Name: Suivi des réduction et par oxydation demi-réactions dune monooxygénase flavine-dépendante à laide Stopped-Flow Spectrophotométrie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Découvrez la spectrophotométrie stopped-flow pour analyser les demi-réactions réductives et oxydatives de SidA, une monooxygénase flavine-dépendante d'Aspergillus fumigatus. Cette méthode permet de mesurer les constantes de vitesse des intermédiaires réactionnels.

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1. Préparation du Tampon anaérobie <ol><li> Préparer 1 L de tampon phosphate 100 mM de potassium, pH 7,5. Verser 250 ml de tampon dans un flacon de 500 ml de Büchner avec un barreau aimanté. </li><li> Sceller la fiole avec un bouchon en caoutchouc et placez-le sur une plaque d&#39;agitation. Relier le tube court du ballon à une ligne de Schlenk. </li><li> Degas le tampon sous vide pendant 5 heures à température ambiante sous agitation. Durant cette période, effectuer 5 tours consécutifs de dégazage sous vide et le rinçage avec de l&#39;argon à chaque heure. </li><li> Rincer le flacon avec de l&#39;argon pendant 10 secondes et le débrancher de la chambre à vide. Placer le ballon à l&#39;intérieur de la boîte à gants. </li><li> Laissez le flacon ouvert dans la boîte à gants pendant la nuit avec une agitation vigoureuse. </li></ol> 2. Éliminer l&#39;oxygène de l&#39;arrêt du système d&#39;écoulement <ol><li> Préparer 1 L de 0,1 M acétate de sodium, pH 5,0. Verser 125 ml de ce tampon dans un flacon de 250 ml de Büchner et effectuez les étapes 01.02 à 01.04. </li><li> Peser 5mg de glucose oxydase à partir d&#39;Aspergillus Niger (181 300 U / g) et 0,9 g de glucose utilisant une 1,5 ml Eppendorf tube et 50 ml Falcon conique du tube, respectivement. Placez les deux conteneurs dans la boîte à gants. </li><li> Dissoudre la glucose oxydase et le glucose dans 50 ml d&#39;acétate de sodium 0,1 anaérobie M, pH 5,0 (concentrations finales de 18,13 U / ml et 100 mm, respectivement). Remplir les seringues de réservoir avec cette solution (Figure 1). </li><li> Assurez-vous que les vannes de commande sont dans le &quot;charge&quot; la position et de remplir les seringues d&#39;entraînement (Figure 1). Tournez la vanne F de la &quot;drive&quot; la position. Vider la seringue arrêt en cliquant sur ​​Vider dans le logiciel de contrôle Pro-Data. Poussez la mémoire tampon de F seringue lecteur à travers le circuit d&#39;écoulement manuellement élever le bélier lecteur correspondant. Répétez cette étape dix fois au total. Effectuez la même procédure avec les trois autres seringues entraînement. Attendre une heure. </li><li> Remplacer la solution des seringues réservoir avec le même tampon CONTAINing glucose oxydase et de glucose. Répétez l&#39;étape 2.4. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.5 et permettre à la solution de se tenir dans le système d&#39;écoulement durant la nuit. </li><li> Après une nuit d&#39;incubation, répétez l&#39;étape 2.5. </li></ol> 3. Préparation du Tampon saturée en oxygène <ol><li> Préparer un tampon phosphate 100 mM de potassium (pH 7,5) et verser 50 ml dans un flacon de 50 ml avec un barreau aimanté. Boucher le flacon avec un bouchon Wheaton et un sceau d&#39;aluminium Wheaton. </li><li> Placez le flacon sur la glace. Immerger une longue aiguille reliée à un réservoir contenant de l&#39;oxygène à 100% dans la solution. Insérez un autre aiguille courte à travers le bouchon du flacon comme un évent. </li><li> Bubble la solution avec de l&#39;oxygène à 100% pendant 1 heure avec agitation. </li><li> Commencez par retirer l&#39;aiguille courte dans le flacon et attendre 10 secondes avant de retirer l&#39;aiguille longue. Placez le flacon fermé dans la boîte à gants. </li></ol> 4. Préparation de la solution de NADPH <ol><li> Peser à 1 mg de NADPH dans un tube Eppendorf de 1,5 ml et placer it dans la boîte à gants. </li><li> Dissoudre le NADPH dans 300 pi de anaérobie tampon phosphate 100 mM de potassium, pH 7,5. Retirez 30 uL de cette solution de la boîte à gants pour déterminer la concentration de NADPH avec un spectrophotomètre (e = 340 nm 6270 M -1 cm -1). </li></ol> 5. Élimination de l&#39;oxygène de la solution enzymatique <ol><li> Prendre 400 ul de la solution mère enzyme du congélateur et du dégel dans la boîte à gants. La solution stock enzyme (360 uM) a été préalablement préparé dans un tampon phosphate 100 mM de potassium (pH 7,5) contenant 100 mM de NaCl, et congelés dans l&#39;azote liquide. </li><li> Transférer la solution d&#39;enzyme dans un flacon de 25 ml avec un barreau aimanté, plafonner le flacon avec un bouchon Wheaton et un sceau d&#39;aluminium Wheaton et de retirer de la boîte à gants. </li><li> Placez le flacon sur la glace et le connecter à une ligne de Schlenk en insérant une aiguille dans le bouchon du flacon. </li><li> Degas la solution enzymatique en effectuant 5 tours consécutifs dedégazage sous vide et le rinçage avec de l&#39;argon toutes les 20 minutes pendant 1 heure. </li><li> Rincer le flacon avec de l&#39;argon pendant 10 secondes et le débrancher de la chambre à vide. Placez le flacon sur la glace à l&#39;intérieur de la boîte à gants. </li></ol> 6. Demi-réaction réductrice: la réduction de surveillance Flavin <ol><li> Préparation de l&#39;instrument stopped-flow et le logiciel de contrôle Pro-Data pour le mode de mélange unique suivant le protocole du fabricant. </li><li> Tourner sur un bain d&#39;eau circulant (15 ° C). Éliminer l&#39;oxygène de l&#39;eau par barbotage d&#39;azote