Différenciation efficace des cellules souches embryonnaires de souris dans les neurones moteurs

L’objectif global de cette procédure est de différencier les cellules souches embryonnaires de souris en motoneurones. Première culture de souris, cellules souches embryonnaires sur fibroblastes embryonnaires de souris primaires et supplément de facteur inhibiteur de leucémie. Ensuite, améliorez le processus de normalisation en ajoutant la caboche BFG F et FGF huit induisent la spécification des motoneurones par incubation avec de l’acide rétinoïque et un agoniste lissé, qui est suivie d’une élongation axonale et d’une maturation des motoneurones.

Enfin, utilisez la microscopie à immunofluorescence pour examiner les cellules MES différenciées qui expriment une forte fluorescence GFP La génération de grandes quantités de motoneurones a facilité la recherche sur les maladies des motoneurones par rapport aux protocoles existants actuels. Cette approche de différenciation des cellules souches embryonnaires de souris en motoneurones est plus efficace. Cette méthode peut donner un aperçu de l’amyotrophie spinale.

Il peut également être appliqué à d’autres maladies des motoneurones telles que la sclérose latérale amyotrophique Pour plaquer les fibroblastes embryonnaires primaires de souris enrober quatre boîtes de culture tissulaire de 100 millimètres avec huit millilitres de solution de gélatine à 0,1 %. Après 30 minutes à température ambiante, jetez l’excès de liquide. Maintenant, diluez un flacon de mitomycine C dans le PMEF activé dans 40 millilitres de plaque de milieu PMEF sur les quatre plaques et cultivez jusqu’à une semaine.

Ensuite, décongelez un flacon de cellules MES dans un bain-marie à 37 degrés. Lavez les cellules avec cinq millilitres de média E ES dans un tube de 15 millilitres. Après centrifugation à 800 tr/min pendant cinq minutes.

Aspirez le surnageant et mettez en suspension les cellules MES dans 20 millilitres de milieu ES avec un facteur inhibiteur de leucémie fraîchement ajouté. Procéder au retrait d’un milieu de 10 millilitres des cultures PMEF et le remplacer par 10 millilitres de la suspension à trois cellules ES HBG. Surveiller la progression des cellules MES au fil du temps, depuis de petites colonies à 24 heures jusqu’à des colonies d’environ 100 micromètres de diamètre 72 heures après le placage.

Remplacer les milieux quotidiennement pour maintenir la prolifération des cellules pour l’induction des cellules MES. Différenciation en motoneurones. Les cellules souches embryonnaires de souris doivent d’abord être séparées des cellules nourricières PMEF, puis cultivées dans un environnement en suspension le jour de l’induction.

Pour chaque culture ES de 100 millimètres, préparez une fiole T one 50 recouverte de 0,1 % de gélatine Après 30 minutes à température ambiante, retirez l’excédent de gélatine et lavez-la trois fois avec du PBS. Continuez à aspirer soigneusement les milieux de la culture SE, en veillant à ne pas déloger les colonies faiblement attachées. Ensuite, laver une fois avec 10 millilitres de PBS.

Maintenant, pour séparer les cellules MES de PMEF, ajoutez trois millilitres de 0,25 % de trypsine EDTA et incubez pendant trois à cinq minutes. À 37 degrés Celsius, vérifiez que les cellules souches et le PMEF se sont détachés de la plaque. Ajoutez ensuite 15 millilitres de milieu ES frais et perturbez les colonies par pipetage.

Transférez la suspension cellulaire dans la fiole T one 50 enrobée de gélatine préparée, incubez pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius pour que la PFS se fixe à la surface gélatinisée. Récoltez maintenant les cellules MES flottantes dans un tube de 50 millilitres et granulez par centrification. Remettre en suspension les cellules dans 10 millilitres de différenciation neurale.

Milieu : dénombrer à l’aide d’un hémocytomètre, puis déposer une plaque sur une boîte de culture en suspension de 100 millimètres sur la différenciation. Le premier jour, vérifiez par microscopie que les cellules MES ont formé de petits agrégats flottants appelés corps embryonnaires. Depuis que tout FMP de transfert est fixé à la parabole, transférez les cellules de suspension ES et le milieu dans un tube de 15 millilitres, puis centrifugez à 500 tr/min pendant trois minutes.

