Une seule cellule de profilage de développer et d'âge mûr neurones de la rétine

L’objectif global de cette procédure est d’isoler des cellules uniques pour l’analyse du transcriptome à l’aide d’une puce à ADN. Pour ce faire, on dissèque d’abord la rétine des tissus environnants, puis on la dissocie en cellules uniques. La deuxième étape consiste à prélever des cellules individuelles et à les déposer dans des tubes PCR contenant un tampon de lyse.

Ensuite, les cellules sont lysées et l’ADNC est amplifié à l’aide d’une transcription inverse, suivie d’une réaction en chaîne par polymérase. En fin de compte, l’hybridation du CD NA d’une seule cellule sur une puce A iMatrix est utilisée pour révéler les ARNm exprimés dans une seule cellule. Le principal avantage du profilage de l’expression génique dans des cellules uniques par rapport à l’utilisation d’approches de tissus entiers est que l’isolement de cellules uniques vous permet d’accéder à de très petites populations de cellules qui comprendraient l’ensemble du tissu.

Ces cellules pourraient être n’importe quoi, de différents types de neurones à de petites populations de cellules souches. Ce que la technique de la cellule unique nous permet de faire pour ces cellules, c’est d’identifier les deux types de cellules, des marqueurs spécifiques pour ces petites populations de cellules, et d’identifier des réseaux de gènes qui sont exprimés dans ces sous-ensembles extrêmement rares de cellules. De plus, la technique de profilage de cellule unique nous permet d’identifier les réseaux de gènes qui s’expriment transitoirement lors de transitions développementales très dynamiques dans de très petits sous-ensembles de cellules.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la génétique du développement, telles que le moment où les cellules progénitrices commencent à exprimer des réseaux de gènes associés à la différenciation et comment ces cellules progénitrices diffèrent les unes des autres. Les implications de cette technique s’étendent aux thérapies cellulaires pour les maladies neurodégénératives telles que le glaucome, car en élucidant les réseaux clés dans le développement de cellules individuelles, nous nous rapprochons de la possibilité de générer ces cellules pour une utilisation dans la thérapie de remplacement cellulaire. Commencez cette procédure en plaçant la rétine de la souris dans une boîte remplie de PBS.

Ensuite, retirez le vitré et le cristallin. Retirez ensuite tout l’épithélium pigmentaire rétinien. Incuber la rétine dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Ensuite, tapotez doucement le tube pour déloger les cellules installées. Ensuite, tri-notez doucement, 10 à 20 fois avec une pipette P 1000. Si de gros amas de tissu persistent, incubez-le pendant 10 minutes supplémentaires à 37 degrés Celsius et réfrigérez-le 10 à 20 fois.

Ensuite, ajoutez cinq microlitres d’ADN, un à 10 unités par microlitre à la rétine, et incubez-le pendant cinq minutes. À température ambiante, notez-le doucement avec la pipette P 1000 à 10 à 20 fois par la suite. Centrifugez-le à 3000 tr/min pendant trois minutes.

Retirez ensuite le surnageant et laissez 100 à 200 microlitres de liquide au fond. Tapotez le tube pour déloger la pastille. Ensuite, ajoutez un millilitre de HBSS et remettez le granulé en suspension avec une tation douce.

Centrifugez-le à 3000 tr/min pendant trois minutes. Lorsque c’est fait, retirez soigneusement le surnageant. Ensuite, réanimez-le, suspendez-le dans 450 microlitres de PBS contenant 0,1 % BSA dans l’étape suivante, préparez deux plats de six centimètres contenant cinq millilitres de PBS complétés par 0,1 % BSA.

Assiette suivante, les cellules dissociées dans un plat. Laissez les cellules se stabiliser pendant au moins cinq minutes. Après cela, placez la boîte de cellules dissociées sous un microscope inversé.

Utilisez une pipette à pointe fine avec un tube aspirateur pour prélever une seule cellule. Placez ensuite la micropipette près de la cellule et elle entrera facilement dans la micro-pipette par capillarité. Ensuite, expulsez la cellule dans une deuxième boîte et assurez-vous qu’une seule cellule est récoltée pour le profilage de l’expression génique.

Cela se fait soit en retirant les cellules étrangères, soit en déplaçant la cellule d’intérêt à un autre endroit avec une nouvelle micro-pipette. Lorsqu’une cellule individuelle est complètement isolée des cellules voisines, utilisez une nouvelle micro-pipette pour aspirer la cellule d’intérêt. Ensuite, expulsez-le directement dans un tube PCR de 0,2 millilitre contenant un tampon de lyse cellulaire de 4,5 microlitres.

