imagerie haute résolution, nettoyer la lamelle de verre pour être en mesure de maintenir un bon signal sur bruit pour les expériences ultérieures.

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<li>Fatouros, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+tau+aggregation+in+a+novel+Caenorhabditis+elegans+model+of+tauopathy+mitigates+proteotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Inhibition of tau aggregation in a novel Caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity.</a> Hum. Mol. Genet. , (2012).</li>
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<li>Kumar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+Kinesin-3+motor+UNC-104%2FKIF1A+is+degraded+upon+loss+of+specific+binding+to+cargo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo.</a> PLoS Genet. 6, e1001200(2010).</li>
<li>Ou, G., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signatures+of+cell+migration+in+C.+elegans+Q+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular signatures of cell migration in C. elegans Q neuroblasts.</a> J. Cell. Biol. 185, 77-85 (2009).</li>
<li>Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+vesicle+motion+and+release+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Nat. Protoc. 2, 1117-1125 (2007).</li>
<li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+bidirectional+mitochondrial+transport+is+coordinated+with+axonal+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth.</a> J. Cell. Sci. 104, 917-927 (1993).</li>
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<li>Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-1+and+Dynein+are+the+primary+motors+for+fast+transport+of+mitochondria+in+Drosophila+motor+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dispositifs microfluidiques en PDMS sont optiquement transparents peuvent donc être utilisés pour une grande résolution imagerie in vivo de tout organisme modèle transparent / translucide. Notre modèle est approprié pour un grossissement spatio-temporelle d&#39;imagerie élevé d&#39;événements cellulaires et sous-cellulaires intactes dans les animaux vivants. En utilisant des techniques de microfabrication de lithographie douce permet une manipulation aisée des dimensions de l&#39;appareil pour les différentes t...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Plaquettes de silicium </td><td> Plaquette Université </td><td> 150 mm (100) Mech année SSP Si </td><td></td></tr><tr><td> Clewin Software </td><td> WieWeb logiciel </td><td> Version 2.90 </td><td></td></tr><tr><td> Traceur laser </td><td> Imagerie Fine Line </td><td> 65024 DPI </td><td></td></tr><tr><td> HMDS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 440191-100ML </td><td></td></tr><tr><td> SU8 </td><td> Microchem </td><td> SU8-2025, SU8-2050 </td><td></td></tr><tr><td> Promoteur </td><td> Microchem </td><td> SU8 développeur </td><td></td></tr><tr><td> Silane </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448931-10G </td><td></td></tr><tr><td> PDMS </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 </td><td></td></tr><tr><td> Lampe UV </td><td> Oriel </td><td> 66943 </td><td> 200W Hg. Oriel Lumière </td></tr><tr><td> Four à air chaud </td><td> Instruments Ultra </td><td> Sur mesure </td><td> Fixée à 50 ° C </td></tr><tr><td> Plaque de cuisson </td><td> Équipement de laboratoire IKA </td><td> 3810000 </td><td> <a href="http://www.ika.com" target="_blank">http://www.ika.com</a> </td></tr><tr><td> Nettoyeur à plasma </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-32G </td><td></td></tr><tr><td> Fileur </td><td> Systèmes de production de semi-conducteurs </td><td> SPIN150-NPP </td><td> <a href="http://www.SPS-Europe.com" target="_blank">www.SPS-Europe.com</a> </td></tr><tr><td> Lamelle de verre </td><td> Sceau d&#39;or </td><td> 22 X 22 mm, épaisseur n ° 1 </td><td></td></tr><tr><td>C. elegans </td><td> Caenorhabditis Genetics Center (CGC) </td><td> E1265, ayIs4 </td><td></td></tr><tr><td> Drosophila </td><td> Bloomington </td><td> P {} chaGAL4 / cyo, SAMU-syt.eGFP </td><td></td></tr><tr><td> Le poisson zèbre </td><td> Indien de type sauvage </td><td> De type sauvage </td><td></td></tr><tr><td> Tube de Tygon </td><td> Sigma </td><td> Z279803 </td><td></td></tr><tr><td> Micro-aiguille </td><td> Sigma </td><td> Z118044 </td><td> Coupez-les en morceaux de 1 cm </td></tr><tr><td> 3-way robinet </td><td> Sigma </td><td> S7521 </td><td></td></tr><tr><td> Puncheur Harris </td><td> Sigma </td><td> Z708631 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;azote gazeux comprimé </td><td> Fournisseur de gaz local </td><td></td><td> Utiliser un régulateur pour réguler la pression </td></tr><tr><td> Microscope stéréoscopique &lt;/ Td&gt; <td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope confocal </td><td> Andor et Olympus </td><td> Yokogawa rotation du disque microscope confocal </td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> National Institutes of Health </td><td> <a href="http://www.rsbweb.nih.gov/ij" target="_blank">www.rsbweb.nih.gov / ij</a> </td><td> Basé sur Java programme de traitement d&#39;image </td></tr></tbody></table>

simple dispositifs microfluidiques pour<em&gt; in vivo</em&gt; imagerie des<em&gt; c. elegans</em&gt;,<em&gt; drosophila</em&gt; et le poisson-zèbre

