La mesure de l'activité du facteur V dans le plasma humain en utilisant un test de coagulation microplaques

L’objectif global de la procédure suivante était de mettre au point un test sur microplaques qui mesure l’activité d’un facteur V protéique de coagulation lors de la formation d’un caillot de fibrine dans le plasma humain. En réponse à une lésion, le processus de coagulation sanguine est activé et entraîne une série de réactions de conversion de xymogène à protéase qui conduisent finalement à la génération de l’enzyme de coagulation thrombine, les cleves de thrombine fibrinogène soluble en monomères de fibrine, qui s’associent ensuite pour former un caillot de fibrine insoluble. Normalement, le sang reste sous forme de liquide coulant librement pendant l’état sain ou non blessé, et la quantité de fibrine formée est égale à la quantité de fibrine dégradée ou décomposée.

Cependant, dans certaines situations pathologiques, une coagulation excessive entraîne des maladies cardiaques et des accidents vasculaires cérébraux, tandis qu’une coagulation insuffisante entraîne des tendances hémorragiques, souvent observées chez les hémophiles. Le facteur V est une protéine plasmatique qui, dans sa forme activée, le facteur cinq A est un accélérateur critique de la génération de thrombine lors de la formation du caillot de fibrine dans le cadre du complexe enzymatique de la prothrombine, la prothrombine est composée de quatre composants : le facteur 10 A, le facteur de protéase cinq A, le cofacteur lipidique, la surface et le calcium. Le facteur méline cinq A augmente d’environ 3000 fois l’efficacité catalytique ou kcat du facteur 10 A vers son substrat prothrombine, améliorant ainsi profondément la génération de thrombine et la formation de caillots de fibrine.

La plate-forme de microplaques est préférée pour mesurer les événements catalysés par des enzymes en raison de sa commodité, de son coût en temps, de ses petits volumes d’échantillons, de sa surveillance continue et de son débit élevé. La formation d’un caillot de fibrine peut être surveillée à l’aide d’un lecteur de microplaques en mesurant l’augmentation de l’absorbance lumineuse du plasma lorsqu’elle passe d’un aspect jaune clair sans caillot de fibrine et une absorbance lumineuse minimale à un aspect opaque et trouble avec un caillot de fibrine et une absorbance lumineuse maximale. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les tests manuels à tube basculant ou les tests avec des analyseurs automatisés sont que la méthode est rapide, peu coûteuse, nécessite un petit volume d’échantillon et a un débit élevé.

Le test mesure l’activité du facteur cinq activé par inadvertance et activé par la thrombine afin d’obtenir une évaluation quantitative complète de son activité fonctionnelle totale. Derek Tilley, étudiant à la maîtrise en laboratoire, fera la démonstration de cette technique. Afin de mesurer l’activité du facteur cinq dans un échantillon de plasma, il est nécessaire de construire l’activité du facteur cinq en une étape, les courbes standard du temps de formation du caillot de fibrine dans le panel A et le taux initial de formation du caillot de fibrine dans le panel B en utilisant du plasma humain normal ou du NHP comme étalon qui contient par définition une unité d’activité du facteur cinq par ML décongélation du plasma déficient en facteur cinq, plasma humain normal, et échantillonnez les inconnues plasmatiques et la thromboplastine à 37 degrés pendant 10 minutes.

Mélangez délicatement le plasma déficient en facteur cinq et le transfert de la plastie thrombo dans des plateaux de lavage en plastique séparés et incubez sur de la glace. Stockez le plasma humain normal et échantillonnez les inconnus de plasma sur de la glace après avoir mélangé doucement. Conservez le chlorure de calcium 25 millimolaires dans de l’eau distillée dans un bac de lavage séparé à température ambiante pour le facteur cinq une courbe d’activité en une étape.

