Simple Dispositifs microfluidiques pour

Bonjour, je suis Shamal, chercheur postdoctoral au sein de TUR Kika au Centre national des sciences biologiques en Inde. Dans cette vidéo, je vais vous montrer comment fabriquer un dispositif microbien à l’aide de techniques de lithographie souple dans un environnement de laboratoire classique. J’utiliserai ces dispositifs pour réaliser des imageries cellulaires et subcellulaires à haute résolution d’organismes modèles génétiques.

Le protocole actuel permettra aux chercheurs d'effectuer cet examen d'imagerie en laps de temps sur des organismes intacts non anesthésiés. Commençons donc. Nous avons mis au point un dispositif microphonique simple permettant d'effectuer une imagerie in vivo sans anesthésie sur des organismes modèles génétiques tels que la *C. elegans*, l'*Oph* intact et le poisson-zèbre de laboratoire.

Dans cette étude, nous démontrons un dispositif de mobilisation claire basé sur une membrane, fabriqué par moulage doux de PDMS. Afin d'immobiliser un organisme unique, nous localisons un animal individuel sous un microscope stéréo et prélevons l'animal à l'aide d'une petite goutte de solution tampon à l'aide d'une micropipette, insérons l'animal individuel dans le canal d'écoulement et l'immobilisons sous la membrane PTMS. À l'aide d'une connexion de gaz azote sous pression via un robinet sphérique à trois voies.

Concevez les microstructures fredic à l'aide d'un logiciel de nettoyage. Nettoyez des tranches de silicium de deux centimètres sur deux centimètres dans une solution de 20 % de KH pendant une minute et rincez à l'eau DI. Séchez les échantillons à l'aide d'azote gazeux et déshydratez-les à 122 °C pendant quatre heures.

Faire tourner le métal Spinco hexa sur des morceaux de silicium à 500 tr/min pendant cinq secondes et à 3000 tr/min pendant 30 secondes. Faire tourner le Spinco SU 8 2 0 2 5 sur des tranches de silicium à 500 tr/min pendant cinq secondes et à 2000 tr/min pendant 30 secondes. Effectuer une cuisson douce des morceaux de silicium recouverts à 65 degrés Celsius pendant une minute et à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Exposer les plaquettes recouvertes de SU8 cuites à une lampe UV de 200 watts à travers le masque photolithographique, respectivement pour la conception un et la conception deux destinées à la couche de flux et à la couche de contrôle. Effectuer une cuisson postérieure des plaquettes à 65 degrés Celsius pendant une minute, puis à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Développer les pièces à l’aide de la solution révélatrice SUA pendant 20 minutes.

Codez les pièces avec des vapeurs de trichlorotrifluorocétalène dans un dessiccateur pendant deux heures. Mélangez la base de polydiméthylsiloxane et l'agent de réticulation dans un rapport de 10 à 1 en poids. Débarrassez le mélange des bulles d'air en effectuant une dégazéification après le mélange.

Verser un mélange de PDMS d'une épaisseur de cinq millimètres sur des tranches de silicium comportant un motif de conception avec poids SC. Deux doucement afin d'éviter la formation de bulles d'air. Appliquer une couche uniforme de PDMS sur les tranches de silicium avec le motif de conception un pour la couche d'écoulement à 500 tr/min pendant cinq secondes et 1 500 tr/min pendant 30 secondes par centrifugation.

Faites cuire les deux pièces du design un et du design deux contenant du PDMS à 50 degrés Celsius pendant six heures. Découpez la pièce en PDMS à partir du substrat en silicium à l’aide d’une lame sub contenant le motif SCH deux. Percez un petit trou au-dessus du réservoir reliant le piège principal dans le moule en PDMS.

À l’aide d’une aiguille de calibre 18 ou d’un outil de perforation de calibre équivalent. Exposer la surface inférieure de la couche de commande et la surface supérieure de la couche d’écoulement à un plasma d’air à 18 W pendant deux minutes. Placer les deux surfaces traitées au plasma l’une contre l’autre avec une pression douce, puis incuber à 50 degrés Celsius pendant deux heures.

Découper les dispositifs liés du substrat en silicium présentant le design SUH un et percer des trous d'accès aux réservoirs d'entrée et de sortie du canal d'écoulement. Exposer le PD inférieur du dispositif et un couvercle en verre propre. Exposer à un plasma d'air à 18 volts pendant deux minutes.

Placez les deux surfaces traitées au plasma avec une pression légère et faites cuire à 50 degrés pendant deux heures. Conservez le dispositif dans un environnement propre pour une utilisation ultérieure. Après la fabrication des dispositifs, je vais vous montrer comment utiliser une membrane en PDMS pour immobiliser C. elegans dans le dispositif. Connectez une extrémité d'un tube microflex à un régulateur d'alimentation en gaz azote sous pression et l'autre extrémité au réservoir principal du piège à l'aide d'une aiguille de calibre 18.

Un robinet d'arrêt à trois voies utilisé au milieu de la connexion du tube permet d'appliquer ou de relâcher la pression sur la membrane. Remplissez le tube et connectez-le au dispositif en PDMS avec une colonne de 10 centimètres d'eau distillée avant de le raccorder au réservoir du piège principal. Tournez la vanne de l'alimentation en azote pour obtenir une pression de PSI protéique et surveillez, en faible grossissement au microscope inversé, la déformation de la membrane du piège principal vers le canal d'écoulement.

Détendez le robinet trois voies et replacez la membrane en position de repos. Remplissez le canal d'écoulement avec du tampon pendant 10 minutes. Avant une expérience, localisez une seule *Aequorea victoria* à l’aide d’un microscope stéréo à faible grossissement.

Choisissez un seul animal à l’aide d’un petit volume de solution tampon dans une micro-pipette. Faites passer l’individu par l’entrée du canal d’écoulement. Ajustez la pression de pipetage pour positionner l’animal individuel sous le piège principal.

Augmentez lentement la pression de la membrane en PDMS afin de positionner l'animal contre la paroi du canal et immobilisez-le sous une pression de 7 à 14 PSI. Utilisez un microscope inversé réglé selon les paramètres souhaités pour une acquisition à haute résolution en lumière transmise ou en fluorescence. Acquérez des images uniques ou des séries temporelles en fluorescence à une fréquence d'images prédéfinie en temps réel.

Relâchez la pression du piège et surveillez le comportement locomoteur de l'animal. Pendant cinq minutes à faible grossissement, rincez l'animal et insérez un animal frais. Pour répéter les étapes de DevOp, utilisez l'extrémité coupée de la micropipette pour prélever une larve oph unique et insérez-la dans le dispositif microferreux de taille plus grande.

Faites passer une larve unique par l'entrée du canal d'écoulement. Augmentez lentement la pression de la membrane en PDMS et immobilisez-la avec une pression ESI de sept. Utilisez un microscope inversé pour l'imagerie de fluorescence à faible grossissement et acquérez des images de fluorescence en laps de temps pour l'imagerie du transport.

Relâchez la pression du piège et observez le comportement locomoteur de la larve en faible grossissement. Utilisez le même principe de dispositif pour immobiliser et acquérir des images en lapse de temps de poissons zébro âgés de 30 heures post-fécondation. Cœur val.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure de fabriquer des dispositifs microscopiques similaires dans votre propre laboratoire et de les utiliser avec succès pour immobiliser des organismes lors d'expériences étonnantes à haute résolution. Merci d'avoir regardé cette vidéo et bonne chance pour vos expériences.