Name: Un crible génétique pour isoler Toxoplasma gondii Mutants Egress de la cellule hôte (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: Découvrez une méthode de criblage phénotypique pour isoler des mutants de Toxoplasma gondii présentant des défauts de sortie de la cellule hôte à température sensible. Cette approche enrichit efficacement les populations mutantes et permet d'étudier les mécanismes moléculaires de l'égression parasitaire.

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Ce travail a été financé par l&#39;American Heart Association scientifique de développement 0635480N Grant et National Institutes of Health des subventions de recherche AI081220. BIC est soutenu par une Templiers Eye Foundation subvention de recherche.

<ol><li>Carruthers, V. B., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+and+acetaldehyde+elevate+intracellular+%5BCa2%2B%5D+and+stimulate+microneme+discharge+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Ethanol and acetaldehyde elevate intracellular [Ca2+] and stimulate microneme discharge in Toxoplasma gondii.</a> Biochem. J. 342 (Pt 2), 379-386 (1999).</li>
<li>Moudy, R., Manning, T. J., Beckers, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+loss+of+cytoplasmic+potassium+upon+host+cell+breakdown+triggers+egress+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The loss of cytoplasmic potassium upon host cell breakdown triggers egress of Toxoplasma gondii.</a> J. Biol. Chem. 276 (44), 41492-41501 (2001).</li>
<li>Silverman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+activation+of+the+Toxoplasma+gondii+nucleoside+triphosphate+hydrolase+leads+to+depletion+of+host+cell+ATP+levels+and+rapid+exit+of+intracellular+parasites+from+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Induced activation of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase leads to depletion of host cell ATP levels and rapid exit of intracellular parasites from infected cells.</a> J. Biol. Chem. 273 (20), 12352-12359 (1998).</li>
<li>Stommel, E. W., Ely, K. H., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+dithiol-induced+Ca2%2B+flux+causes+egress+of+parasites+from+the+parasitophorous+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: dithiol-induced Ca2+ flux causes egress of parasites from the parasitophorous vacuole.</a> Exp. Parasitol. 87 (2), 88-97 (1997).</li>
<li>Fruth, I. A., Arrizabalaga, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+induction+of+egress+by+the+potassium+ionophore+nigericin%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: induction of egress by the potassium ionophore nigericin.</a> Int. J. Parasitol. 37 (14), 1559-1567 (2007).</li>
<li>Endo, T., Sethi, K. K., Piekarski, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+calcium+ionophore+A23187-mediated+exit+of+trophozoites+from+infected+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: calcium ionophore A23187-mediated exit of trophozoites from infected murine macrophages.</a> Exp. Parasitol. 53 (2), 179-188 (1982).</li>
<li>Hoff, E. F., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+Toxoplasma+egress+the+first+step+in+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Is Toxoplasma egress the first step in invasion.</a> Trends Parasitol. 18 (6), 251-255 (2002).</li>
<li>Wetzel, D. M., Chen, L. A., Ruiz, F. A., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-mediated+protein+secretion+potentiates+motility+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium-mediated protein secretion potentiates motility in Toxoplasma gondii.</a> J. Cell. Sci. 117 (Pt 24), 5739-5748 (2004).</li>
<li>Lourido, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+protein+kinase+1+is+an+essential+regulator+of+exocytosis+in+Toxoplasma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent protein kinase 1 is an essential regulator of exocytosis in Toxoplasma.</a> Nature. 465 (7296), 359-362 (2010).</li>
<li>Arrizabalaga, G., Ruiz, F., Moreno, S., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionophore-resistant+mutant+of+Toxoplasma+gondii+reveals+involvement+of+a+sodium%2Fhydrogen+exchanger+in+calcium+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ionophore-resistant mutant of Toxoplasma gondii reveals involvement of a sodium/hydrogen exchanger in calcium regulation.</a> J. Cell. Biol. 165 (5), 653-662 (2004).</li>