pendant 20 minutes. Cela empêche la contamination par l&#39;oxygène à travers le circuit d&#39;écoulement. </li><li> Maintenir la température des seringues d&#39;entraînement et la cellule d&#39;observation à 15 ° C en connectant le boîtier bain d&#39;eau de l&#39;arrêt d&#39;écoulement dans le bain circulant. </li><li> Dans la fenêtre Panneau de configuration de la baie de Pro-Data logiciels Photodiode de commande de sélection, de déclenchement externe (pour activer stopped-flow opération), et Logaritéchelle HMIC. </li><li> Lancez le logiciel de visualisation de données Pro-et de définir le répertoire où les fichiers de données seront stockées. </li><li> Remplacer la solution du réservoir seringues C et F avec anaérobie tampon phosphate 100 mM de potassium (pH 7,5). Tournez la C et F vannes à la &quot;drive&quot; la position. Vider la seringue arrêt en cliquant sur ​​Vider dans le logiciel de contrôle Pro-Data. Pousser le tampon de deux seringues d&#39;entraînement par l&#39;intermédiaire du circuit d&#39;écoulement en manuellement élever le disque correspondant ram cinq fois au total (clique vide avant chaque déplacement du coulisseau). </li><li> Afin d&#39;assurer que la glucose oxydase a été entièrement enlevée du circuit d&#39;écoulement, effectuer l&#39;étape 6.6 quatre fois au total. </li><li> Cliquez sur base du logiciel de contrôle Pro-Data. </li><li> Mélanger 100 ul de la solution mère enzyme avec 1100 ul de anaérobie tampon phosphate 100 mM de potassium (concentration finale après mélange dans le flux arrêté de 15 uM). </li><li> Remplacer la solution du réservoir syrF inge avec la solution d&#39;enzyme. Tournez la vanne F de la &quot;drive&quot; la position. Vider la seringue arrêt en cliquant sur ​​Vider dans le logiciel de contrôle Pro-Data. Poussez la solution enzymatique à partir de F seringue d&#39;entraînement à travers le circuit d&#39;écoulement manuellement élever le bélier lecteur correspondant. Effectuez cette opération trois fois au total. Dans le logiciel de contrôle Pro-données, définissez le temps d&#39;acquisition à 60 s. </li><li> Faire en sorte que les deux seringues d&#39;entraînement sont remplis avec les solutions correspondantes et l&#39;entraînement béliers sont en contact avec les pistons de seringue d&#39;entraînement. Tournez les deux vannes de la &quot;drive&quot; et cliquez sur la position dans l&#39;acquisition du logiciel de commande Pro-Data pour effectuer le lecteur. Répétez cette étape deux fois plus pour obtenir les données en trois exemplaires. Ce spectres rendements de la forme oxydée de l&#39;enzyme. </li><li> Utilisation de la valeur de A 452 nm obtenue à partir des disques, de déterminer la concentration d&#39;enzyme avant de les mélanger (e = 452 nm 13700 M -1 cm -1) et de préparer 4 ml d&#39;une solutio NADPHn de 1,5 fois plus concentrée. </li><li> Remplacer la solution de réservoir de seringue C avec la solution de NADPH et de vides et de remplissage de la seringue d&#39;arrêt trois fois comme décrit dans 6,10. </li><li> Répétez l&#39;étape 6.11. Ce spectres rendements lors de la réduction de l&#39;enzyme. </li></ol> 7. Oxydatif Demi-réaction: oxydation Flavin surveillance <ol><li> Préparation de l&#39;instrument stopped-flow et le logiciel de contrôle Pro-Data pour le mode de mélange à double suivant le protocole du fabricant. </li><li> Répétez les étapes 6,2-6,5. </li><li> Remplacer la solution dans les quatre seringues réservoir avec anaérobie tampon phosphate 100 mM de potassium (pH 7,5). Tournez la vanne F de la &quot;drive&quot; la position. Vider la seringue arrêt en cliquant sur ​​Vider dans le logiciel de contrôle Pro-Data. Appuyez sur le tampon de la F seringue d&#39;entraînement à travers le circuit d&#39;écoulement manuellement élever le bélier lecteur correspondant. Effectuez cette étape cinq fois au total avec chaque seringue d&#39;entraînement. </li><li> Effectuez l&#39;étape 7.3 à quatre reprises en total pour supprimer complètement le contenu du circuit d&#39;écoulement. </li><li> Cliquez référence dans le logiciel de contrôle Pro-Data. </li><li> Mélanger 200 ul de la solution mère enzyme avec 1000 ul de anaérobie tampon phosphate 100 mM de potassium (concentration finale après mélange dans le flux arrêté de 15 uM). </li><li> Remplacer la solution de la seringue réservoir A avec la solution d&#39;enzyme. Tournez la vanne A de la &quot;drive&quot; la position. Vider la seringue arrêt en cliquant sur ​​Vider dans le logiciel de contrôle Pro-Data. Poussez la solution d&#39;enzyme de la seringue le lecteur A travers le circuit d&#39;écoulement manuellement élever le bélier lecteur correspondant. Effectuez cette étape trois fois au total. Dans le logiciel de contrôle Pro-Data, le temps de retard à 0,5 s et le temps d&#39;acquisition à 60 s. </li><li> Faire en sorte que toutes les seringues d&#39;entraînement sont remplis avec les solutions correspondantes et l&#39;entraînement béliers sont en contact avec les pistons de seringue d&#39;entraînement. Tourner toutes les vannes de la &quot;drive&quot; et cliquez sur la position d&#39;acquérir à l&#39;Pro-Datun logiciel de commande pour effectuer l&#39;entraînement. Répétez cette étape deux fois plus pour obtenir les données en trois exemplaires. Ce spectres rendements de la forme oxydée de l&#39;enzyme. </li><li> Remplacer la solution de la seringue réservoir B avec une solution de NADPH 1,5 fois plus concentrée que la solution d&#39;enzyme dans la seringue A. Tournez la vanne B de la &quot;drive&quot; la position