La mesure de l'activité du facteur V dans le plasma humain en utilisant un test de coagulation microplaques

L'objectif général de la procédure suivante était de mettre au point un dosage en microplaque permettant de mesurer l'activité du facteur de coagulation V pendant la formation d'un caillot de fibrine dans le plasma humain. En réponse à une lésion, le processus de coagulation sanguine est activé, entraînant une série de conversions de zymogènes en protéases qui aboutissent finalement à la production de l'enzyme de coagulation, la thrombine. La thrombine clive le fibrinogène soluble en monomères de fibrine, qui s'associent ensuite pour former un caillot de fibrine insoluble. Normalement, le sang reste un liquide librement fluide à l'état sain ou non lésé, et la quantité de fibrine formée est égale à la quantité de fibrine dégradée ou rompue.

Cependant, dans certaines situations pathologiques, une coagulation excessive conduit aux maladies cardiaques et aux accidents vasculaires cérébraux, tandis qu'une coagulation insuffisante entraîne des tendances hémorragiques, fréquemment observées dans les hémophilies. Le facteur V est une protéine présente dans le plasma qui, sous sa forme activée facteur cinq A, agit comme un accélérateur essentiel de la génération de thrombine durant la formation du caillot de fibrine, dans le cadre du complexe enzymatique de la prothrombine. Ce complexe est composé de quatre éléments : le facteur 10 A, le facteur cinq A (protéase), le lipide (cofacteur), la surface et le calcium. Le facteur cinq A augmente l'efficacité catalytique ou kcat du facteur 10 A vis-à-vis de son substrat, la prothrombine, d'environ 3 000 fois, renforçant ainsi de manière marquée la génération de thrombine et la formation du caillot de fibrine.

La plateforme de microplaque est privilégiée pour mesurer les événements catalysés par les enzymes en raison de sa commodité, de son faible coût en temps, de ses petits volumes d'échantillons, de sa surveillance continue et de son haut débit. L'apparition du caillot de fibrine peut être suivie à l'aide d'un lecteur de microplaque en mesurant l'augmentation de l'absorbance lumineuse du plasma, qui passe d'un aspect clair et jaune, sans caillot de fibrine et avec une absorbance minimale, à un aspect opaque et trouble, avec un caillot de fibrine et une absorbance maximale. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les tests manuels par inclinaison de tubes ou les tests réalisés avec des analyseurs automatisés, sont sa rapidité, son faible coût, ses faibles volumes d'échantillons requis et son haut débit.

L'essai mesure l'activité du facteur cinq activé involontairement et du facteur cinq activé par la thrombine afin d'obtenir une évaluation quantitative complète de son activité fonctionnelle totale. La démonstration de cette technique sera assurée par Derek Tilley, étudiant de master dans le laboratoire. Afin de mesurer l'activité du facteur cinq dans un échantillon de plasma, il est nécessaire d'établir une courbe standard d'activité du facteur cinq en une étape, représentant le temps de formation du caillot de fibrine dans le panneau A et la vitesse initiale de formation du caillot de fibrine dans le panneau B, en utilisant du plasma humain normal ou PHN comme témoin, contenant par définition une unité d'activité du facteur cinq par mL. Décongeler le plasma déficient en facteur cinq, le plasma humain normal et les plasmas échantillons inconnus, puis les incuber avec du thromboplastine à 37 degrés pendant 10 minutes.

Mélangez doucement le plasma déficient en facteur V et le thromboplastine, puis transférez-les dans des bacs à lavage en plastique séparés et incubez-les sur de la glace. Conservez le plasma humain normal et les plasmas échantillons inconnus sur de la glace après un mélange doux. Conservez le chlorure de calcium à 25 millimolaire dans de l'eau distillée dans un bac à lavage séparé à température ambiante pour les courbes standards d'activité du facteur V en une étape.