<li>Black, M. W., Arrizabalaga, G., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionophore-resistant+mutants+of+Toxoplasma+gondii+reveal+host+cell+permeabilization+as+an+early+event+in+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ionophore-resistant mutants of Toxoplasma gondii reveal host cell permeabilization as an early event in egress.</a> Mol. Cell. Biol. 20 (24), 9399-9408 (2000).</li>
<li>Chandramohanadas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apicomplexan+Parasites+Co-Opt+Host+Calpains+to+Facilitate+Their+Escape+from+Infected+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Apicomplexan Parasites Co-Opt Host Calpains to Facilitate Their Escape from Infected Cells.</a> Science. , (2009).</li>
<li>Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+screen+to+dissect+Toxoplasma+gondii+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).</li>
<li>Pfefferkorn, E. R., Pfefferkorn, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+isolation+and+preliminary+characterization+of+temperature-sensitive+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: isolation and preliminary characterization of temperature-sensitive mutants.</a> Exp. Parasitol. 39 (3), 365-376 (1976).</li>
<li>Pfefferkorn, E. R., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+use+of+mutants+to+study+the+host-parasite+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Ciba.+Found.+Symp%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: use of mutants to study the host-parasite relationship.</a> Ciba. Found. Symp. 99, 74-91 (1983).</li>
<li>Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+complementation+in+apicomplexan+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genetic complementation in apicomplexan parasites.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (9), 6304-6309 (2002).</li>
<li>White, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+rescue+of+a+Toxoplasma+gondii+conditional+cell+cycle+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic rescue of a Toxoplasma gondii conditional cell cycle mutant.</a> Mol. Microbiol. 55 (4), 1060-1071 (2005).</li>
<li>Gubbels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+Genetic+Analysis+of+the+Apicomplexan+Cell+Division+Cycle+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Forward Genetic Analysis of the Apicomplexan Cell Division Cycle in Toxoplasma gondii.</a> PLoS Pathog. 4 (2), e36-e36 (2008).</li>
<li>Carruthers, V. B., Hakansson, S., Giddings, O. K., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+uses+sulfated+proteoglycans+for+substrate+and+host+cell+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii uses sulfated proteoglycans for substrate and host cell attachment.</a> Infect. Immun. 68 (7), 4005-4011 (2000).</li>
<li>Camps, M., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+selective+killing+of+extracellular+parasites+by+oxidation+using+pyrrolidine+dithiocarbamate%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: selective killing of extracellular parasites by oxidation using pyrrolidine dithiocarbamate.</a> Exp. Parasitol. 98 (4), 206-214 (2001).</li>
<li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods Cell Biol. 45, 27-63 (1994).</li>
<li>Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+growth+assay+for+Toxoplasma+gondii+using+yellow+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-throughput growth assay for Toxoplasma gondii using yellow fluorescent protein.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 47 (1), 309-316 (2003).</li>
<li>Carey, K. L., Westwood, N. J., Mitchison, T. J., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+approach+to+studying+invasive+mechanisms+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A small-molecule approach to studying invasive mechanisms of Toxoplasma gondii.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (19), 7433-7438 (2004).</li>
<li>Kafsack, B. F., Carruthers, V. B., Pineda, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+modeling+of+Toxoplasma+gondii+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetic modeling of Toxoplasma gondii invasion.</a> J. Theor. Biol. 249 (4), 817-825 (2007).</li>