vide et de remplissage de la seringue arrêt trois fois comme décrit en 7.7. </li><li> Remplacer la solution du réservoir seringue C avec un tampon oxygéné. Activer la soupape à l&#39;C &quot;d&#39;entraînement&quot; position et vide et de remplissage de la seringue d&#39;arrêt trois fois comme décrit en 7.7. Dans le logiciel de contrôle Pro-Data, le temps de retard et de l&#39;acquisition à 15 et 900 s, respectivement. </li><li> Répétez l&#39;étape 7.8. Ce spectres rendements au cours de la réoxydation de l&#39;enzyme complètement réduit. </li></ol> 8. Analyse des données <ol><li> Lancez le logiciel de convertisseur de Pro-Data. Cliquez sur l&#39;icône Options et sélectionnez Enregistrer dans ProDataCSV. </li><li> Ouvertle répertoire où les fichiers de données ont été stockées. Faites glisser les fichiers dans la fenêtre de convertisseur de Pro-Data APL. Les données seront sauvegardées automatiquement sous forme de fichiers au format CSV dans le même répertoire. </li><li> Ouvrez les fichiers au format CSV en utilisant Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, Etats-Unis). Normaliser la base des traces arrêté débit en soustrayant l&#39;absorption correspondant à 700 nm. </li><li> Analyser les traces corrigées à l&#39;aide KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, PA) en ajustant le terrain de l&#39;absorbance au maximum en fonction du temps correspondant à la fonction appropriée exponentielle. Comme le montre la figure 2B, l&#39;absorbance à 452 nm est tracée en fonction du temps afin de déterminer le taux de réduction de flavine après mélange l&#39;enzyme NADPH et dans l&#39;instrument arrêté-débit. Dans ce cas, le meilleur ajustement des données ont été obtenues en utilisant une double équation exponentielle et des taux de 0,65 et 0,23 s -1 ont été calculés pour la première et deuxième phases de la réduction, la chosepectivement. Pour déterminer le taux de formation de l&#39;intermédiaire C4a-hydroperoxyflavin et la réoxydation après avoir fait réagir l&#39;enzyme réduit avec de l&#39;oxygène, nous avons analysé les traces stopped-flow à 380 et 452 nm, respectivement (figure 3B). En utilisant une équation unique exponentielle, on calcule les taux de 1,4 et 0,006 s -1 pendant la première étape et la deuxième de la demi-réaction d&#39;oxydation, respectivement. </li></ol> 9. Les résultats représentatifs Les résultats des expériences décrites dans les sections précédentes montrent comment le réductrice demi-réaction de A f Sida peut être surveillée en mesurant les changements de l&#39;absorbance à 452 nm, qui correspondent aux changements de l&#39;état redox de la flavine. Le taux de cette étape peut être déterminée en ajustant les données de l&#39;équation appropriée (Figure 2; étape 8.4). Le taux de réduction obtenu (0,65 s -1) est similaire à la valeur calculée avec k catl&#39;état d&#39;équilibre des expériences 2, suggérant que la réduction est le taux étape déterminante de la réaction. Profitant de la double mode de mélange de l&#39;arrêté-débit, le taux d&#39;oxydation et les intermédiaires dans cette demi-réaction peut être déterminée (figure 3; étape 8.4). Dans la réaction catalysée par l&#39;ASDI A f, le C4a-hydroperoxyflavin est clairement détecté (λ max de 380 nm), et le taux de formation et la décomposition peut être calculée. La lenteur de la réoxydation obtenu (0,006 s -1) indique que le C4a-hydroperoxyflavin est très stable en l&#39;absence de l&#39;ornithine. <img alt="Schéma 1" src="/files/ftp_upload/3803/3803scheme1.jpg" /> Schéma 1. Mécanisme de A f Sida. L&#39;anneau isoallozaxine du cofacteur FAD est montré. Le oxydé flavine (A) se lie à la NADPH (B) et réagit pour former réduite flavine et du NADP + (C). Après réaction avec l&#39;oxygène moléculaire et de liaison deornithine, l&#39;C4a-hydroperoxyflavin est formée (D). Ce sont les espèces hydroxylation. Après l&#39;hydroxylation de l&#39;ornithine, l&#39;hydroxyflavin (E) doit être déshydratée pour former l&#39;enzyme oxydée. NADP + reste lié tout au long du cycle catalytique et est le dernier produit à être libéré (F). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig1.jpg" /> Figure 1. L&#39;instrument stopped-flow. A) Image des composants de la SX20 Applied Photophysics stopped-flow spectrophotomètre. B) Image de l&#39;unité de traitement de l&#39;échantillon. C) schéma du circuit d&#39;écoulement en mode de mélange à double. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig2.jpg" /> Figure 2. La réduction anaérobie de Sida avec le NADPH dans l&#39;instrument stopped-flow. Quelques changements Spectral) enregistrés après le mélange des volumes égaux de 30 uM Sida et 45 uM de NADPH. Le premier spectre (oxydé Sida) et le spectre dernière (entièrement réduite SidA) est surligné en bleu et rouge, respectivement. Trace absorbance B) à 452 nm enregistrées en tant que fonction du temps. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig3.jpg" /> Figure 3. Oxydation du Sida dans l&#39;instrument stopped-flow. A) les modifications spectrales enregistrées après mélange des volumes égaux de l&#39;Asdi et totalement réduit tampon oxygéné. Les concentrations finales étaient de 15 uM, l&#39;Asdi 22,5 uM NADPH, d&#39;oxygène et 0,95 mM. Le spectre enregistré à 0,034, 4,268, et 727.494 s correspond à l&#39;enzyme complètement réduit, le produit intermédiaire C4a-hydroperoxyflavin (λ max de 380 nm), et l&#39;enzyme oxydée (λ max de 450 nm), respectivement. B) trace l&#39;absorbance à 382 et 452 nm enregistrée en fonction du temps.

