Name: La croissance de la Mycobacterium tuberculosis Les biofilms (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Découvrez une méthode de culture de biofilms de Mycobacterium tuberculosis à l'interface air-milieu et l'évaluation de la fréquence des persisters tolérants aux antibiotiques. Cette technique permet d'étudier les mécanismes de tolérance aux médicaments.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Le travail a été réalisé avec le soutien financier de l&#39;Institut national de la Santé et l&#39;American Lung Association.

1. Biofilms plus en plus de M. la tuberculose dans une bouteille de 250 mL vis plafonné <ol><li> La préparation des médias: Dissoudre 0,5 g de KH 2 PO 4, 0,5 g de MgSO 4, 4 g de L-asparagine, 2g d&#39;acide citrique, 0,05 g de citrate d&#39;ammonium ferrique, 60mL de glycérol dans 900 ml d&#39;eau. Ajuster le pH à 7,0 avec NaOH. Autoclave, frais et juste avant de commencer l&#39;expérience, ajouter stérile ZnSO 4 à une concentration finale de 0,1% p / v Depuis mc 2 7000 est un auxotrophe pantothénate cette souche nécessite également de l&#39;acide pantothénique à 10μg/mL de concentration finale. </li></ol> Note: Ceci est une composition standard des médias Sauton utilisés pour M. tuberculosis. Toutefois, si nécessaire d&#39;autres médias spécialisés peuvent également être utilisés pour d&#39;autres espèces de mycobactéries. <ol start="2"><li> La préparation des inoculums: Grow M. la tuberculose dans 7H9OADC avec 0,05% de Tween-80 pendant une semaine, ou DO 600 de 0,7 à 1,0. Le culture peut être directement utilisée comme inoculum à une dilution de 1:100. </li><li> Distribuer 25 ml de Sauton médias à une bouteille de 250 ml en polystyrène vis plafonné (Corning). Ajouter 250μl de l&#39;inoculum dans le milieu, bouchon de la bouteille très serré et le placer tranquillement dans un incubateur humidifié 37 ° C pendant 3 semaines. Observez la bouteille une fois par jour pour s&#39;assurer qu&#39;il n&#39;y a pas de contamination. </li><li> A la fin de la troisième semaine, dévisser le bouchon de la bouteille afin de permettre une nouvelle croissance de M. la tuberculose à l&#39;interface. Si le bouchon n&#39;est pas desserré, à ce stade, puis la concentration en oxygène insuffisante dans le conteneur va retarder la croissance des bactéries encore. </li></ol> 2. La croissance de M. biofilms tuberculose dans des plaques 12 puits <ol><li> Préparer les médias et l&#39;inoculum de mc 2 7000 tel que décrit dans les sections A1 et A2. </li><li> Mélanger 60 ml de médias avec 600μl d&#39;inoculum. Distribuer 4,5 millions deL du mélange dans chaque puits de la plaque. Recouvrir la plaque avec un couvercle. Envelopper la plaque à plusieurs reprises avec du parafilm. Incuber la plaque tranquillement dans incubateur humidifié à 37 ° C pendant 5 semaines. </li></ol> 3. Détermination de la fréquence des persistants de drogues tolérantes en M. la tuberculose biofilms <ol><li> Grow M. biofilms tuberculose dans un format de 12 puits comme décrit dans la section B. Cela va prendre un total d&#39;environ 5 semaines de. </li><li> Une fois que les biofilms sont élevés (après 5 semaines d&#39;incubation) d&#39;injecter votre choix de l&#39;antibiotique à une concentration désirée dans les médias sous les biofilms en utilisant une microsonde dans une pipette. </li></ol> Remarque: Le volume des médias sous les pellicules réduit à environ 3.0mL. Donc, les enquêteurs devraient donc calculer la quantité de médicament. <ol start="3"><li> Swirl doucement la plaque de sorte que l&#39;antibiotique est bien diffusé dans le milieu. Pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, injecter le antibiotiquesotique dans quatre puits. En parallèle, injecter le même volume de solvant dans lequel l&#39;antibiotique a été dissous dans quatre autres puits, et de laisser les quatre derniers puits de la plaque vierge. Recouvrir la plaque avec un couvercle et de mettre de nouvelles couches de parafilm autour de la plaque. Placez-le revenir dans l&#39;incubateur pour la période désirée. </li><li> À la fin de l&#39;incubation, ouvrir la plaque et ajouter le Tween-80 à la concentration finale de 0,1% (volume / volume) dans chacun des puits. Swirl toute la plaque en douceur pour la dispersion uniforme du détergent. Incuber la plaque à température ambiante pendant 15 minutes. Mélanger le contenu de chaque puits avec la pipette plusieurs fois afin que le contenu entier peut être uniformément transférés à un tube de 15 ml conique. </li><li> Centrifuger le contenu du tube à 4000rpm pendant 10 minutes à température ambiante. Reprendre le culot dans 5 ml de tampon de lavage fraîche (PBS avec 10% de glycérol et 0,05% de Tween-80). Répétez les trois temps de lavage. Reprendre le culot dans 5 ml de tampon de lavage. Gardez-le sur la bascule pour overnight à 4 ° C. </li></ol> Remarque: Bien que basse température a été initialement développé pour M. smegmatis (afin de minimiser sa croissance lors de la dispersion) et utilisé pour M. tuberculosis ainsi, les espèces à croissance lente peut très probablement être secoué à la température ambiante sans aucun impact sur ​​le résultat. Rocking à la température ambiante pourrait être nécessaire si vous travaillez dans BSL-3 installation. <ol start="6"><li> Préparer une seringue stérile équipée micropointe (2-200 pl), en coupant son extrémité la plus large à la taille appropriée, en l&#39;adaptant à la seringue et l&#39;envelopper avec du parafilm. Passez l&#39;ensemble du contenu du tube à travers la seringue à embout-équipée et recueillir dans un des tubes de 15 ml frais. Répétez cette étape 5 à 6 fois jusqu&#39;à ce que vous observez une suspension assez homogène. </li><li> Préparer des dilutions en série de la suspension et la plaque des dilutions sur la plaque 7H11OADC pour déterminer le nombre de colonies viables dans chaque puits. Incuber les boîtes pendant trois semaines à 37 ° C incubateur. Déterminer la fréCY d&#39;objets persistants dans la population biofilm en calculant le rapport du nombre de colonies obtenues dans antibiotique traitée à celles obtenues lors de solvant plaques traitées. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Lorsqu&#39;elle est cultivée dans une bouteille, la croissance de M. la tuberculose peut être vu à la base de la bouteille à la fin de la première semaine. À la fin de la deuxième semaine, la croissance inégale des bactéries sur l&#39;interface air-support peut être vu, même si la croissance à l&#39;interface air-media est toujours visible à la fin de la troisième semaine (fig. 1A). À ce moment de la fixation des bactéries à la paroi du récipient est également observée. A partir de ce point de la croissance de la culture se fait principalement sur l&#39;interface air-médias. Le liquide sous la surface de la croissance est clair. En règle générale, la structure évolue d&#39;ici la fin de la cinquième semaine (figure 1B). Si l&#39;incubation est prolongée, les structures de va commencer à couler au fond du récipient. Curieusement,serrage du bouchon jusqu&#39;à la fin de la troisième semaine est une étape importante dans le processus, et pour des raisons inconnues une bouteille lâche-capped retarde significativement l&#39;initiation de la croissance sur l&#39;interface 9. Dans le format de 12 puits, un biofilm robuste à l&#39;interface air-médiatique est perçue dans chacun des puits à la fin de cinq semaines (figure 2A). Si les plaques ne sont pas enveloppés complètement, puis la croissance du biofilm différentiel est observée. Dans le pire des cas, l&#39;évaporation importante des médias peuvent retarder la croissance des bactéries (figure 2B). Ainsi, l&#39;emballage de la plaque est nécessaire à la fois pour empêcher l&#39;évaporation ainsi que de fournir un environnement pour la formation de biofilm (voir paragraphe précédent). Le nombre de bacilles viables dans les biofilms déterminés avec cette technique est tout à fait reproductible. Réponse de M. tuberculose biofilms varie avec la nature des antibiotiques. Pour un antibiotique bactéricide tels que la rifampicine, la perte de la viabilité suit une bipha<html> tendance sic 9. Un déclin rapide de la viabilité au cours des trois à quatre premiers jours, suivie d&#39;une phase persistante dans laquelle un petit pourcentage de la population restent totalement récalcitrant aux antibiotiques, quelle que soit la concentration de l&#39;antibiotique ou le temps d&#39;exposition. La figure 3 montre le nombre de bacilles viables dans les biofilms matures après une exposition de 7 jours à 50μg/mL (50 fois plus élevé que le MIC) de la rifampicine. <img alt="Figure 1A." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig1A.jpg" /> Figure 1A. Apparition précoce de M. bacilles de la tuberculose sur l&#39;interface air-media de bactéries après 3 semaines d&#39;incubation. <img alt="Figure 1B." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig1B.jpg" /> La figure 1B. Elevage biofilms de M. la tuberculose sur l&#39;interface air-médias après cinq semaines d&#39;incubation. 820/3820fig2A.jpg &quot;/&gt; Figure 2A. 5-semaine biofilms vieux de M. la tuberculose cultivé dans 12 puits de format. <img alt="La figure 2B." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig2B.jpg" /> La figure 2B. Une tentative a échoué à croître M. biofilms tuberculose dans 12 puits de plaque sans parafilm. <img alt="Figure 3." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig3.jpg" /> Figure 3. Un graphique représentatif sur la fréquence des persistants de drogues tolérantes en M. la tuberculose biofilms cultivés dans 12 puits format et exposées à 50μg/mL de rifampicine pendant sept jours.