<li>Hanash, S. M., Boehnke, M., Chu, E. H., Neel, J. V., Kuick, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonrandom+distribution+of+structural+mutants+in+ethylnitrosourea-treated+cultured+human+lymphoblastoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Nonrandom distribution of structural mutants in ethylnitrosourea-treated cultured human lymphoblastoid cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85 (1), 165-169 (1988).</li>
<li>Kafsack, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+membrane+disruption+by+a+perforin-like+protein+facilitates+parasite+exit+from+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rapid membrane disruption by a perforin-like protein facilitates parasite exit from host cells.</a> Science. 323 (5913), 530-533 (2009).</li>
<li>Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+microneme+secretion+involves+intracellular+Ca%282%2B%29+release+from+inositol+1%2C4%2C5-triphosphate+%28IP%283%29%29%2Fryanodine-sensitive+stores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores.</a> J. Biol. Chem. 277 (29), 25870-25876 (2002).</li>
<li>Nagamune, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abscisic+acid+controls+calcium-dependent+egress+and+development+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Abscisic acid controls calcium-dependent egress and development in Toxoplasma gondii.</a> Nature. 451 (7175), 207-210 (2008).</li>
<li>Tomita, T., Yamada, T., Weiss, L. M., Orlofsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Externally+triggered+egress+is+the+major+fate+of+Toxoplasma+gondii+during+acute+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Externally triggered egress is the major fate of Toxoplasma gondii during acute infection.</a> J. Immunol. 183 (10), 6667-6680 (2009).</li>
<li>Persson, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+receptor+ligation+or+exposure+to+perforin+trigger+rapid+egress+of+the+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Death receptor ligation or exposure to perforin trigger rapid egress of the intracellular parasite Toxoplasma gondii.</a> J. Immunol. 179 (12), 8357-8365 (2007).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

<html> Le protocole décrit fournit une méthode efficace pour isoler des mutants de Toxoplasma avec un défaut de sortie. Nous avons réussi à isoler des mutants ainsi que différentes étapes de la voie de sortie, dont certains ont un phénotype invasion double 13. Les effets potentiels sur l&#39;invasion peut être déterminé en utilisant la soi-disant test rouge-vert, ce qui différencie envahi de non-envahis par des parasites coloration des anticorps différentiel 23,24. Pour les tests d&#39;inva...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> ENU </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N3385 </td><td> 1 Stock M dans le DMSO, conserver à -20 ° C </td></tr><tr><td> EMS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0880 </td><td> 1 Stock M dans le DMSO, conserver à -20 ° C </td></tr><tr><td> Sulfate de Dextran </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4911 </td><td></td></tr><tr><td> PDTC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8765 </td><td> 100 Stock mM dans du PBS </td></tr><tr><td> Diff Quick </td><td> EMD Chemicals </td><td> 65044-93 </td><td></td></tr><tr><td> Porte-filtre </td><td> Cole-Parmer </td><td> 540100 </td><td></td></tr><tr><td> 3 um filtre en polycarbonate </td><td> WhatmanSchleicher &amp; Schuell </td><td> 110612 </td><td></td></tr><tr><td> Hémocytomètre </td><td> Hausser scientifique </td><td> 1475 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 incubateurs </td><td> Divers fabricants </td><td></td><td> Humidifié, 5% de CO 2, à 35, 37 et 40 ° C </td></tr><tr><td> Microscope à fluorescence </td><td> Divers fabricants </td><td></td><td> Idéalement inversé, à grand champ avec l&#39;objectif de l&#39;huile 63x ou 100x </td></tr></tbody></table> HBSSc (selon Black et al 11.): <ul><li> 98,0 ml Hanks Balanced Salt Solution (numéro de catalogue Hyclone SH30588) </li><li> 100 MgCl ul 1M 2 (100 mM fin) </li><li> 100 pi 1M CaCl 2 (100 mM fin) </li><li> 2,0 ml 1M Hepes pH 7,3 (20 mM fin) </li><li> 84 mg de NaHCO 3 (10 mM fin) </li></ul>

un crible génétique pour isoler toxoplasma gondii mutants egress de la cellule hôte