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Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Les enzymes qui catalysent les réactions d&#39;oxydo-réduction contiennent généralement des cofacteurs tels que hèmes et flavines qui subissent des changements d&#39;absorbance significative au cours du cycle catalytique. La forme oxydée de la flavine présente des maxima d&#39;absorbance à environ 360 et 450 nm, et sa réduction est généralement contrôlée par suite de la diminution d&#39;absorbance à 450 nm 7. En général, certains intermédiaires transitoires sont présents, mais la forme et la pourriture trop rapide pour être mesurée en spectrophotomètres réguliers. Utilisation de la photophysique appliquée SX20 stopped-flow spectrophotomètre (ou instruments similaires), il est possible de mesurer les changements d&#39;absorbance dans l&#39;échelle de la milliseconde (temps mort, 2 ms). Ici, nous avons étudié les réductrices et l&#39;oxydation des demi-réactions de la monooxygénase flavine-dépendante Une Sida f, en servant de modèle. Le taux de transfert d&#39;hydrure est déterminée en mesurant le changement de l&#39;absorbance à 452 nm après le mélange avec l&#39;enzyme NADPH dans des conditions anaérobies. Par la suite, en tenant Advantage de la double mode de mélange de l&#39;instrument arrêté-débit, l&#39;enzyme a été mis à réagir avec le NADPH, jusqu&#39;à réduction complète a été atteint, puis l&#39;enzyme réduite-NADP + complexe est mélangé avec de l&#39;oxygène. Suite à cette procédure, il est possible de détecter transitoires intermédiaires oxygénés flavine et de mesurer les taux de formation et de décomposition. L&#39;identification de ces intermédiaires fournit des données expérimentales sur la nature des espèces réactives en catalyse. Dans le cas de A f Sida, la formation de la C4a-hydroperoxyflavin (généralement suivi au 370-380 nm), ce qui est des espèces hydroxylation. En outre, la mesure de la constante de vitesse de chaque étape permet d&#39;obtenir des informations sur l&#39;étape déterminante de vitesse de la réaction et de contribuer à élucider les mécanismes cinétiques et chimiques de l&#39;enzyme. En général, des approches similaires peuvent être utilisés pour d&#39;autres flavoenzymes, ou des protéines pour lesquelles l&#39;absorbance changements se produisaient, tels que les protéines qui contain hème, le pyridoxal-phosphate, ou le fer non hémique 8-10. Une limitation de cette méthode est que de grandes quantités de l&#39;enzyme purifiée sont nécessaires, mais cela peut être surmonté en utilisant un système d&#39;expression avec des rendements élevés. On détermine la concentration optimale en protéines pour les spectres d&#39;enregistrement en utilisant suffisamment de protéines de sorte qu&#39;un signal assez fort peut être observé, mais pas trop afin que l&#39;enzyme ne soit pas gaspillé. En règle générale, la plus faible concentration d&#39;enzyme pour la flavine contenant les enzymes utilisées dans stopped-flow expériences est de 6-10 um (après mélange) et est déterminée en utilisant le coefficient d&#39;extinction molaire correspondante de l&#39;enzyme. Dans le cas de A f Sida, le pourcentage de la DCP enzyme liée est 50-65% 2. Apo-protéine est considérée comme inactive dans ces expériences, car un cofacteur FAD lié est nécessaire pour la catalyse. Une autre limite possible de cette méthode est que si les processus dans une enzyme se produisent plus rapidement que 2 ms (temps mort de l&#39;stopped-flow), ils ne seront pas respectés, mais eavant sont fait état de stratégies où les taux peut être réduit à surmonter ce problème. Un exemple pour ce comprend l&#39;utilisation d&#39;une concentration élevée de NaCl dans la réaction d&#39;un ferrédoxine-NADP + réductase 11. Le lavage de l&#39;oxygène à partir du circuit d&#39;écoulement de l&#39;arrêté-débit est souvent une étape délicate dans cette expérience et nécessite une attention particulière. La glucose-oxydase-glucose système décrit ici est utilisé avec succès dans la plupart des laboratoires car elle est une méthode efficace et peu coûteux. Cependant, il ya quelques inconvénients qui comprennent la production de H 2 O 2 et pour certaines applications d&#39;autres alternatives que la protocatéchuate dioxygénase-protocatéchuate système doit être considéré 12. L&#39;utilisation d&#39;une boîte à gants anaérobie rend plus facile à assurer des conditions anaérobies, mais n&#39;est pas indispensable. L&#39;oxygène doit être retirée du circuit d&#39;écoulement de l&#39;stopped-flow que nous voulons l&#39;enzyme à être réduit en l&#39;absence d&#39;oxygène ou de réagir avec l&#39;oxygène à une concentrations que nous spécifions. Bien que le stopped-flow est dans la boîte à gants, il est de l&#39;oxygène dans le circuit d&#39;écoulement, si nous avons utilisé des tampons aérobies dans les expériences précédentes. En plus de mesures d&#39;absorbance, de fluorescence et de tests de dichroïsme circulaire peut être effectué dans le Laboratoire de photophysique appliquée SX20 stopped-flow spectrophotomètre avec les accessoires correspondants.