Préparez 200 microlitres chacun de dilution en série double de plasma humain normal de 0, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 1, 28, 2, 56 et 512 fois dans HBS pH 7,4 à l’aide de microtubes à centrifuger de 1,5 ml, bien vortex et incubez sur de la glace. Pour l’échantillon de plasma inconnu, préparer 200 microlitres de dilutions 40 fois de plasma humain normal et de plasmas d’échantillons inconnus dans HBS pH 7,4 à l’aide de microtubes à centrifuger de 1,5 ML. Placez cinq bandes de micropuits dans le support de gabarit du lecteur de microplaques.

Allumez le lecteur de microplaques et accédez au logiciel d’application de microplaques Softmax Pro à l’aide d’une pipette multicanaux. Effectuez des ajouts simultanés de 50 microlitres de plasma déficient en facteur cinq dans tous les puits de microplaques d’échantillon à l’aide d’une seule pipette, ajoutez 50 microlitres des 10 dilutions en série préparées de plasma humain normal et les dilutions 40 fois de plasma humain normal et de plasma d’échantillon inconnu pour séparer les puits de MICROPLAQUES à l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 50 microlitres de thrombo plastie à tous les puits d’échantillon. Incuber dans le lecteur de microplaques à 25 degrés Celsius pendant une minute en agitant pendant les 15 à 25 secondes de l’incubation d’une minute.

À l’aide de l’ordinateur interfacé avec le lecteur de microplaques, accédez au logiciel d’application Softmax Pro Microplate. Réglez le lecteur de microplaques sur la longueur d’onde d’absorbance à 405 nanomètres, le mode de température cinétique à 25 degrés Celsius et programmez le lecteur de microplaques pour qu’il secoue pendant les cinq premières secondes après l’ajout de chlorure de calcium et mesure l’absorbance à 405 nanomètres toutes les cinq secondes pendant six minutes. Par la suite, l’intervalle d’agitation de cinq secondes n’est pas inclus dans les temps de caillot calculés à l’aide de deux pipettes multicanaux qui ajoutent simultanément 50 microlitres de chlorure de calcium aux deux bandelettes de microplaques contenant des échantillons.

Attendez 15 secondes et appuyez immédiatement sur l’icône de démarrage dans Softmax Pro à partir de l’ordinateur pour commencer le test. Pour chaque échantillon de plasma analysé, le temps de formation du caillot est déterminé et défini comme le temps en secondes pour atteindre l’augmentation demi-maximale de l’absorbance. Le taux initial de formation de caillots est défini comme le taux d’augmentation de l’absorbance sur les cinq premiers points temporels de la partie linéaire de l’augmentation de l’absorbance en fonction du temps.

L’étendue de la formation de caillots est définie comme la différence entre l’absorption maximale et minimale obtenue lors de l’événement de formation de caillots à la fin de l’exécution. Utilisez les profils ABSORBENCE en fonction du temps dans Softmax Pro pour déterminer le temps, le taux initial et l’étendue de la formation de caillots pour la dilution en série du plasma humain normal. Pour construire les courbes standard d’activité du facteur V à un étage, utilisez les temps de caillot pour le plasma humain normal dilué 40 fois et les inconnues du plasma de l’échantillon pour interpoler l’activité du facteur cinq en unités par broyeur à partir de la courbe standard d’activité du facteur cinq à un étage.

Cela représente le facteur cinq une activité en une étape ou celle sans activation intentionnelle par la thrombine. Il s’agit d’un exemple représentatif de la formation de caillots de fibrine dans le dosage du facteur cinq au fil du temps généré par le lecteur de microplaques. Le profil représente la formation d’un caillot de fibrine à l’aide de plasma humain normal dilué 32 fois dans une seule microplaque.

Eh bien, l’axe vertical indique le changement d’absorbant à 405 nanomètres qui s’est produit à la suite de la formation d’un caillot de fibrine. Le temps de formation du caillot a été calculé comme étant le point médian de la courbe d’absorbance en fonction du temps, soit 36,4 secondes. Le taux initial de formation de caillots a été calculé à 611,88 milliunités par minute.