Faites tourner brièvement l’échantillon dans une micro-centrifugeuse pour immerger la cellule dans un tampon de lyse. Faites ce tour toutes les cinq cases, puis à nouveau à la fin de la collecte. N’oubliez pas de garder le tube sur de la glace pendant toute la durée de l’isolement de la cellule unique et de collecter les cellules individuelles dans une fenêtre de deux heures après la dissociation pour des résultats optimaux dans cette procédure, faites tourner brièvement l’échantillon dans une micro-centrifugeuse pour vous assurer que la cellule unique est immergée dans le tampon de lyse cellulaire.

Pour favoriser la lyse cellulaire, incubez l’échantillon à 70 degrés Celsius pendant 90 secondes dans un thermocycleur. Remettez ensuite immédiatement le tube sur de la glace pendant deux minutes. Pour effectuer la transcription inverse, ajoutez 0,33 microlitre.

Exposant trois à 200 unités par microlitre, 0,05 microlitre inhibiteur à 40 unités par microlitre et 0,07 microlitre. T quatre gène 32 protéine au tube. Incuber le mélange réactionnel pendant 50 minutes à 50 degrés Celsius dans un thermocycleur après 50 minutes, inactiver l’enzyme à 70 degrés Celsius pendant 15 minutes supplémentaires.

Lorsque cela est fait, remettez le tube sur de la glace. Pour enlever l’amorce gratuite, ajoutez 0,1 microlitre, 10 x tampon d’exonucléase, 0,8 microlitre, D H2O et 0,1 microlitre. Exonucléase, une à 20 unités par microlitre dans le tube incubé à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes dans un thermocycleur.

Après 30 minutes, inactivez l’enzyme en incubant le mélange réactionnel à 80 degrés Celsius pendant 25 minutes. À la fin, remettez le tube sur de la glace. Ensuite, ajoutez six microlitres du mélange de réaction de résidus à l’échantillon.

Incuber-le dans le thermocycleur à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes, 70 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis maintenez-le à quatre degrés Celsius. Par la suite, ajoutez 10 microlitres de l’échantillon à queue au mélange réactionnel PCR. Effectuez la synthèse du deuxième brin et l’amplification par PCR pour marquer l’ADNC.

Afin d’obtenir une hybridation robuste sur une puce iMatrix, fragmentez d’abord le CD NA en ajoutant 10 à 20 microlitres du CD NA à cellule unique à huit microlitres un x un pour tout tampon. Ajoutez ensuite un microlitre de cet ADN dilué à une solution réactionnelle de 80 microlitres. Ensuite, ajoutez-y 20 microlitres, cinq tampons XTDT, 2,5 microlitres de biotine, six D-D-A-T-P et un microlitre de TDT dilué.

Ensuite, ajoutez-y 20 microlitres, cinq tampons XTDT, 2,5 microlitres, de la biotine et six D-D-A-T-P et un microlitre de TDT. Incuber le mélange pendant 90 minutes à 37 degrés Celsius. Puis cinq minutes à 65 degrés Celsius.

Par la suite, stockez-le à moins 20 degrés Celsius ou hybridez-le immédiatement vers une puce à ADN iMatrix. Voici un exemple représentatif de frottis de CD NA sur cellule unique et de PCR spécifiques à un gène : les voies A-F-G-N-H contiennent des frottis de CD NA robustes, tandis que les voies B, C, D et E sont considérablement moins robustes. Les ADNC ont été isolés à partir de cellules ganglionnaires rétiniennes fluorescentes, puis testés à l’aide d’amorces PCR spécifiques pour les marqueurs de cellules ganglionnaires rétiniennes, BRN trois B et PAC six, PCR spécifique au gène pour le marqueur photorécepteur.

CRX a été utilisé pour déterminer le niveau de contamination dans la cellule unique. Les CDNA et les sous-ensembles de cellules ganglionnaires rétiniennes ont été identifiés par dépistage de la présence du gène tachy kinine un. Les résultats des microréseaux pour des gènes sélectionnés exprimés dans 22 cellules uniques distinctes sont présentés sous forme de carte thermique.

Les intensités des signaux de la puce ont été mises à l’échelle pour correspondre à l’intensité de la couleur rouge, tandis que le noir indique l’absence de signal sur la puce. Suite à cette procédure, des méthodes supplémentaires telles que la QPCR peuvent être utilisées pour confirmer le modèle d’expression génique observé dans les microrayons. Les résultats de l’hybridation C peuvent également être utilisés pour répondre à des questions supplémentaires que vous pourriez avoir sur l’emplacement des cellules qui expriment des gènes particuliers.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une assez bonne idée de la façon de dissocier les rétines, d’isoler les cellules uniques et de générer de l’ADNC à partir de ces cellules uniques. Pour l’hybridation sur microarray.