Préparez 200 microlitres chacun de dilutions sérielles deux fois consécutives de plasma humain normal à partir de 0, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 et 512 fois dans du HBS pH 7,4 en utilisant des tubes microcentrifugeurs de 1,5 ml, vortexez soigneusement et incubez sur de la glace. Pour les échantillons plasmatiques inconnus, préparez 200 microlitres chacun de dilutions 40 fois du plasma humain normal et des plasmas d'échantillons inconnus dans du HBS pH 7,4 en utilisant des tubes microcentrifugeurs de 1,5 ml. Placez cinq bandes de micropuits dans le support de modèle du lecteur de microplaques.

Mettez en marche le lecteur de microplaques et accédez au logiciel d'application microplaque Softmax Pro à l'aide d'une pipette multicanal. Ajoutez simultanément 50 microlitres de plasma déficient en facteur V dans toutes les puits-échantillons de la microplaque à l’aide d’une pipette simple, puis ajoutez 50 microlitres des 10 dilutions sérielles préparées de plasma humain normal et des dilutions 40 fois du plasma humain normal ainsi que des plasmas échantillons inconnus dans des puits séparés de la microplaque à l’aide d’une pipette multicanal. Ajoutez ensuite 50 microlitres de thromboplastine dans tous les puits-échantillons. Incubez dans le lecteur de microplaques à 25 degrés Celsius pendant une minute, avec agitation durant les 15 à 25 secondes de cette minute d'incubation.

Utilisez l'ordinateur relié au lecteur de microplaques pour accéder au logiciel d'application Softmax Pro Microplate. Réglez le lecteur de microplaques sur la longueur d'onde d'absorbance à 405 nanomètres, en mode cinétique à 25 degrés Celsius, puis programmez le lecteur de microplaques pour qu'il agite les échantillons durant les cinq premières secondes suivant l'ajout de chlorure de calcium, et mesurez l'absorbance à 405 nanomètres toutes les cinq secondes pendant six minutes. Par la suite, l'intervalle d'agitation de cinq secondes n'est pas inclus dans les temps de coagulation calculés ; à l'aide de deux pipettes multicanaux utilisées simultanément, ajoutez 50 microlitres de chlorure de calcium dans les deux bandes de microplaques contenant les échantillons.

Attendre 15 secondes, puis appuyer immédiatement sur l'icône de démarrage dans Softmax Pro depuis l'ordinateur pour commencer le test. Pour chaque échantillon de plasma analysé, le temps de formation du caillot est déterminé et défini comme le temps, en secondes, nécessaire pour atteindre l'augmentation maximale de l'absorbance divisée par deux. La vitesse initiale de formation du caillot est définie comme la vitesse d'augmentation de l'absorbance au cours des cinq premiers points temporels de la portion linéaire de la courbe d'augmentation de l'absorbance en fonction du temps.

L'ampleur de la formation du caillot est définie comme la différence entre l'absorbance maximale et minimale atteinte pendant l'événement de formation du caillot à la fin de l'essai. Utilisez les profils d'absorbance en fonction du temps dans Softmax Pro pour déterminer le temps, la vitesse initiale et l'ampleur de la formation du caillot pour la dilution en série du plasma humain normal. Pour construire les courbes standards d'activité du facteur V en une étape, utilisez les temps de formation du caillot du plasma humain normal dilué 40 fois et des plasmas échantillons inconnus afin d'interpoler l'activité du facteur V en unités par millilitre à partir de la courbe standard d'activité du facteur V en une étape.

Ceci représente l'activité du facteur V à une étape ou celle obtenue sans activation intentionnelle par la thrombine. Il s'agit d'un exemple représentatif de la formation du caillot de fibrine dans le test du facteur V au cours du temps, générée par le lecteur de microplaque. Le profil illustre la formation du caillot de fibrine à l'aide de plasma humain normal dilué 32 fois, sur une seule microplaque.

Eh bien, l'axe vertical indique la variation de l'absorbance à 405 nanomètres survenue en raison de la formation du caillot de fibrine. Le temps de formation du caillot a été calculé comme le point médian de la courbe de l'absorbance en fonction du temps, soit 36,4 secondes. La vitesse initiale de formation du caillot a été calculée à 611,88 milliunités par minute.