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Le répandue, intracellulaire obligatoire, parasite protozoaire Toxoplasma gondii qui cause la maladie opportuniste dans les patients immunodéprimés et provoque des malformations congénitales lors de l&#39;infection congénitale. Le cycle de réplication lytique est caractérisée par trois étapes: 1. invasion active d&#39;une cellule hôte nucléé; 2. réplication dans la cellule hôte; 3. évacuation connexion de la cellule hôte. Le mécanisme de sortie est de plus en plus apprécié comme un processus unique et très réglementé, qui est encore mal comprise au niveau moléculaire. Les voies de signalisation qui sous-tendent l&#39;évacuation ont été caractérisées par l&#39;utilisation d&#39;agents pharmacologiques agissant sur ​​les différents aspects des voies 1-5. En tant que tel, plusieurs déclencheurs indépendants d&#39;évacuation ont été identifiées qui convergent toutes sur la libération de Ca 2 + intracellulaire, un signal qui est également critique pour l&#39;invasion des cellules d&#39;accueil 6-8. Cette idée a informé une approche gène candidat qui a conduit à l&#39;identificationfication de la plante comme la protéine kinase dépendante du calcium (CDPK) impliqués dans l&#39;évacuation 9. En outre, quelques avancées récentes dans la compréhension de sortie ont été réalisés en utilisant (chimique) des approches génétiques 10-12. Pour combiner la richesse de l&#39;information pharmacologique de l&#39;accessibilité croissante génétique de Toxoplasma nous avons récemment créé un écran permettant l&#39;enrichissement de mutants du parasite avec un défaut de sortie cellule hôte 13. Bien que la mutagenèse chimique utilisant le N-éthyl-N-nitroso-urée (ENU) ou le méthanesulfonate d&#39;éthyle (EMS) a été utilisé pendant des décennies dans l&#39;étude de la biologie Toxoplasma 11,14,15, n&#39;est que récemment que la cartographie génétique des mutations qui sous-tendent les phénotypes devenu une routine 16 -18. En outre, en générant des mutants sensibles à la température, les processus essentiels peuvent être disséqués et les gènes sous-jacents directement identifié. Ces mutants se comporter comme de type sauvage en vertu de la température permissive (35 ° C), mais ne parviennent pas à proliferate à la température restrictive (40 ° C) en tant que résultat de la mutation en question. Ici, nous illustrer une nouvelle méthode de criblage phénotypique à isoler des mutants avec un phénotype sensible à la température de sortie 13. Le défi pour les écrans d&#39;évacuation est de séparer est sorti de non-évacué parasites, qui est compliqué par la ré-invasion rapide et collant générale des parasites aux cellules hôtes. Un écran de sortie a été précédemment établi sur la base d&#39;une série d&#39;étapes lourdes biotinylation de séparer intracellulaire de parasites extracellulaires 11. Cette méthode n&#39;a pas non plus générer des mutants conditionnels résultant de phénotypes faibles. La méthode décrite ici surmonte le fort attachement de egressing parasites en incluant un concurrent glycane, le sulfate de dextrane (DS), qui empêche les parasites de coller à la cellule 19 hôte. En outre, les parasites extracellulaires sont spécifiquement tué par la pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), ce qui laisse des parasites intracellulairessains et saufs 20. Par conséquent, avec un nouvel écran phénotypique spécifiquement isoler des mutants de parasites avec les défauts de sortie induite, la puissance de la génétique peuvent désormais être pleinement déployé à élucider les mécanismes moléculaires qui sous-tendent l&#39;évacuation cellule hôte.

Transférer la génétique est une méthode puissante pour percer au niveau moléculaire de la façon dont<em&gt; Toxoplasma</em&gt; Egresses de sa cellule hôte. Les protocoles sont fournis à chimiquement mutagénéiser parasites, d&#39;enrichir de mutants présentant des défauts dans l&#39;évacuation induite, et de valider le phénotype des mutants clonés.

Un crible génétique pour isoler Toxoplasma gondii Mutants Egress de la cellule hôte

Le parasite protozoaire intracellulaire obligatoire et largement répandu Toxoplasma gondii provoque des maladies opportunistes chez les patients immunodéprimés et cause des malformations congénitales...