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabriqués dispositifs fluidiques fournir un accès micro-environnement pour les études in vivo sur de petits organismes. Procédés de fabrication simples sont disponibles pour dispositifs microfluidiques utilisant des techniques de lithographie douce 1-3. Dispositifs microfluidiques ont été utilisés pour les sous-imagerie cellulaire 4,5, in vivo microchirurgie au laser et imagerie cellulaires 2,6 4,7. L&#39;imagerie in vivo nécessite l&#39;immobilisation des organismes. Ceci a été réalisé en utilisant une aspiration 5,8, 6,7,9 canaux coniques, des membranes déformables, 2-4,10 aspiration avec refroidissement supplémentaire 5, gaz anesthésique 11, gels sensibles à la température 12, 13 et colle cyanoacrylate anesthésiques tels que le lévamisole 14 , 15. Anesthésiques couramment utilisés influencer la transmission synaptique 16,17 et sont connus pour avoir des effets néfastes sur la sous-cellulaire 4 transport neuronal. Dans cette èreudy nous démontrons une membrane à base de poly-diméthyl-siloxane (PDMS) dispositif qui permet l&#39;immobilisation sans anesthésie intactes organismes modèles génétiques telles que Caenorhabditis elegans (C. elegans), larves de drosophile et les larves de poisson zèbre. Ces organismes modèles sont adaptés pour des études in vivo dans des dispositifs microfluidiques en raison de leurs faibles diamètres et des organismes optiquement transparents ou translucides. Diamètres de corps vont de ~ 10 um à 800 um ~ pour les premiers stades larvaires de C. larves elegans et le poisson zèbre et nécessitent des dispositifs microfluidiques de tailles différentes pour atteindre une immobilisation complète pour la résolution imagerie time-lapse élevé. Ces organismes sont immobilisés en utilisant la pression appliquée par l&#39;azote gazeux comprimé à travers une colonne de liquide et imagée à l&#39;aide d&#39;un microscope inversé. Animaux libérés du piège de revenir à la locomotion normale dans les 10 min. Nous démontrons quatre applications imagerie time-lapse en C. elegansnommément imagerie mitochondriale de transport dans les neurones, le transport vésiculaire présynaptique dans un transport défectueux mutant, le transport des récepteurs du glutamate et de la division cellulaire Q neuroblastes. Les données obtenues à partir de ces films montrent que l&#39;immobilisation microfluidique est un moyen utile et précise de l&#39;acquisition de données in vivo d&#39;événements cellulaires et sub-cellulaires par rapport aux animaux anesthésiés (figure 1J et 3C-F 4). Dimensions de l&#39;appareil ont été modifiées pour permettre imagerie time-lapse de différents stades de C. elegans, Drosophila larves de premier stade et les larves de poisson zèbre. Transport de vésicules marquées par synaptotagmine marqués à la GFP (syt.eGFP) dans les neurones sensoriels montre mouvement dirigé des marqueurs de vésicules synaptiques cholinergiques exprimés dans les neurones sensoriels de larves de premier stade intacte chez la drosophile. Un dispositif similaire a été utilisée pour effectuer imagerie time-lapse de battement de coeur dans ~ 30 heures après la fécondation (HPF)poisson-zèbre larves. Ces données montrent que les dispositifs simples que nous avons développées peuvent être appliquées à une variété de systèmes modèles pour étudier les phénomènes cellulaires plusieurs biologiques et de développement in vivo.

Le dispositif d&#39;immobilisation est un bloc bicouche PDMS fabriqué par collage de deux couches: une couche d&#39;écoulement (couche 1) et une couche de commande (couche 2) comme le montre la Figure 1. Le piège principal est connecté à une bouteille de gaz azote à travers un détendeur et une vanne d&#39;arrêt 3-voies nécessaires pour appliquer (3-14 livres par pouce carré) de pression sur la membrane à travers une colonne de liquide (figure 1A). La membrane dévié immobilise C.</em...

Un dispositif simple microfluidique a été développé pour effectuer anesthésie gratuit<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie de<em&gt; C. elegans</em&gt;, Intact<em&gt; Drosophila</em&gt; Larves et des larves de poisson zèbre. Le dispositif utilise une membrane déformable PDMS pour immobiliser ces organismes modèles pour effectuer une imagerie laps de temps de nombreux procédés tels que battement de coeur, la division cellulaire et subcellulaire de transport neuronale. Nous démontrons l&#39;utilisation de cet appareil et de montrer des exemples de différents types de données collectées à partir des systèmes de modèles différents.