<table border="1"><tbody><tr><td> Général de Laboratoire </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Pompe à vide </td><td> Welch </td><td> - </td></tr><tr><td> Büchner flacons </td><td> Pêcheur </td><td> 70340-500 </td></tr><tr><td> Incorporer les bars </td><td> Pêcheur </td><td> 14-512-129 </td></tr><tr><td> Incorporer plaques </td><td> Pêcheur </td><td> 11-100-49S </td></tr><tr><td> Lignes Schlenk </td><td> Kontes verre </td><td> - </td></tr><tr><td> Argon réservoir </td><td> Airgas </td><td> AR UPC300 </td></tr><tr><td> Réservoir d&#39;azote </td><td> Airgas </td><td> Ni200 </td></tr><tr><td> Réservoir d&#39;azote, ultra haute pureté de qualité </td><td> Airgas </td><td> NI UHP200 </td></tr><tr><td> Ballon d&#39;oxygène </td><td> Airgas </td><td> OX 40 </td></tr><tr><td> 5% d&#39;hydrogène du réservoir d&#39;azote équilibre </td><td> Airgas </td><td> X02NI95B200H998 </td></tr><tr><td> SX20 Stop-débit spectrophotomètre </td><td> AppliedPhotophysics </td><td> - </td></tr><tr><td> Boîte à gants </td><td> Timide </td><td> - </td></tr><tr><td> Bain d&#39;eau </td><td> Brinkmann Lauda </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fournitures </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ml BD Falcon tubes </td><td> Pêcheur </td><td> 14-432-23 </td></tr><tr><td> 15 ml BD Falcon conique tubes </td><td> Pêcheur </td><td> 05-527-90 </td></tr><tr><td> Tubes de 1,5 mL à centrifuger Eppendorf </td><td> Pêcheur </td><td> 05-402-18 </td></tr><tr><td> 50 et 25 flacons de verre mL </td><td> Pêcheur </td><td> 06-402 </td></tr><tr><td> Bouchons en caoutchouc </td><td> Pêcheur </td><td> 06-447H </td></tr><tr><td> Joints en aluminium </td><td> Pêcheur </td><td> 06-406-15 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagents </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Le phosphate de potassium, monobasique </td><td> Pêcheur </td><td> AC2714080025 </td></tr><tr><td> Phosphate de potassium dibasique </td><td> Pêcheur </td><td> P288-500 </td></tr><tr><td> L&#39;acétate de sodium </td><td> Sigma </td><td> S-2889 </td></tr><tr><td> La glucose oxydase à partir de A. Niger </td><td> Sigma </td><td> G7141-250KU </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Pêcheur </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> β-NADPH </td><td> Pêcheur </td><td> ICN10116783 </td></tr><tr><td> L (+)-ornithine chlorhydrate </td><td> Pêcheur </td><td> ICN10116783 </td></tr></tbody></table>