Ce vidéo illustre une nouvelle méthode de criblage phénotypique permettant d'isoler des mutants présentant un phénotype de sortie sensible à la température. Un mutagène et des parasites sont appliqués à des cultures de fibroblastes humains du prépuce infectés par Toxoplasma. Pendant deux heures, les parasites non envahissants sont éliminés et le flacon est transféré à 40 degrés Celsius afin d'induire le développement du phénotype.Après 26 heures, les vacuoles contiennent huit à 16 parasites. Ensuite, les cellules sont stimulées par des composés inducteurs de l'échappement. Les parasites mutants présentant un défaut d'échappement resteront intracellulaires, tandis que les parasites de type sauvage sortiront dans le milieu.Les parasites de type sauvage sont éliminés par lavage et les cellules restantes sont à nouveau incubées à 35 degrés Celsius afin d'enrichir la population de mutants. Enfin, le phénotype mutant est vérifié et des clones individuels de parasites sont isolés à partir de la population enrichie par dilution limitante. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la méthode d'inhalation bio, est que l'enrichissement spécifique des mutants d'excystation est nettement plus efficace.Nous avons obtenu pour la première fois l'ID de cette méthode lorsque nous avons identifié un mutant d'échappement parmi un ensemble de mutants présentant des défauts de croissance. À l'aide de ce mutant, nous avons optimisé la procédure de criblage en le mélangeant à des parasites de type sauvage selon différents rapports. La procédure sera démontrée par Bradley Coleman, un postdoctorant de mon laboratoire.Cette procédure utilise des composés et des liquides hautement mutagènes ainsi que le parasite infectieux. Toxoplasma Gandhi, l'utilisation d'équipements de protection appropriés, notamment une blouse de laboratoire, des gants doubles et une hotte de sécurité biologique, est essentielle. Tout déchet liquide généré doit être recueilli séparément pour une élimination adéquate.Commencez par inoculer des cellules de fibroblastes de prépuce humain ou des cellules HFF confluentes avec un millilitre de tachy Lloyds fraîchement lysés dans un milieu. Ensuite, placez le flacon dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 pendant 18 à 25 heures. Le lendemain, remplacez le milieu par 10 millilitres de milieu contenant 0,1 % de sérum de veau fœtal et incubez à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.Après l'incubation, ajouter zéro, 12,5, 25, 50 ou 100 microlitres de mutagène ENU par flacon. Les dilutions de travail seront respectivement de 1,25, 2,55 et 10 millimolaires. Ajouter jusqu'à 100 microlitres de DMSO dans chaque flacon.Incuber pendant quatre heures dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Rincer la monocouche avec 10 millilitres de PBS froid, 3 fois pendant 10 secondes. Ajouter 5 millilitres de PBS et utiliser un grattoir à cellules pour détacher la monocouche.Ensuite, à l’aide de ciseaux robustes, couper l’extrémité du capuchon de l’aiguille afin que l’aiguille ne soit pas exposée. Puis, transférer les cellules dans une seringue et les faire passer à travers une aiguille de calibre 26,5. Pour détacher physiquement le parasite des fibroblastes, plusieurs passages à l’aiguille augmenteront l’efficacité du relâchement des parasites hors de la cellule hôte.Fixez un filtre en polycarbonate de 3,0 micromètre à une seringue. Chargez l'aiguille avec les cellules en excès dans la seringue et faites-les passer à travers le filtre dans un tube afin de déposer les parasites sur un hémocytomètre pour le comptage. L'aspect le plus difficile de cette procédure consiste à distinguer les parasites des débris.Pour assurer le succès, il est important de laisser les parasites se déposer avant de les compter. Après avoir attendu cinq minutes pour permettre aux parasites de se déposer, effectuez le décompte. Une fois la concentration de toxoplasmes déterminée, diluez-les à 3 333 parasites par millilitre dans du ED un pour 10 millilitres.33 333 parasites sont nécessaires. Ajouter trois millilitres dans le premier puits d'une plaque de six puits contenant des cellules HFF pour les inoculer avec 10 000 parasites. Ensuite, diluer les parasites de façon sérielle d'un facteur dix sur les trois puits suivants en transférant 