<ol><li>Saltini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+and+diagnosis+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Med%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy and diagnosis of tuberculosis.</a> Respir. Med. 100, 2085-2097 (2006).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+and+dispersal+and+the+transmission+of+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation and dispersal and the transmission of human pathogens.</a> Trends Microbiol. 13, 7-10 (2005).</li>
<li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+a+common+cause+of+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+build+a+biofilm%3A+a+fungal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">How to build a biofilm: a fungal perspective.</a> Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).</li>
<li>Henke, J. M., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+social+engagements%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial social engagements.</a> Trends Cell Biol. 14, 648-656 (2004).</li>
<li>Kolter, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+for+all+and+all+for+one%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">One for all and all for one.</a> Science. 280, 226-227 (1998).</li>
<li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+the+matrix+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).</li>
<li>Ojha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GroEL1%3A+a+dedicated+chaperone+involved+in+mycolic+acid+biosynthesis+during+biofilm+formation+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">GroEL1: a dedicated chaperone involved in mycolic acid biosynthesis during biofilm formation in mycobacteria.</a> Cell. 123, 861-873 (2005).</li>
<li>Ojha, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Mycobacterium+tuberculosis+biofilms+containing+free+mycolic+acids+and+harbouring+drug-tolerant+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria.</a> Mol. Microbiol. 69, 164-174 (2008).</li>
<li>Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+hydrolysis+of+trehalose+dimycolate+releases+free+mycolic+acids+during+mycobacterial+growth+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms.</a> J. Biol. Chem. 285, 17380-17389 (2010).</li>
<li>Dye, C., Lonnroth, K., Jaramillo, E., Williams, B. G., Raviglione, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+tuberculosis+incidence+and+their+determinants+in+134+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Trends in tuberculosis incidence and their determinants in 134 countries.</a> Bull World Health Organ. 87, 683-691 (2009).</li>
<li>Jindani, A., Dore, C. J., Mitchison, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bactericidal+and+sterilizing+activities+of+antituberculosis+drugs+during+the+first+14+days%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Bactericidal and sterilizing activities of antituberculosis drugs during the first 14 days.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 1348-1354 (2003).</li>
<li>Carter, G., Wu, M., Drummond, D. C., Bermudez, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+biofilm+formation+by+clinical+isolates+of+Mycobacterium+avium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of biofilm formation by clinical isolates of Mycobacterium avium.</a> J. Med. Microbiol. 52, 747-752 (2003).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+the+rapidly+growing+mycobacterial+species+Mycobacterium+fortuitum%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by the rapidly growing mycobacterial species Mycobacterium fortuitum.</a> FEMS Microbiol. Lett. 168, 77-84 (1998).</li>
<li>Alibaud, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-dependent+regulation+of+mycolic+acid+cyclopropanation+in+saprophytic+mycobacteria%3A+role+of+the+Mycobacterium+smegmatis+1351+gene+%28MSMEG_1351%29+in+CIS-cyclopropanation+of+alpha-mycolates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Temperature-dependent regulation of mycolic acid cyclopropanation in saprophytic mycobacteria: role of the Mycobacterium smegmatis 1351 gene (MSMEG_1351) in CIS-cyclopropanation of alpha-mycolates.</a> J. Biol. Chem. 285, 21698-21707 (2010).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

La tuberculose (TB), causée par l&#39;infection de Mycobacterium tuberculosis, demeure une menace majeure pour la santé publique mondiale. Près d&#39;un tiers de la population mondiale est estimée à asymptomatique infecté par l&#39;agent pathogène, environ 9 millions de nouveaux cas apparaissent chaque année dans la clinique avec des symptômes de tuberculose évolutive et environ 1,7 million de personnes meurent de l&#39;infection chaque année 11. Le lourd fardeau de la maladie est principalement cont...

