Suivi des réduction et par oxydation demi-réactions d'une monooxygénase flavine-dépendante à l'aide Stopped-Flow Spectrophotométrie

Cette procédure utilise un instrument d’écoulement arrêté pour détecter les différentes formes spectrales de SID A et mesurer les taux. La réaction catalysée par la SID A peut être divisée en demi-réactions réductrices et oxydatives de la FAD. La flavine oxydée se lie à N-A-D-P-H et réagit pour former de la flavine et du NADP réduits, ainsi qu’une réaction de l’oxygène moléculaire et de la liaison de l’ornithine entraîne la formation de C quatre.

Une hydroxyflavine après hydroxylation de l’ornithine, l’hydroxy flavine se déshydrate pour former l’enzyme oxydée. NA DP plus reste lié tout au long du cycle catalytique et est le dernier substrat à être libéré. L’instrument à écoulement arrêté facilite le mélange rapide de petits volumes de réactifs et d’enregistrements.

Le spectrophotomètre de perte de substance permet de mesurer le taux de formation et la réaction catalysée par une enzyme spécifiquement des intermédiaires transitoires. Deux membres de mon laboratoire, Rita Robinson et Enviro Romero, feront la démonstration de ces expériences en utilisant l’ensemble A à la mono oxygénase d’arôme comme système modèle. Versez 250 millilitres de tampon de phosphate de potassium de 100 millimolaires dans une fiole buchner de 500 millilitres contenant un agitateur.

Fermez le ballon à l’aide d’un bouchon en caoutchouc, puis placez-le sur une plaque d’agitation et connectez le tube court du ballon à une ligne de flanc. Dégazez le tampon sous vide pendant une heure à température ambiante avec agitation, suivi d’un rinçage à l’argonne. Répétez l’opération cinq fois.

Enfin, rincez la fiole avec de l’Argonne pendant 10 secondes. Débranchez le ballon du collecteur d’aspirateur et placez-le à l’intérieur de la boîte à gants. Continuez à remuer vigoureusement avec la fiole ouverte.

Remplissez les seringues du réservoir avec 18,13 unités par millilitre de glucose oxydase et 100 millimolaires de solutions de glucose. Réglez maintenant les soupapes d’entraînement sur la position de charge. Remplissez les seringues d’entraînement.

Ensuite, tournez la vanne F en position d’entraînement. À l’aide du logiciel de contrôle des données pro, cliquez sur vider la seringue d’arrêt, puis poussez le tampon de la seringue d’entraînement F à travers le circuit d’écoulement en soulevant manuellement la vérine d’entraînement correspondante. Continuez avec les trois autres seringues d’entraînement en équilibre pendant une heure.

Remplissez maintenant les seringues du réservoir et répétez le rinçage du système d’écoulement arrêté. Pour préparer un tampon saturé en oxygène. Faites buliser la solution avec 100 % d’oxygène pendant une heure avec agitation.

Retirez ensuite l’aiguille courte du flacon et attendez 10 secondes. Retirez la longue aiguille et placez le flacon fermé dans la boîte à gants. Pour la solution N-A-D-P-H.

Placez un tube einor de 1,5 millilitre contenant un milligramme de N-A-D-P-H dans la boîte à gants. Dissoudre dans 300 microlitres de tampon de phosphate de potassium anaérobie de 100 millimolaires. pH 7,5.

Retirez 30 microlitres pour déterminer la concentration N-A-D-P-H. Maintenant, pour éliminer l’oxygène du stock d’enzymes, transférez la solution dans un flacon de 25 millilitres contenant un capuchon de barre d’agitation avec un bouchon de blé et un joint en aluminium. Placer sur de la glace.

Connectez-vous à une ligne schlink, puis dégazez par vide pendant 20 minutes, suivi d’un rinçage à l’argonne. Enfin, rincez le flacon avec de l’Argonne pendant 10 secondes et débranchez-le du collecteur de vide. Placez le flacon sur de la glace à l’intérieur de la boîte à gants.

Dans la fenêtre du panneau de configuration du logiciel de contrôle des données pro. Sélectionnez le réseau de photodiodes, le déclencheur externe et l’échelle logarithmique. Lancez également le logiciel pro data viewer et définissez le répertoire pour le stockage des fichiers de données.

Remplacez maintenant la solution dans les seringues réservoir C et F par un tampon de phosphate de potassium anaérobie de 100 millimolaires pH 7,5. Tournez les soupapes C et F en position d’entraînement. Cliquez sur vider la seringue d’arrêt dans le logiciel de contrôle des données pro.