300 microlitres d'un puits à l'autre.Laisser les plaques indisturbées dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant sept jours. Après une semaine, aspirer le milieu et fixer les cellules en ajoutant trois millilitres d’éthanol à 100 % dans chaque puits pendant 15 minutes. Après élimination de l’éthanol, colorer les cellules en ajoutant trois millilitres de solution de violet de crésyl dans chaque puits pendant 15 minutes.Enfin, rincez chaque puits avec trois millilitres de PBS pendant une minute. Une fois la plaque sèche, comptez les plaques et sélectionnez la concentration de mutagène nécessaire pour obtenir une survie de 30 % des parasites exposés. Une dose entraînant une mortalité de 70 % a été utilisée historiquement et induit moins de 100 mutations ponctuelles par génome.L'étape suivante de la procédure consiste à enrichir les mutants d'échappement dans la population. Une fois la population amplifiée, ajouter 120 000 parasites fraîchement lysés à des cellules HFF confluentes dans 10 millilitres. Incuber DE un pendant deux heures à 35 degrés Celsius.Cela synchronisera la population en limitant le temps d'envahissement. Après l'incubation, aspirez le milieu et rincez les cellules pendant 10 secondes avec 10 millilitres de PBS froid, puis ajoutez 10 millilitres de milieu ED un supplémenté avec 25 milligrammes par millilitre de dextrane sulfate.Cela saturera les protéines de surface liant les glycanes sur les parasites, leur permettant de se réattacher et de réinfecter la cellule hôte. Incuber le flacon pendant 26 heures dans un incubateur humide à 40 degrés Celsius avec 5 % CO2. Pendant cette période, les protéines normalement repliées seront remplacées par des protéines sensibles à la température mal repliées.Le lendemain, diluer l'inducteur d'échappement de choix à la concentration de travail dans un tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres de H-B-S-S-C supplémenté avec 25 milligrammes par millilitre de dextrane sulfate. Placer le tube dans un bain-marie pour préchauffer la solution pendant 30 minutes.Aspirez le milieu des flacons infectés par le parasite et ajoutez la solution inductrice d'échappement préchauffée. Incubez à 37 degrés Celsius comme indiqué dans le document joint. Ensuite, aspirez le milieu et rincez pendant 10 secondes.Avec 10 millilitres de PBS froid, ajoutez 10 millilitres de milieu ED un supplémenté avec 25 milligrammes par millilitre de dextrane sulfate et 50 micromoles de pyridine DIO carbamate, puis incubez pendant cinq heures à 35 degrés Celsius. Après l'incubation, aspirez le milieu et rincez une fois avec du PBS pendant 10 secondes.Ensuite, ajoutez 10 millilitres. EED un milieu moyen, replacez le flacon dans l'incubateur à 35 degrés Celsius. Agitez quotidiennement pour disperser les parasites sortants.Poursuivre l'incubation jusqu'à ce que les parasites détruisent la monocouche. Environ sept jours après le criblage d'enrichissement, la population est repiquée pour un seul passage. Ensuite, les phénotypes sont confirmés par un test de sortie (egress assay).Inoculer 20 000 parasites dans chaque puits d'une plaque de 24 puits contenant des cellules HFF confluentes cultivées sur des lamelles, puis incuber pendant huit heures dans une étuve à 35 degrés Celsius afin de permettre l'invasion de tous les parasites présents dans le milieu à la température permise. Ensuite, transférer la plaque dans une étuve à 40 degrés Celsius pendant 24 heures pour induire le phénotype et faire croître des parasitophores contenant de huit à 24 parasites, après avoir lavé chaque puits avec un millilitre de PBS pendant 10 secondes. À température ambiante, ajouter un millilitre d'inducteur d'échappement préalablement réchauffé et dilué dans du H-B-S-S-C, puis incuber pendant les durées indiquées dans le protocole écrit accompagnant.Aspirez le milieu et fixez en ajoutant un millilitre de méthanol à 100 % dans chaque puits, puis incubez pendant 15 minutes à température ambiante. Lavez ensuite avec un millilitre de PBS à température ambiante. Après le lavage et le montage des lames, utilisez un microscope équipé d'un objectif de 40 à 60 x pour déterminer le pourcentage de S en sortie par rapport aux vacuoles intracellulaires. Après validation du phénotype de la population enrichie de mutants en sortie, la population polyclonale est clonée afin d'obtenir des clones individuels de parasites.Après avoir déterminé la concentration parasitaire diluée à 500 parasites par millilitre dans un milieu ED un dans une plaque 384 puits contenant une monocouche confluente de cellules HFF, remplacer le milieu par 40 microlitres par puits de milieu ED un à l’aide d’une pipette multicanal. Quatre populations polyclonales représentées en rouge, bleu, jaune et vert.Dans cette illustration, on peut cloner sur une plaque pour atteindre cette pipette. 