<table><tbody><tr><td>Incubateur</td><td>VWR international</td><td>Modèle n° 1923/25</td><td></td></tr><tr><td>Bouteilles de culture en polystyrène</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-374-300</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire à 12 puits</td><td>VWR international</td><td>62406-165</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques de 50 mL</td><td>VWR international</td><td>89039-660</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur rotatif</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>57019-662</td><td></td></tr><tr><td>Frigo chromatographique</td><td>VWR international</td><td>55702-520</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>VWR international</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (monobasique)</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1565-1</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>L-asparagine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4284-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acide citrique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1857-100G</td><td></td></tr><tr><td>Citrate d'ammonium ferrique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5879-100G</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-5</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z4750-500G</td><td></td></tr><tr><td>Acide D-pantothénique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2250-25G</td><td></td></tr><tr><td>Bouillon Difco Middlebrook 7H9</td><td>BD Biosciences</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Enrichissement Middlebrook OADC</td><td>BBL</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164-500</td><td></td></tr><tr><td>Bouteille de stockage de 250 mL</td><td>Corning</td><td>430281</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 12 puits</td><td>Falcon BD</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501-1G</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>JT Baker</td><td>9070-05</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 10 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette de 1-200&amp;mu;L</td><td>VWR international</td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>VWR international</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Tube centrifuge de 15 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188-285</td><td></td></tr><tr><td>Agar Difco Mycobacteria 7H11</td><td>BD Biosciences</td><td>283810</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (dibasique)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

la croissance de la mycobacterium tuberculosis les biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, l&#39;agent étiologique de la tuberculose humaine, a une capacité extraordinaire de survivre contre les stress environnementaux, notamment des antibiotiques. Bien que la tolérance au stress de M. la tuberculose est l&#39;une des contributeurs susceptibles à la chimiothérapie de 6 mois à long de la tuberculose 1, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ce phénotype caractéristique de l&#39;agent pathogène restent floues. Beaucoup d&#39;espèces microbiennes ont évolué pour survivre dans des environnements stressants par auto-assemblage en très organisée, la surface fixée, et la matrice des structures encapsulées appelé biofilms 2-4. La croissance dans les collectivités qui semble être une stratégie de survie préféré des microbes, et est réalisé grâce à des composants génétiques qui régulent la surface de fixation, les communications intercellulaires, et la synthèse de substances polymériques extracellulaires (EPS) 5,6. La tolérance au stress environnemental est probablement facilité par EPS, et peut-être par le physiol&#39;adaptation logique de bacilles individu à microenvironnements hétérogènes au sein de l&#39;architecture complexe des biofilms 7. Dans une série d&#39;articles récents, nous avons établi que M. la tuberculose et le Mycobacterium smegmatis ont une forte propension à se développer dans des structures multicellulaires organisés, appelés biofilms, qui peuvent tolérer plus de 50 fois les concentrations minimales inhibitrices des médicaments anti-tuberculeux isoniazide et 8-10 rifampicine. M. la tuberculose, cependant, nécessite curieusement conditions spécifiques à former des biofilms matures, en particulier de rapport de 9:01 espace de tête: les médias ainsi que l&#39;échange limité de l&#39;air avec l&#39;atmosphère 9. Exigences de conditions environnementales spécialisées pourrait être lié au fait que M. la tuberculose est un agent pathogène obligatoire humaine et a donc adapté aux environnements de tissus. Dans cette publication, nous la démonstration de méthodes de culture de M. tuberculosebiofilms dans une bouteille et un format de plaque à 12 puits, ce qui est pratique pour les études bactériologiques ainsi que génétiques. Nous avons décrit le protocole d&#39;une souche atténuée de M. la tuberculose, mc 2 7000, avec la suppression dans les deux locus, panCD et RD1, qui sont cruciaux pour la croissance in vivo de la 9 pathogène. Cette souche peut être utilisé sans danger dans une enceinte BSL-2 pour la compréhension de la biologie de base de l&#39;agent pathogène tuberculose évitant ainsi l&#39;exigence d&#39;un coûteux BSL-3 installation. La méthode peut être étendue, moyennant des modifications appropriées dans les médias, à se développer un biofilm d&#39;autres espèces de mycobactéries cultivables. Dans l&#39;ensemble, un protocole uniforme de biofilms culture mycobactérienne aidera les enquêteurs s&#39;intéressent à l&#39;étude des caractéristiques de base élastiques de mycobactéries. En outre, une méthode claire et concise de la croissance des biofilms mycobactériens aidera également le inv clinique et pharmaceutiqueestigators pour tester l&#39;efficacité d&#39;un médicament potentiel.

