Préparation des tranches de parasagittales d'enquête sur les dorso-ventrale de l'Organisation des rongeurs cortex entorhinal médian

Nous décrivons les procédures de préparation et d'enregistrement électrophysiologique de tranches de cerveau qui maintiennent l'axe dorso-ventral de l'médial cortex entorhinal (MEC). Parce que le codage neuronal de l'emplacement suit une organisation dorso-ventrale au sein de la MEC, ces procédures de faciliter les enquêtes des mécanismes cellulaires importants pour la navigation et de la mémoire.

L’objectif général de l’expérience suivante est d’examiner l’organisation topographique des propriétés synaptiques et intégratives des neurones dans le cortex RH médian. Ceci est réalisé en préparant des coupes de cortex RH d’entrée médiale orientées dans un plan ventral dorsal. Dans un deuxième temps, des enregistrements de patch-clamp sont effectués sur les neurones du cortex RH pour étudier leurs propriétés synaptiques et intégratives.

Ensuite, l’emplacement du neurone enregistré est déterminé pour évaluer l’organisation ventrale dorsale des propriétés électrophysiologiques mesurées. Des résultats sont obtenus qui montrent l’organisation topographique des propriétés intrinsèques des cellules étoilées dans la couche deux sur la base des mesures de leur résistance d’entrée, de leur constante de temps membranaire et de leur seuil de potentiel d’action, Hugh Pastel, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les coupes de cerveau orientées horizontalement est que la position du neurone enregistré le long de l’axe ventral dorsal du cortex interne peut être enregistrée avec précision.

Pour commencer cette procédure, retirez le cerveau de la souris et placez-le immédiatement dans la découpe à froid. Liquide céphalo-rachidien artificiel bouillonné de carbogène. Après trois minutes, retirez soigneusement la cervelle de la coupe A LCR à l’aide d’une spatule.

Placez-le délicatement en position verticale sur le papier filtre qui a été humidifié avec la coupe A LCR. Ensuite, utilisez un rasoir ou un scalpel pour enlever la plus grande partie possible du cervelet sans affecter le cortex entéral médial, qui est situé à l’extrémité cordale du cerveau. Retirez la partie rostrale du cerveau en sectionnant dans le plan coronal.

Ensuite, hemis sec, le cerveau au plan vertical de la ligne médiane. Après cela, remettez les hémisphères dans la bulle en coupant un LCR pendant une minute et demie avant de monter. Assurez-vous que le tranchant de la lame de vibrato est incliné à 20 degrés par rapport à l’horizontale Sur la surface de montage, faites une bande peu profonde de super colle parallèle à la lame de vibrato, à peu près de la largeur d’un hémisphère, et suffisamment longue pour accueillir les deux hémisphères bout à bout.

Transférez ensuite chaque hémisphère de la coupe d’un LCR à la surface de montage en positionnant l’hémisphère de manière à ce que sa surface médiale repose sur la spatule et que son extension dorsale soit tournée vers la lame vibrante. Faites glisser doucement l’hémisphère sur la bande de super colle et assurez-vous que la surface médiale de chaque hémisphère est parallèle à la base du vibrato. Après cela, immergez immédiatement les hémisphères dans la coupe à froid.

Un CSF. Maintenez la température et la saturation de la voiture tout au long de la procédure de tranchage. Avec le vibram, retirez les cortex des deux hémisphères dans le plan sagittal jusqu’à ce que la partie la plus latérale du cortex entéral médial dans chaque hémisphère soit identifiée à au moins 600 micromètres de la surface latérale.

L’extension latérale du cortex entéral médial est identifiée par l’absence de l’épaisse bande blanche autour de la courbe cordale ventrale de l’hippocampe. La forme non convexe de sa limite rostrale et le coin cordal dorsal angulaire coupent des sections parasagittales de 400 microns des deux hémisphères jusqu’à ce que l’extension médiale du cortex entéral médial soit atteinte. Après chaque coupe, placez immédiatement les tranches dans du carbogène saturé de LCR A maintenu dans un bain-marie à 35 degrés Celsius et incubez-les pendant environ 15 minutes.

Après 15 minutes, retirez le porte-tranches du bain-marie et continuez à faire bouillonner avec du carbogène à température ambiante pendant au moins 45 minutes. Transférez une tranche dans la chambre d’enregistrement, qui est continuellement remplie de bulles avec l’étalon A-C-S-F-A saturé en carbogène à 35 degrés Celsius. Ensuite, identifiez une région d’enregistrement approximative dans le cortex RH médial.

Passez ensuite à un objectif à fort grossissement. Identifiez les cellules viables dans cette région. À ce stade, des expériences utilisant la pince de patch conventionnelle pour cellules entières pour enregistrer le potentiel membranaire ou le courant membranaire des neurones identifiés peuvent être effectuées.

L’identité des neurones peut être vérifiée à partir des propriétés électrophysiologiques du neurone enregistré et en incluant des marqueurs fluorescents dans la solution intracellulaire. Après l’expérience visant à déterminer la position d’un neurone enregistré le long de l’axe ventral dorsal, passez à un objectif à faible grossissement. Marquez l’emplacement d’intérêt en incluant l’électrode d’enregistrement dans une image ou en abaissant le diaphragme de l’iris de champ.

Pour laisser un cercle lumineux autour de l’emplacement d’intérêt dans une image dupliquée, la région du cortex médial et RH et les zones environnantes de la tranche pour localiser l’emplacement d’enregistrement dans l’image, le duplicaté peut ensuite être superposé à l’image initiale de l’emplacement d’enregistrement et de son environnement. Jusqu’à trois images distinctes à faible grossissement peuvent être nécessaires pour couvrir la zone allant d’un emplacement d’enregistrement ventral au bord dorsal du cortex interne médian. Ces images peuvent ensuite être assemblées à l’aide d’un logiciel de manipulation d’images.

Le bord dorsal du cortex entéral médial fournit un point de repère pratique pour mesurer la position ventrale dorsale, mais le bord ventral du cortex entéral médial n’est pas aussi bien défini. Ici. Les coupes para sagittales DIC et NIAL montrent l’hippocampe circulaire et l’absence de protrusion para-orbiculaire dans la première couche du cortex entéral latéral respectivement. Ce sont des images des coupes typiques qui contiennent le cortex entéral médian.

La zone des paras est clairement révélée par des taches de missiles. Dans les images correspondantes, le bord dorsal du cortex entéral médial indiqué par la flèche noire est ventral par rapport au groupe de cellules para-orbiculaires qui fait saillie loin dans la première couche, comme l’indique la flèche rouge. Voici un exemple d’image composite à grossissement quatre fois d’une tranche parasagittale.

Les positions d’une cellule dorsale et d’une cellule ventrale sont indiquées respectivement par des cercles remplis de bleu et de vert. La flèche noire marque le bord dorsal estimé du cortex interne médian et se prolonge dans les couches profondes par la ligne pointillée blanche. La ligne blanche continue est un guide montrant le chemin de contour, le long duquel la mesure en pixels de la distance entre le bord dorsal du cortex interne médian et les enregistrements cellulaires situés ventralement à partir des cellules stellaires dorsales et ventrales marquées sont montrées ici.

Ces enregistrements aident à établir l’identité des cellules et illustrent comment les propriétés électriques de la médiane pénètrent dans le cortex r. Les cellules étoilées de la deuxième couche diffèrent aux emplacements dorsal et ventral lors de la tentative de cette procédure. Il est important de ne pas oublier d’être extrêmement prudent lors de la préparation des tranches, car des tranches de haute qualité sont essentielles pour des enregistrements électrophysiologiques productifs.