Pour récolter les corps embryonnaires aspirés du milieu, ajoutez soigneusement 10 millilitres de différenciation neurale fraîche, milieu aux ebs granulés, puis plaquez les cellules dans une nouvelle culture bactérienne pendant 24 heures sur la différenciation. Le deuxième jour, faites tourner la boîte de culture et transférez le milieu et l’EBS dans un tube de 15 millilitres. Laissez l’EBS se stabiliser par gravité, puis aspirez soigneusement le milieu et suspendez à nouveau l’EBS et 10 millilitres de différenciation des motoneurones.

Culture moyenne EBS dans une nouvelle boîte bactérienne pendant cinq jours sur différenciation. Le septième jour, vérifiez que les EBS ont un diamètre d’environ 150 à 200 micromètres et expriment de forts signaux GFP lors de la différenciation. Le cinquième jour, deux jours avant de dissocier l’EBS, placez des lamelles rondes de 12 millimètres au fond d’une plaque de 24 puits.

Ajoutez ensuite 0,5 millilitre de 100 microgrammes par millilitre, de l’ornithine poly DL et incubez à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Aspirez les plaques de séchage à l’air poly DL ornithine et les lamelles dans une hotte de culture tissulaire. Rincez trois fois les puits de la plaque avec de l’eau distillée deux fois.

Laissez sécher à l’air libre pour enrober les lamelles. Faites une dilution fraîche de deux microgrammes par millilitre de laminine de souris dans cinq millilitres de XPBS glacé froid. Ajouter 0,5 millilitre par puits et incuber à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Laver deux fois avec du PBS sur la différenciation. Le septième jour, recueillez l’EBS dans un tube de 15 millilitres et laissez l’EBS se stabiliser par gravité. Après quatre lavages avec du PBS, ajoutez un millilitre d’ACU max à l’EBS, mélangez doucement et incubez pendant cinq minutes à température ambiante, puis aspirez l’excès d’ACU max couvrant l’EBS.

Ajoutez maintenant trois millilitres de milieu MND et dissociez EBS en pipetant environ 20 fois à l’aide d’une micro-pipette einor d’un millilitre, puis incubez pendant deux minutes à température ambiante, passez la suspension cellulaire à travers un capuchon d’entraînement de cellules dans un tube de 12 x 75 millimètres. Répétez cette étape de dissociation avec les amas et les cellules restants retenus par le filtre afin d’enrichir le rendement des cellules uniques dans une suspension finale de cellules uniques de six millilitres. Mélangez délicatement la suspension unicellulaire et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre, diluez les cellules dans un milieu MMN complet à une densité de deux fois 10 à la cinquième cellule par plaque de millilitre.

0,5 millilitre de suspension cellulaire par puits des 24 plaques de puits préparées contenant des lamelles recouvertes de poly DL ornithine laminin. Les cellules différenciées étendent de longs neurites après deux jours. En culture, HBG 3 est une lignée cellulaire ES dérivée d’une souris transgénique exprimant EGFP sous le contrôle d’un promoteur spécifique du motoneurone HB neuf avec un protocole de différenciation défini.

Les cellules MES peuvent être utilisées pour dériver des motoneurones. Les cellules MES indifférenciées forment des colonies rondes sur le dessus d’une couche nourricière de blastes. Ils ont une faible expression de la GFP.

Ces cellules MES ont été séparées des couches nourricières et cultivées sur des boîtes à faible fixation pour former des corps embryonnaires. Les cellules MES différenciées ont exprimé une forte fluorescence GFP après le septième jour. Les EBS de différenciation ont été dissociés et plaqués sur des plaques recouvertes de poly DL revêtues de laminine d’ornithine.

Les cellules différenciées étendent de longs neurites à partir des corps cellulaires des cellules en plaque après deux jours de culture, les motoneurones dérivés des cellules MES peuvent être caractérisés par coloration par immunofluorescence. Ces cellules positives à la GFP expriment le neurofilament marqueur panneuronal et les deux marqueurs spécifiques des motoneurones. La paupière une et la choline acétyl transférase DPI colorent les noyaux pris ensemble.

Notre protocole de différenciation en deux étapes fournit un moyen efficace de différencier les cellules MES en motoneurones spinaux. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez comprendre comment différencier efficacement les cellules souches embryonnaires de souris en motoneurones. En conclusion, rappelez-vous qu’une qualité élevée de cellules souches embryonnaires de souris est le paramètre le plus critique pour générer efficacement des motoneurones.