Mycobacterium tuberculosis forme des biofilms de drogues tolérantes quand elles sont cultivées dans certaines conditions. Nous décrivons ici les méthodes de culture, M. biofilms tuberculose et la détermination de la fréquence des persistants de drogue tolérante. Ces protocoles seront utiles pour d&#39;autres études sur les mécanismes de la tolérance au médicament chez M. la tuberculose.

La croissance de la Mycobacterium tuberculosis Les biofilms

*Mycobacterium tuberculosis*, l'agent étiologique de la tuberculose humaine, possède une capacité extraordinaire à survivre face aux stress environnementaux, notamment...

L'objectif général de cette procédure est de démontrer une méthode de culture de biofilms de M. tuberculosis à l'interface air-milieu, et de déterminer la fréquence des bacilles tolérants aux médicaments dans les biofilms. Cela est réalisé en préparant tout d'abord le milieu approprié et les inoculums. La deuxième étape consiste à faire croître des biofilms de M. tuberculosis dans des plaques de 12 puits.Ensuite, un antibiotique d'essai est ajouté à une concentration souhaitée, et la fréquence des persistants tolérants au médicament est mesurée. Chez *M. tuberculosis*, les biofilms peuvent être déterminés. En définitive, la technique peut être exploitée pour aider à comprendre les bases du développement des biofilms et pour décrypter les mécanismes de tolérance aux médicaments chez *M. tuberculosis*. Le principal avantage de la culture in vitro de biofilm de *M. tuberculosis* dans un milieu exempt de détergent est que la croissance spontanée de l'architecture multicellulaire complexe de la souche de base révèle des propriétés uniques de l'organisme non observées en culture planctonique.Celles-ci incluent l'attachement à la surface, les interactions intercellulaires, la synthèse de la matrice accessoire et l'adaptation physiologique au sein du microenvironnement hétérogène de cette structure. De manière importante, ces informations seront très pertinentes pour comprendre les bases de la persistance de *M. tuberculosis* dans certains niches spécialisés tels que les cavités, où une croissance abondante de basi dans un environnement accessoire est susceptible de survenir au sein de structures multicellulaires. Les implications de cette technique s'étendent vers un traitement plus court de la tuberculose, car l'identification et la ciblage des facteurs associés aux biofilms pourraient réduire la fréquence des sous-populations tolérantes aux médicaments présentes dans les biofilms.Dans ce protocole, une composition standard de milieu soans est utilisée pour cultiver M tuberculosis. Toutefois, lors de la culture de biofilms d'autres espèces mycobactériennes, utilisez les milieux spécialisés appropriés à ces espèces et préparez l'inoculum primaire de M tuberculosis dans des flacons en plastique de 125 millilitres contenant 15 millilitres de milieu liquide.Entre 80 de croissance. Les cultures en conditions standard jusqu'à ce que leur DO 600 soit comprise entre 0,7 et 1,0, ce qui prend environ une semaine. À cette densité, la culture peut être utilisée directement comme inoculum avec une dilution de un à 100. Une fois l'inoculum préparé, ajouter 600 microlitres à 60 millilitres de milieu Sawtons.Après avoir doucement mélangé l'inoculum dans le milieu, distribuez 4,5 millilitres du mélange dans chaque puits d'une plaque de 12 puits, couvrez la plaque et enveloppez-la plusieurs fois avec du parafilm. Incubez ensuite la plaque dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius.Après cinq semaines de croissance ininterrompue, procéder au test des persistants tolérants aux médicaments. Après cinq semaines de maturation, le volume du milieu sera réduit à environ trois millilitres par puits, répartis en quatre puits. Injecter un antibiotique d'intérêt juste sous le biofilm, dans le milieu.Quatre autres puits doivent être injectés avec le solvant seul et les quatre derniers puits doivent être laissés intacts. Cela confère une puissance statistique et les contrôles appropriés gonflent doucement la plaque afin que l'antibiotique soit complètement diffusé dans le milieu. Recouvrez maintenant la plaque.Placer de nouvelles couches de paraforme autour de la plaque et incuber la plaque de un à