L’étendue de la formation des nuages a été calculée à 0,35 unité. Le dosage du facteur cinq mesure avec précision le temps, le taux initial et l’étendue de la formation des nuages. L’inspection des puits à la fin de l’analyse a confirmé la formation de caillots.

Toutes les réactions ont atteint à peu près la même étendue de CloudFormation avec un changement général de l’absorbance à 405 nanomètres compris entre 0,35 et 0,45 unités entre l’absorbance de départ avant et l’absorbance maximale après la thromboplastie et le chlorure de calcium. Des exemples représentatifs de l’activité en une étape du facteur cinq, de la courbe standard du temps de caillot en secondes par rapport au facteur cinq en unités par mil et du taux initial de formation des griffes en milliunités par minute par rapport au facteur cinq. L’activité en unités par mil pour le plasma humain normal est indiquée dans les panneaux A et B, respectivement.

Puisque le facteur cinq est normalement activé par la thrombine. Le cofacteur actif facteur cinq A un deuxième test après l’addition et l’incubation avec de la thrombine est essentiel pour mesurer avec précision l’activité du facteur cinq en deux étapes d’un échantillon de plasma avec activation intentionnelle par la thrombine ajoutée pour le test en deux étapes du facteur cinq. Préparez 200 à 300 microlitres de thrombine purifiée à sa concentration finale de cent nano molaires dans HBS pH 7,4 et incubez sur glace, diluez 120 microlitres de plasma humain au-dessus de la normale et échantillonnez les plasmas de 40 à 100 fois avec 170 microlitres de HBS pH 7,4 contenant 2,8 millimolaires.

Chlorure de calcium. Ajouter 10 microlitres de thrombine pour obtenir une concentration finale de 10 nanomolaires à chaque échantillon. Tourbillon. Bien à mélanger et à incuber à 37 degrés Pendant une minute, diluez le plasma humain normal et les plasmas d’échantillons à 500 fois en ajoutant 400 microlitres de HBS pH 7,4.

Déterminez le temps de caillot pour le plasma humain normal dans chacun des tests plasmatiques inconnus de l’échantillon à partir des profils d’absorbance en fonction du temps dans le soft max Pro. En tenant compte de la dilution de 500 fois, utilisez le temps de caillot pour chaque échantillon pour calculer l’activité en deux étapes du facteur cinq à partir de la courbe standard en un étage du facteur cinq du temps de caillot en fonction de l’activité. Il s’agit du facteur cinq, de l’activité en deux étapes, ou de celle avec activation intentionnelle par la thrombine.

L’activité totale du facteur cinq peut alors être calculée comme étant le facteur cinq activité en deux étapes moins le facteur cinq une étape Activité. La courbe standard du temps de caillot logarithmique en fonction de l’activité du facteur cinq a été utilisée pour mesurer l’activité du facteur cinq dans le plasma humain normal et dans les plasmas de neuf patients atteints de coagulation intravasculaire disséminée ou CIVD, tous les neuf patients atteints de CIVD. Le facteur cinq, les activités en une étape et les taux initiaux de formation de caillots ont diminué en moyenne de 54 et 18 %L’activité du facteur cinq, en deux étapes et l’activité totale ont été diminuées chez les patients atteints de CIVD en moyenne de 44 et 42 % par rapport au plasma humain normal.

Les patients atteints de facteur cinq et de CID ont entraîné une durée prolongée et une diminution du taux de formation de caillots de fibres. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon de mettre en œuvre cette méthode dans votre laboratoire. La méthode peut être facilement adaptée pour mesurer l’activité de n’importe quel facteur de coagulation dans le plasma, ce qui la rend adaptée à un large éventail d’applications de recherche et cliniques.

En fin de compte, ces informations sur le facteur V auront un impact positif sur les environnements de soins de santé grâce au diagnostic et au traitement plus précoces des troubles thrombotiques ou hémorragiques tels que la CIVD.