suivi des réduction et par oxydation demi-réactions d&#39;une monooxygénase flavine-dépendante à l&#39;aide stopped-flow spectrophotométrie

Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry

Aspergillus fumigatus sidérophore A (Sida) est une monooxygénase DCP-contenant qui catalyse l&#39;hydroxylation de l&#39;ornithine dans la biosynthèse de sidérophores hydroxamate qui sont essentiels pour la virulence (par exemple ferricrocin ou N &#39;, N &quot;, N&#39;&#39;&#39;-triacetylfusarinine C) 1. La réaction catalysée par l&#39;ASDI peut être divisé en réduction et par oxydation des demi-réactions (schéma 1). Dans le réductrice demi-réaction, le FAD oxydé lié à A f Sida, est réduite par le NADPH 2,3. Dans le demi-réaction d&#39;oxydation , le cofacteur réduit réagit avec l&#39;oxygène moléculaire pour former un intermédiaire C4a-hydroperoxyflavin, qui transfère un atome d&#39;oxygène à l&#39;ornithine. Ici, nous décrivons une procédure pour mesurer les taux et de détecter les différentes formes spectrales de l&#39;Asdi en utilisant un instrument stopped-flow installé dans une boîte à gants anaérobie. Dans l&#39;instrument arrêté-débit, de petits volumes de réactifs sont rapidement mélangés, et après l&#39;écoulement est interrompu par eSeringue d&#39;arrêt e (Figure 1), les changements spectraux de la solution placée dans la cellule d&#39;observation sont enregistrées dans le temps. Dans la première partie de l&#39;expérience, nous montrons comment nous pouvons utiliser l&#39;instrument stopped-flow en mode unique, où la réduction anaérobie de la flavine en A f Sida par le NADPH est mesurée directement. Nous utilisons ensuite doubles paramètres de mélange où A f Sida est d&#39;abord anaérobie réduit par le NADPH pour une période déterminée de temps dans une boucle du vieillissement, et ensuite mis à réagir avec l&#39;oxygène moléculaire dans la cellule d&#39;observation (figure 1). Afin de réaliser cette expérience, tampons anaérobies sont nécessaires parce que lorsque seul le réductrice demi-réaction est suivie, tout l&#39;oxygène dans les solutions réagissent avec le cofacteur réduit flavine et former un intermédiaire C4a-hydroperoxyflavin qui finira par se désintégrer de nouveau dans la forme oxydée flavine . Ce ne serait pas permettre à l&#39;utilisateur de mesurer avec précision les taux de réduction car il serait le chiffre d&#39;affaires complet de l&#39;enzYme. Lorsque le demi-réaction d&#39;oxydation est étudiée l&#39;enzyme doit être réduite en l&#39;absence d&#39;oxygène de sorte que seulement les étapes de réduction et d&#39;oxydation entre sont observées. L&#39;un des tampons utilisés dans cette expérience est saturée en oxygène afin que nous puissions étudier la demi-réaction d&#39;oxydation à des concentrations plus élevées d&#39;oxygène. Ce sont souvent les procédures mises en oeuvre lors de l&#39;étude, soit les réductrices ou oxydatif demi-réactions à la flavine contenant monooxygénases. L&#39;échelle de temps des expériences pré-état d&#39;équilibre réalisées avec le stopped-flow est millisecondes à quelques secondes, qui permettent la détermination des constantes de vitesse intrinsèques et la détection et l&#39;identification des intermédiaires dans la réaction 4. Les procédures décrites ici peuvent être appliqués à d&#39;autres flavine-dépendantes monooxygénases. 5,6