sept jours selon l'expérience. À la fin de l'incubation, ajouter du Tween 80 à chaque puits. Agiter doucement l'ensemble de la plaque pour disperser uniformément le détergent.Incuber ensuite la plaque à température ambiante pendant 15 minutes. Après 15 minutes, utiliser une pipette pour mélanger le contenu de chaque puits jusqu'à obtention d'une solution homogène. Transférer ensuite la culture dans un tube conique de 15 millilitres.Centrifuger le tube conique et resuspendre. Suspendre le culot dans cinq millilitres de tampon de lavage frais, centrifuger puis resuspendre. Suspendre les cellules dans le tampon de lavage trois fois supplémentaires.Ensuite, conserver les cellules dans le tampon de lavage toute la nuit sur un agitateur rotatif dans une chambre froide. Bien que la basse température ait initialement été mise au point pour les souches magmatiques d'EMS afin de minimiser leur croissance pendant la dispersion, elle est également utilisée pour M. tuberculosis. Les espèces à croissance lente peuvent très probablement être agitées à température ambiante sans aucun impact sur les résultats.Un balancement à température ambiante peut être nécessaire lorsqu'on travaille dans une installation de niveau de biosécurité 3. Le lendemain, préparez une seringue pour homogénéiser et transférer. Adaptez chaque suspension à une pointe de micropipette fixée à une seringue stérile. Taillez l'extrémité large de la pointe à la bonne dimension, reliez-la à la seringue, puis enveloppez la jonction avec du film parafilm.Faites passer la suspension cellulaire refroidie à travers la seringue équipée d'une aiguille et déposez le contenu dans un tube conique stérile de 15 millilitres. Répétez cette étape cinq à six fois en remplaçant continuellement le tube jusqu'à ce que la suspension paraisse très homogène. Préparez ensuite des dilutions sériées de chaque suspension et ensemencez chaque dilution sur une boîte de gélose.Après avoir incubé les boîtes pendant trois semaines, déterminez la fréquence des persistants dans la population du biofilm en comparant le nombre de colonies sur les boîtes traitées avec l'antibiotique et celui des boîtes témoins. Lorsqu'il est cultivé dans un flacon, au cours de la première semaine, M tuberculosis s'est développé à la base du flacon.À la fin de la deuxième semaine, une croissance discontinue de bactéries à l'interface air-milieu a été observée, devenue encore plus visible à la fin de la troisième semaine. L'attachement des bactéries à la paroi du récipient a également été noté, et la croissance de la culture s'est principalement produite à l'interface air-milieu. Le liquide sous-jacent à la croissance superficielle était clair.À la fin de la cinquième semaine, la structure était complètement mature. Dans un format à 12 puits après cinq semaines d'incubation, un biofilm robuste à l'interface air-milieu a été observé dans chaque puits des plaques qui n'avaient pas été entièrement enveloppées. Une croissance différentielle du biofilm a été observée, ainsi qu'une évaporation importante du milieu.La croissance bactérienne sur ces boîtes a été arrêtée. Le nombre de bacilles viables dans les biofilms était assez reproductible et variait selon les différents antibiotiques. Par exemple, en présence de rifampicine, un antibiotique bactéricide, une diminution rapide de la viabilité pendant les trois à quatre premiers jours a été suivie d'une phase persistante au cours de laquelle un faible pourcentage de la population reste complètement réfractaire aux antibiotiques, indépendamment de la concentration de l'antibiotique ou de la durée d'exposition.La même procédure peut être utilisée pour le criblage de mutants afin d'identifier les gènes impliqués dans l'attachement de Mycobacterium tuberculosis à la surface du biofilm, dans la croissance bactérienne à l'interface et dans la maturation de Pecos. N'oubliez pas que le travail avec M. tuberculosis peut présenter un danger extrême et que des précautions, telles que l'utilisation d'une enceinte de sécurité biologique de niveau 3, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

growth-of-mycobacterium-tuberculosis-biofilms

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Ce document décrit les différentes méthodes de plus en...