Poussez ensuite le tampon des deux seringues d’entraînement à travers le circuit d’écoulement en soulevant manuellement le vérin d’entraînement correspondant. Répétez le rinçage avec les seringues réservoir C et F trois fois de plus. Pour assurer l’élimination complète de la glucose oxydase du circuit de débit, cliquez sur la ligne de base dans le logiciel de contrôle des données pro.

Remplacez la solution de la seringue réservoir F par la solution enzymatique. Tournez la soupape F en position d’entraînement. Cliquez sur vider la seringue d’arrêt dans le logiciel de contrôle des données pro.

Poussez la solution enzymatique de la seringue d’entraînement F à travers le circuit d’écoulement en soulevant manuellement le vérin d’entraînement correspondant. Revenez au logiciel de contrôle des données pro pour régler le temps d’acquisition sur 60 secondes. Vérifiez que les deux seringues d’entraînement sont remplies de leurs solutions correspondantes et que les vérins d’entraînement sont en contact avec la seringue d’entraînement. Pistons.

Tournez les deux vannes en position d’entraînement et cliquez sur acquérir dans le logiciel de contrôle des données pro pour effectuer l’entraînement. Acquérir des données spectrales de la forme oxydée de l’enzyme en triple exemplaire à l’aide de la valeur nanométrique A 4 52 obtenue à partir des entraînements. Déterminez la concentration enzymatique avant de mélanger et préparez quatre millilitres de solution N-A-D-P-H.

1,5 fois plus concentré, remplissez la seringue C avec la solution N-A-D-P-H, et videz et remplissez trois fois la seringue d’arrêt, comme indiqué précédemment. Maintenant, acquérez des spectres lors de la réduction du contenu du rinçage enzymatique du circuit d’écoulement avec un tampon anaérobie de phosphate de potassium de 100 millimolaires pH 7,5. Cliquez maintenant sur ligne de base dans le logiciel de contrôle des données pro.

Mélangez ensuite 200 microlitres de solution mère d’enzymes avec 1000 microlitres de tampon de phosphate de potassium anaérobie et 100 millimolaires. pH 7,5. Remplacez la solution de la seringue réservoir A par la solution enzymatique.

Tournez la vanne A en position d’entraînement dans le logiciel de contrôle des données pro. Cliquez sur la seringue d’arrêt pour qu’elle soit vide. Poussez la solution enzymatique de la seringue d’entraînement A à travers le circuit d’écoulement en soulevant manuellement le vérin d’entraînement correspondant.

Réglez le temps de retard sur 0,5 seconde et le temps d’acquisition sur 60 secondes. Vérifiez que toutes les seringues d’entraînement sont remplies de leurs solutions correspondantes et que les vérins d’entraînement sont en contact avec les pistons de la seringue d’entraînement. Tournez ensuite toutes les vannes d’entraînement en position d’entraînement et cliquez sur acquérir dans le logiciel de contrôle des données pro.

Obtenir des données spectrales de la forme oxydée de l’enzyme en trois exemplaires. Ensuite, remplacez la solution de la seringue réservoir B par une solution N-A-D-P-H. 1,5 fois plus concentré que la solution enzymatique dans la seringue A.Tournez la valve B en position d’entraînement et videz et remplissez la seringue d’arrêt trois fois, comme indiqué précédemment dans la fenêtre du panneau de commande.

Réglez le délai à 0,5 seconde. Une acquisition à 20 secondes, remplacer la solution de la seringue réservoir par le tampon oxygéné. Tournez la vanne C en position d’entraînement.

Videz trois fois dans le logiciel de contrôle des données pro. Réglez le temps de retard à 15 secondes et le temps d’acquisition à 900 secondes. Continuer à acquérir des spectres pendant la réoxydation de l’enzyme complètement réduite dans l’instrument à écoulement arrêté.

La réduction anaérobie de la SID A avec N-A-D-P-H peut être surveillée en mesurant les changements de l’état redox de la flavine à l’aide d’un absorbant à 452 ici. Les changements spectraux sont enregistrés au fil du temps à partir de la SID A oxydée jusqu’au dernier spectre de la SID A entièrement réduite. Le taux de cette étape enzymatique peut être déterminé en ajustant les données à l’équation appropriée. Le taux d’oxydation et les intermédiaires de réaction peuvent également être déterminés à l’aide du double mode de mélange de l’écoulement arrêté dans cette réaction par AF Sid A.L’intermédiaire de flavine Hydroxi C quatre A est clairement détecté avec un lambda max de trois 80 nanomètres et l’enzyme oxydée a un lambda max de 450 nanomètres.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre à six heures si elle est exécutée correctement. N’oubliez pas de vous assurer que les solutions sont anaérobies. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’étudier à la fois l’ion relatif et l’ion ulcératif de l’expérience mono indépendante de FLA en aval comme le produit chimique rapide.

Quentin peut aider à élucider la tristesse de la nature des intermédiaires.