40 microlitres par puits de l'un des mutants dilués dans les puits C3 à C12, le mutant deux dans les puits C13 à C22, le mutant trois dans les puits H3 à H12, et le mutant quatre dans les puits H13 à H22. Le volume total dans chaque puits doit maintenant être de 80 microlitres.Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanal, pipeter la solution vers le haut et vers le bas cinq fois, puis transférer 40 microlitres vers la rangée située sous la rangée de départ. Poursuivre ces dilutions sérielles par deux fois à travers la rangée H pour les mutants un et deux ou la rangée N pour les mutants trois et quatre. Jeter les 40 microlitres supplémentaires provenant de la dernière rangée.Incuber dans un incubateur à 35 degrés Celsius pendant sept à dix jours sans perturber la plaque. La semaine suivante, examiner les puits au microscope inversé avec un objectif de 10 à 20 x pour détecter la présence de plaques uniques visibles sous forme de trous dans la monocouche. Prélever quatre puits par mutant présentant une plaque unique et transférer les parasites dans un flacon de culture tissulaire T 12,5 confluent avec des cellules HFF et rempli de cinq millilitres.Utilisez un milieu ED pour faire croître les parasites dans un incubateur à 35 degrés Celsius. Agitez les flacons quotidiennement pour disperser les parasites extracellulaires. Cela prend généralement sept jours.Des dosages en plaque ont été réalisés dans une plaque à six puits en utilisant différentes concentrations du mutagène EMS et divers nombres de parasites par puits. Comme illustré dans cette vidéo, les taches blanches observées dans les puits représentent des plaques de parasites formées dans la monocouche de HFF sur des plaques traitées avec de l'EMS. Les résultats de ces dosages en plaque ont permis d'établir des courbes de survie des parasites exposés à des doses croissantes d'EMS et d'ENU.La dose induisant une mortalité de 70 % a ensuite été choisie pour les expériences de mutagenèse. Dans une expérience différente, le pourcentage de phénotype mutant d'excavation dans la population après enrichissement a été évalué par cytométrie en flux, comme indiqué ici. Lorsque le rapport initial entre mutants d'excavation et parasites de type sauvage était de un sur 10 000, une pureté de 80 % a été obtenue grâce à l'enrichissement.Cependant, lorsque le rapport initial était d'un parasite sur 100 000, la population isolée ne représentait qu'un à 2 %. Ces données suggèrent que la puissance d'enrichissement de l'écran est mille fois supérieure. Dans une troisième expérience, l'échappement a été induit par l'ion calcium A23187. Sur ces images, les flèches indiquent quatre VAE différentes contenant quatre à huit parasites exprimant la YFP dans les témoins.Cependant, les flèches indiquent quatre groupes de parasites dispersés reflétant quatre évènements d'échappement indépendants. Ainsi, le rapport entre les phénotypes mutants et de type sauvage peut être facilement déterminé en comptant selon cette procédure. Des méthodes supplémentaires, telles que la complémentation cosmique ou le séquençage complet du génome, peuvent être réalisées pour identifier la mutation responsable et donc le gène d'intérêt.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de titrer un mutagène d'intérêt, de mutagéniser une population de parasites toxoplasmes et d'isoler des mutants individuels sensibles à la température pour l'échappement à partir de cette population mutagénisée. N'oubliez pas que le travail avec des parasites toxoplasmes résistants à la paraméthymine peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port de lunettes de sécurité doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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