Nous décrivons l&#39;utilisation d&#39;un instrument stopped-flow d&#39;enquêter sur les deux réductrices et l&#39;oxydation des demi-réactions de<em&gt; Aspergillus fumigatus</em&gt; Un sidérophore (Asdi), une monooxygénase flavine-dépendante. Nous montrons ensuite les spectres correspondant à des espèces dans la réaction de l&#39;Asdi et nous calculons les constantes de vitesse de leur formation.

Suivi des réduction et par oxydation demi-réactions d&#39;une monooxygénase flavine-dépendante à l&#39;aide Stopped-Flow Spectrophotométrie

La sidérophore A (SidA) d'Aspergillus fumigatus est une monooxygénase contenant du FAD qui catalyse l'hydroxylation de l'ornithine dans la biosynthèse de...

Cette procédure utilise un appareil de flux arrêté pour détecter les différentes formes spectrales de SID A et mesurer les vitesses. La réaction catalysée par SID A peut être divisée en demi-réactions réductrice et oxydative du FAD. Le flavine oxydé se lie au N-A-D-P-H et réagit pour former du flavine réduit et du NADP plus ; la réaction avec l'oxygène moléculaire et la liaison de l'ornithine conduisent à la formation du C quatre.Une flavine hydroxylée après hydroxylation de l'ornithine, la flavine hydroxylée se déshydrate pour former l'enzyme oxydée. Le NADP⁺ reste lié tout au long du cycle catalytique et est le dernier substrat à être libéré. L'appareil à flux arrêté permet le mélange rapide de petits volumes de réactifs et l'enregistrement.Les changements spectraux dans le temps permettent à un spectrophotomètre à faisceau divisé de mesurer la vitesse de formation et de disparition de réactions enzymatiquement catalysées, en particulier celle d'intermédiaires transitoires. Deux membres de mon laboratoire, Rita Robinson et Enviro Romero, démontreront ces expériences en utilisant la flavine mono-oxygénase comme système modèle. Versez 250 millilitres de tampon phosphate de potassium 100 millimolaire dans un ballon Büchner de 500 millilitres contenant un barreau aimanté.Sceller le flacon avec un bouchon en caoutchouc, puis le placer sur une plaque d'agitation et relier le tube court du flacon à une ligne Schlenk. Désoxygéner le tampon sous vide pendant une heure à température ambiante avec agitation, puis purger avec de l'argon. Répéter l'opération cinq fois.Enfin, rincer le ballon avec de l'argon pendant 10 secondes. Détacher le ballon du système sous vide et le placer à l'intérieur de la boîte à gants. Continuer à agiter vigoureusement avec le ballon ouvert.Remplissez les seringues du réservoir avec une solution contenant 18,13 unités par millilitre de glucose oxydase et une solution de glucose à 100 millimolaire. Placez maintenant les vannes d'entraînement en position de chargement. Remplissez les seringues d'entraînement.Ensuite, tournez le robinet F en position d'entraînement. À l'aide du logiciel de commande Pro Data, cliquez sur « vider la seringue d'arrêt », puis poussez le tampon provenant de la seringue d'entraînement F à travers le circuit d'écoulement en relevant manuellement le piston d'entraînement correspondant. Poursuivez avec les trois autres seringues d'entraînement en les équilibrant pendant une heure.Remplissez à nouveau les seringues du réservoir et répétez le rinçage du système en flux arrêté. Pour préparer le tampon saturé en oxygène, faites barboter la solution avec 100 % d’oxygène pendant une heure sous agitation.Ensuite, retirez l'aiguille courte du flacon et attendez 10 secondes. Puis retirez l'aiguille longue et placez le flacon fermé dans la boîte à gants. Pour la solution de N-A-D-P-H.Placer un tube Eppendorf de 1,5 millilitre contenant un milligramme de N-A-D-P-H dans la boîte à gants. Dissoudre dans 300 microlitres de tampon phosphate de potassium anaérobie à 100 millimolaire. pH 7,5.Prélèvez 30 microlitres pour déterminer la concentration de NADPH. Pour éliminer l'oxygène du stock d'enzyme, transférez la solution dans un flacon de 25 millilitres contenant une barre d'agitation, un bouchon avec joint en caoutchouc et un scellé en aluminium. Placez sur de la glace.Connectez-vous à une ligne Schlenk, puis dégazez sous vide pendant 20 minutes, suivis d'un rinçage à l'argon. Enfin, rincez le flacon à l'argon pendant 10 secondes et déconnectez-le du collecteur sous vide. Placez le flacon sur de la glace à l'intérieur de la boîte à gants.Dans la fenêtre du panneau de contrôle du logiciel de gestion Pro Data, sélectionnez le réseau de photodiodes, le déclenchement externe et l'échelle logarithmique. Lancez également le logiciel Pro Data Viewer et définissez le répertoire de stockage des fichiers de données.Remplacez maintenant la solution dans les seringues réservoir C et F par un tampon de phosphate de potassium anaérobie à 100 millimolaire, pH 7,5. Placez les vannes C et F en position d'entraînement. Cliquez sur « vider la seringue d'arrêt » dans le logiciel de contrôle Pro Data.Ensuite, poussez le tampon à partir des deux seringues d'entraînement à travers le circuit d'écoulement en relevant manuellement le piston d'entraînement correspondant. Répétez le rinçage avec les seringues de réservoir C et F encore trois fois. Pour garantir l'élimination complète de la glucose oxydase du circuit d'écoulement, procédez en cliquant sur « baseline » dans le logiciel de contrôle des données pro.Remplacez la solution du réservoir de la seringue F par la solution d'enzyme. Tournez le robinet F en position d'entraînement. Cliquez sur « vider la seringue d'arrêt » dans le logiciel de contrôle Pro Data.Poussez la solution enzymatique du piston d'entraînement F à travers le circuit de flux en soulevant manuellement le piston d'entraînement correspondant. Revenez au logiciel de contrôle des données pro pour régler le temps d'acquisition à 60 secondes. Vérifiez que les deux seringues d'entraînement sont remplies avec leurs solutions respectives et que les pistons d'entraînement sont en contact avec les pistons des seringues d'entraînement.Placer les deux vannes en position d'entraînement et cliquer sur acquérir dans le logiciel de contrôle Pro Data pour effectuer l'essai. Acquérir les données spectrales de la forme oxydée de l'enzyme en triple exemplaire en utilisant la valeur A 4 52 nanomètres obtenue lors des essais. Déterminer la concentration de l'enzyme avant mélange et préparer quatre millilitres de solution de N-A-D-P-H.Remplissez la seringue de réservoir C avec une solution de N-A-D-P-H 1,5 fois plus concentrée, puis videz et remplissez à nouveau la seringue d'arrêt trois fois, comme indiqué précédemment. Ensuite, enregistrez les spectres pendant la réduction de l'enzyme, en rinçant le contenu du circuit d'écoulement avec un tampon phosphate de potassium anaérobie 100 millimolaire, pH 7,5. Cliquez maintenant sur « baseline » dans le logiciel de contrôle des données Pro.Ensuite, mélanger 200 microlitres de solution mère d'enzyme avec 1000 microlitres de tampon phosphate de potassium anaérobie à 100 millimolaire, pH 7,5. Remplacer la solution dans la seringue réservoir A par la solution d'enzyme.Placer la vanne A en position d'entraînement dans le logiciel de contrôle Pro Data. Cliquer sur « Arrêter la seringue vide ». Pousser la solution d'enzyme depuis la seringue d'entraînement A à travers le circuit d'écoulement en relevant manuellement le piston d'entraînement correspondant.Régler le temps de délai sur 0,5 seconde et le temps d'acquisition sur 60 secondes. Vérifier que toutes les seringues d'entraînement sont remplies avec leurs solutions respectives et que les tiges d'entraînement sont en contact avec les pistons des seringues d'entraînement. Ensuite, placer toutes les valves d'entraînement en position d'entraînement et cliquer sur acquérir dans le logiciel de contrôle des données pro.Obtenez des données spectrales de la forme oxydée de l'enzyme en triple exemplaire. Ensuite, remplacez la solution de la seringue réservoir B par une solution de N-A-D-P-H, 1,5 fois plus concentrée que la solution d'enzyme dans la seringue A. Placez la vanne B en position d'entraînement et videz puis remplissez à nouveau la seringue d'arrêt trois fois, comme indiqué précédemment dans la fenêtre du panneau de contrôle.Régler le temps de délai à 0,5 seconde. Après une acquisition de 20 secondes, remplacer la solution dans la seringue réservoir par du tampon oxygéné. Placer la vanne C en position d'entraînement.Effectuez trois rinçages dans le logiciel de contrôle pro data. Réglez le temps de délai à 15 secondes et le temps d'acquisition à 900 secondes. Poursuivez l'acquisition des spectres pendant la réoxydation de l'enzyme entièrement réduite dans l'appareil à arrêt d'écoulement.La réduction anaérobie de SID A avec le N-A-D-P-H peut être suivie en mesurant les variations de l'état rédox du flavine par absorption à 452 nm. Les changements spectraux sont enregistrés au cours du temps, depuis la forme oxydée de SID A jusqu'au spectre final de SID A entièrement réduit. La vitesse de cette étape enzymatique peut être déterminée en ajustant les données à l'équation appropriée. La vitesse d'oxydation et les intermédiaires réactionnels peuvent également être déterminées en utilisant le mode de mélange double du système d'arrêt d'écoulement dans cette réaction par AF Sid A. L'intermédiaire hydroxyflavine C quatre A est clairement détecté avec un lambda max à 380 nanomètres, tandis que l'enzyme oxydée présente un lambda max à 450 nanomètres.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre à six heures si elle est effectuée correctement. N'oubliez pas de vous assurer que les solutions sont anaérobies. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'étudier à la fois l'ion relatif et l'ion ulcératif de la FLA indépendante, en vue d'expériences ultérieures comme la chimie rapide.Quentin peut aider à élucider la nature triste des intermédiaires.