Co-culture des modèles Pseudomonas aeruginosa Les biofilms Cultivé sur le Live cellules des voies respiratoires de l&#39;homme

Le test décrit un moyen rapide pour mesurer la formation de biofilm au début de bactéries et de champignons. Cette méthode utilise une plaque de microtitration comme substrat pour la formation de biofilms microbiens et le biofilm est visualisée en utilisant la souche de cristal violet. Le test fournit soit un test qualitatif ou quantitatif pour la formation de biofilm tôt.

Plaque de microtitrage biofilm essai de formation

Cet article décrit la procédure pour la formation et la visualisation d'un biofilm bactérien grandi au sein d'une chambre de glisser de 8...

Dans la formation de biofilms in vitro dans une diapositive Chambre de 8 puits

Biofilms microbiens sont généralement constitués par des sous-populations distinctes de cellules spécialisées. Analyse unicellulaire de ces sous-populations nécessite l'utilisation de reporters fluorescents. Nous décrivons ici un protocole de visualiser et de contrôler plusieurs...

Analyse unicellulaire des<emBacillus subtilis> Les biofilms par microscopie à fluorescence et cytométrie de flux

Cet article décrit la vidéo pipeline à haut débit qui a été mis en place avec succès pour infecter et d'analyser un grand nombre d'embryons de poisson zèbre qui fournissent un nouvel outil puissant pour les essais en enclos et la découverte de médicaments à l'aide d'un organisme entier de animaux vertébrés.

Création et optimisation d&#39;une installation à haut débit pour l&#39;étude<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Et<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infection comme un modèle pour la découverte de médicaments

Ce protocole décrit la visualisation du développement du biofilm suite à une exposition à des facteurs de l’hôte à l’aide d’un modèle de chambre à lames. Ce modèle permet de visualiser directement le développement du biofilm ainsi que d’analyser les paramètres du biofilm à l’aide de logiciels informatiques.

Visualisation des effets des expectorations sur le développement du biofilm Utilisation d&#39;un modèle Chambered lamelle couvre-objet

Ce protocole présente une méthodologie pour effectuer des mesures de la croissance du biofilm et de la biomasse à l’aide de dispositifs de plaque de PCR de puits profonds auto-assemblés pour le criblage statique de biofilm à couvercle fixe à 96 puits à haut débit.

Génération d’une plus grande biomasse de biofilm bactérien à l’aide de dispositifs de microplaques de puits profonds à plaques PCR

Ce protocole décrit une méthode robuste pour développer un biofilm pelliculaire. La méthode est adaptable à différents volumes de culture, ce qui permet une adoption facile pour divers objectifs expérimentaux. La conception de la méthode permet d’évaluer qualitativement ou quantitativement le potentiel de formation de biofilms de plusieurs espèces mycobactériennes.

Cultiver un biofilm mycobactérien comme modèle pour étudier la résistance aux antimicrobiens

Cette méthodologie permet d’établir un modèle de biofilm polymicrobien dans la mucoviscidose pour les tests de sensibilité aux antimicrobiens dans les laboratoires de recherche et cliniques. Ce modèle fournit des résultats précis et fiables sur une gamme de sorties.

Développement d’un modèle de biofilm de colonie polymicrobienne pour tester les antimicrobiens dans la mucoviscidose

Cet article présente un protocole complet pour PmbExM, une technique de microscopie à expansion conçue spécifiquement pour les biofilms de Proteus mirabilis . PmbExM utilise un traitement enzymatique par étapes des échantillons de biofilm pour obtenir une expansion isotrope de 4,3 fois, permettant une analyse en super-résolution de l’organisation spatiale des structures cellulaires et subcellulaires au sein de ces communautés microbiennes sessiles.

Imagerie super-résolution du biofilm de Proteus mirabilis par microscopie à expansion

Découvrez une méthode de culture de biofilms de Mycobacterium tuberculosis à l'interface air-milieu et l'évaluation de la fréquence des persisters tolérants aux antibiotiques. Cette technique permet d'étudier les mécanismes de tolérance aux médicaments.

La croissance de la Mycobacterium tuberculosis Les biofilms

Explorer plus de vidéos