Simple Dispositifs microfluidiques pour<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Et le poisson-zèbre

Les dispositifs fluidiques microfabriqués offrent un microenvironnement accessible pour les études in vivo sur de petits organismes. Des processus de fabrication simples sont...

Bonjour, je suis Shamal, chercheur postdoctoral au sein de TUR Kika au Centre national des sciences biologiques en Inde. Dans cette vidéo, je vais vous montrer comment fabriquer un dispositif microbien à l’aide de techniques de lithographie souple dans un environnement de laboratoire classique. J’utiliserai ces dispositifs pour réaliser des imageries cellulaires et subcellulaires à haute résolution d’organismes modèles génétiques.Le protocole actuel permettra aux chercheurs d'effectuer cet examen d'imagerie en laps de temps sur des organismes intacts non anesthésiés. Commençons donc. Nous avons mis au point un dispositif microphonique simple permettant d'effectuer une imagerie in vivo sans anesthésie sur des organismes modèles génétiques tels que la *C. elegans*, l'*Oph* intact et le poisson-zèbre de laboratoire.Dans cette étude, nous démontrons un dispositif de mobilisation claire basé sur une membrane, fabriqué par moulage doux de PDMS. Afin d'immobiliser un organisme unique, nous localisons un animal individuel sous un microscope stéréo et prélevons l'animal à l'aide d'une petite goutte de solution tampon à l'aide d'une micropipette, insérons l'animal individuel dans le canal d'

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Numérisation Transmission à grande échelle Electron Microscopy (Nanotomy) de santé et de blessés Zebrafish cerveau

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Nouveaux outils pour la recherche de mécanobiologie sont nécessaires pour comprendre les contraintes mécaniques comment active des voies biochimiques et suscite des réactions biologiques. Ici, nous présentons une nouvelle méthode de stimulation mécanique sélective des animaux immobilisée avec un piège de microfluidique permettant l’imagerie à haute résolution des réponses cellulaires.

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Dans cet article, nous démontrons imagerie direct des individuels vers employant un dispositif microfluidique personnalisé. Dans l’appareil, vers plusieurs sont individuellement limités afin de séparer les compartiments, qui permettent des multiplexe surveillance longitudinale des divers processus biologiques.

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Le protocole décrit une conception simple de puces microfluidiques et une méthodologie de microfabrication utilisées pour cultiver C. elegans en présence d’un approvisionnement alimentaire continu jusqu’à 36 heures. Le dispositif de croissance et d’imagerie permet également une imagerie intermittente à haute résolution à long terme des processus cellulaires et sous-cellulaires pendant le développement pendant plusieurs jours.

Une puce microfluidique simple pour la croissance à long terme et l’imagerie de Caenorhabditis elegans

Nous faisons la démonstration d’une méthode qui tire parti de la microscopie confocale à balayage rapide pour effectuer une imagerie en direct des cellules microgliales dans le tectum optique du poisson-zèbre en développement, permettant ainsi l’analyse de la dynamique de ces cellules in vivo.

Imagerie en direct et caractérisation de la dynamique de la microglie chez l’embryon de poisson-zèbre

Une méthode innovante de fabrication de dispositifs microfluidiques à l’aide de la stratification en polyéthylène téréphtalate (PET) réduit considérablement le coût et la complexité du piégeage et de l’imagerie de plusieurs embryons de poisson-zèbre vivants.

Conceptions microfluidiques de laminage de polyéthylène téréphtalate à faible coût pour l’imagerie multiplexée du poisson-zèbre

Les RASopathies sont des syndromes génétiques multisystémiques causés par l’hyperactivation de la voie RAS-MAPK. Des variants potentiellement pathogènes en attente de validation émergent en permanence alors que de mauvaises preuves précliniques limitent le traitement. Ici, nous décrivons notre protocole in vivo pour tester et valider les niveaux d’activation ERK associés à RASopathy et sa modulation pharmacologique au cours de l’embryogenèse par imagerie FRET en direct chez le poisson-zèbre...

Un protocole efficace pour évaluer la modulation de l’activité ERK dans des modèles précoces de poisson zèbre du syndrome de Noonan via la microscopie FRET en direct et l’immunofluorescence

Ce protocole décrit l’imagerie microfluidique de C. elegans tout au long du développement post-embryonnaire.

Imagerie haute résolution de C. elegans à tous les stades larvaires

Apprenez à fabriquer des dispositifs microfluidiques simples pour l'imagerie in vivo sans anesthésie de C. elegans, Drosophila et poisson-zèbre. Cette méthode utilise une membrane PDMS déformable pour immobiliser les organismes.

Simple Dispositifs microfluidiques pour

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