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Source:Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Oroboros InstrumentsCette vidéo explique comment le flux d’oxygène est utilisé pour évaluer la respiration mitochondriale dans les cellules de mammifères vivantes et perméabilisées. Il démontre l’utilisation séquentielle de la digitonine, des substrats métaboliques, de l’ADP, d’un découpleur et d’un inhibiteur pour caractériser différents états respiratoires. Le profil de flux d’oxygène qui en résulte révèle la fonction...

Mesures du flux d’oxygène pour évaluer la respiration mitochondriale dans les cellules vivantes et perméabilisées

Surveillance en temps réel permet une optimisation rapide des réactions effectuées en utilisant un traitement en flux continu. Ici, la préparation de 3-acetylcoumarin est utilisé à titre d'exemple. Appareil pour effectuer une surveillance in-situ Raman est décrite, de même que les étapes nécessaires pour optimiser la réaction.

Suivi en temps réel de réactions effectuées en utilisant traitement en flux continu: la préparation du 3-Acetylcoumarin comme un exemple

Les mitochondries contiennent plusieurs enzymes de flavin-dépendante qui peuvent produire des espèces réactives de l’oxygène (ROS). ROS de surveillance communiqué de sites individuels dans les mitochondries est difficile en raison de réactions secondaires indésirables. Nous présentons une méthode simple et peu coûteuse pour une évaluation directe des tarifs natives pour libération ROS en utilisant flavoenzymes purifiée et microplaque fluorométrie.

Mesure simultanée de superoxyde/eau oxygénée et NADH Production de Flavin-contenant des déshydrogénases mitochondriales

Nous présentons ici un protocole pour la purification de protéine anaérobie, la concentration de protéines anaérobie et ultérieure caractérisation cinétique à l’aide d’un système d’électrodes de l’oxygène. La méthode est illustrée à l’aide de l’enzyme DesB, une enzyme dioxygénase qui est plus stable et plus active lorsque purifié et stockées dans un environnement anaérobie.

Purification de protéine anaérobie et l’analyse cinétique via la sonde à oxygène pour l’étude de l’Inhibition et l’activité DesB Dioxygenase

Nous présentons ici un protocole afin d’étudier le mécanisme moléculaire de la translocation des protons à travers les membranes lipidiques des liposomes unique, à l’aide du cytochrome bo3  à titre d’exemple. Combinant l’électrochimie et la microscopie de fluorescence, les variations de pH dans la lumière des vésicules unique, contenant un seul ou plusieurs enzymes, peuvent être détectés et analysés individuellement.

Mesures de Liposome unique pour l’étude des Enzymes membranaires Proton-pompage, à l’aide de l’électrochimie et microscopie fluorescente

L’évaluation de la phosphorylation oxydative à l’aide de respiromètres à haute résolution est devenue une partie intégrante de l’analyse fonctionnelle des mitochondries et du métabolisme énergétique cellulaire. Ici, nous présentons des protocoles pour l’analyse du métabolisme énergétique cellulaire à l’aide de respiromètres haute résolution à chambre et à microplaques et discutons des principaux avantages de chaque appareil.

La respirométrie à haute résolution pour évaluer la bioénergétique dans les cellules et les tissus à l’aide de respiromètres à chambre et à plaques

Nous proposons ici un protocole systématisé, accessible et reproductible pour détecter les espèces réactives cellulaires de l’oxygène (ROS) à l’aide d’une sonde de diacétate de 2′,7′-dichlorofluorescéine (DCFH-DA) dans les cellules gliales de Müller (MGC). Cette méthode quantifie les niveaux de ROS cellulaires totaux à l’aide d’un cytomètre en flux. Ce protocole est très facile à utiliser, adapté et reproductible.

Quantification des espèces réactives de l’oxygène à l’aide de la sonde de diacétate de dichlorofluorescéine 2′,7′-dichlorofluorescéine et de la cytométrie en flux dans les cellules gliales de Müller

La respirométrie à haute résolution couplée à des capteurs de fluorescence détermine la consommation mitochondriale d’oxygène et la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Le présent protocole décrit une technique pour évaluer la fréquence respiratoire mitochondriale et la production de ROS dans le nerf sciatique perméabilisé.

Évaluation de la fonction mitochondriale dans le nerf sciatique par respirométrie à haute résolution

Ici, nous montrons que la chambre de 0,5 mL pour la respirométrie à haute résolution montre des résultats qui sont cohérents avec la chambre de 2,0 mL si une correction instrumentale appropriée du bruit de fond O2 est appliquée. Il nécessite moins d’échantillon, ce qui est avantageux pour les études dont la disponibilité est limitée ou dont les capacités respiratoires sont faibles.

Respirométrie à haute résolution dans une chambre de petit volume

Méthodes de bio-imagerie utilisées pour évaluer la biodistribution des cellules de nanoparticules sont applicables pour la surveillance thérapeutique et diagnostique de composés nanoformulated. Les méthodes décrites ici sont sensibles et spécifiques lorsqu'ils sont évalués par des coregistration histologique. Les méthodologies de fournir une voie de translation des rongeurs à des applications humaines.

Bioimaging enregistré des nanomatériaux pour la surveillance des services diagnostiques et thérapeutiques

Découvrez la spectrophotométrie stopped-flow pour analyser les demi-réactions réductives et oxydatives de SidA, une monooxygénase flavine-dépendante d'Aspergillus fumigatus. Cette méthode permet de mesurer les constantes de vitesse des intermédiaires réactionnels.

Suivi des réduction et par oxydation demi-réactions dune monooxygénase flavine-dépendante à laide Stopped-Flow Spectrophotométrie (Vidéo) | JoVE Journal

Suivi des réduction et par oxydation demi-réactions d'une monooxygénase flavine-dépendante à l'aide Stopped-Flow Spectrophotométrie

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