L'étendue de la formation des nuages a été calculée à 0,35 unité. Le test du facteur cinq mesure avec précision la vitesse initiale et l'étendue de la formation des nuages. L'inspection des puits après la fin du test a confirmé que la formation de caillots s'était produite.

Toutes les réactions ont atteint approximativement le même degré de formation de nuages, avec une variation générale de l'absorbance à 405 nanomètres comprise entre 0,35 et 0,45 unités, entre l'absorbance initiale avant et l'absorbance maximale après l'ajout de thromboplastine et de chlorure de calcium. L'ajout de exemples représentatifs de l'activité du facteur V en une étape, de la courbe standard du temps de coagulation en secondes en fonction de l'activité du facteur V en unités par millilitre, ainsi que de la vitesse initiale de formation du caillot en milliunités par minute en fonction de l'activité du facteur V en unités par millilitre pour un plasma humain normal sont illustrés respectivement dans le panneau A et le panneau B.

Étant donné que le facteur V est normalement activé par la thrombine, un deuxième dosage après ajout et incubation avec la thrombine est essentiel pour mesurer précisément l'activité en deux étapes du facteur V dans un échantillon de plasma activé intentionnellement par l'ajout de thrombine, dans le cadre du test en deux étapes du facteur V. Préparez 200 à 300 microlitres de thrombine purifiée à une concentration finale de cent nanomolaire dans du tampon HBS pH 7,4, puis incubez sur glace. Diluez 120 microlitres du plasma humain normal et des plasmas échantillons ci-dessus, d’un facteur 40 à 100, avec 170 microlitres de HBS pH 7,4 contenant 2,8 millimolaire.

Chlorure de calcium. Ajouter 10 microlitres de thrombine pour obtenir une concentration finale de 10 nanomolaire dans chaque échantillon. Vortexer brièvement pour bien mélanger, puis incuber à 37 degrés pendant une minute. Diluer le plasma humain normal et les plasmas d'échantillons au facteur de 500 en ajoutant 400 microlitres de tampon HBS à pH 7,4.

Déterminez le temps de coagulation du plasma humain normal pour chaque essai d'échantillon inconnu à partir des profils d'absorbance en fonction du temps dans Soft Max Pro. En tenant compte de la dilution 500 fois, utilisez le temps de coagulation de chaque échantillon pour calculer l'activité du facteur V en deux étapes à partir de la courbe standard du facteur V en une étape, représentant le temps de coagulation en fonction de l'activité. Ceci correspond à l'activité du facteur V en deux étapes, soit celle avec activation intentionnelle par la thrombine.

L'activité totale du facteur V peut ensuite être calculée comme étant l'activité du facteur V à deux étapes moins l'activité du facteur V à une étape. La courbe standard du logarithme du temps de coagulation en fonction du logarithme de l'activité du facteur V a été utilisée pour mesurer l'activité du facteur V dans le plasma humain normal et dans les plasmas de neuf patients atteints de coagulation intravasculaire disséminée ou CID. Les neuf patients atteints de CID présentaient des activités du facteur V à une étape et des vitesses initiales de formation du caillot réduites en moyenne de 54 % et de 18 %. L'activité du facteur V à deux étapes et l'activité totale étaient réduites chez les patients atteints de CID en moyenne de 44 % et de 42 % par rapport au plasma humain normal.

Le facteur cinq et les patients atteints de CID ont entraîné un allongement du temps et une diminution du taux de formation du caillot de fibrine. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la manière d'appliquer cette méthode dans votre laboratoire. La méthode peut être facilement adaptée pour mesurer l'activité de n'importe quel facteur de coagulation dans le plasma, ce qui la rend appropriée pour un large éventail d'applications de recherche et cliniques.

En fin de compte, ces informations sur le facteur V auront un impact positif sur les environnements de soins grâce à un diagnostic et un traitement plus précoces de troubles thrombotiques ou hémorragiques tels que la CIVD.