Une seule cellule de profilage de développer et d'âge mûr neurones de la rétine

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des cellules individuelles pour une analyse du transcriptome basée sur les puces à ADN. Cela est réalisé en premier lieu en disséquant la rétine à partir des tissus environnants, puis en la dissociant en cellules individuelles. La deuxième étape consiste à recueillir des cellules individuelles et à les déposer dans des tubes PCR contenant un tampon de lyse.

Ensuite, les cellules sont lysées et l'ADNc est amplifié par transcription inverse, suivie d'une réaction en chaîne par polymérase. Enfin, l'hybridation de l'ADNc monocellulaire sur un microarray A iMatrix permet de révéler les ARNm exprimés dans une cellule unique. Le principal avantage de l'analyse de l'expression génique au niveau de la cellule unique, par rapport aux approches utilisant des tissus entiers, réside dans le fait que l'isolement de cellules individuelles permet d'accéder à de très petites populations cellulaires qui constitueraient l'ensemble du tissu.

Ces cellules peuvent être de différents types de neurones à de petites populations de cellules souches. Ce que la technique de la cellule unique nous permet de faire pour ces cellules, c'est d'identifier à la fois les types cellulaires, les marqueurs spécifiques pour ces petites populations de cellules, et de déterminer les réseaux géniques exprimés dans ces sous-populations extrêmement rares de cellules. De plus, la technique de profilage à la cellule unique nous permet d'identifier les réseaux géniques exprimés de manière transitoire lors de transitions développementales très dynamiques dans de très petits sous-ensembles de cellules.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la génétique du développement, telles que le moment où les cellules progénitrices commencent à exprimer des réseaux géniques associés à la différenciation et comment ces cellules progénitrices diffèrent les unes des autres. Les implications de cette technique s'étendent aux thérapies cellulaires pour les maladies neurodégénératives telles que le glaucome, car en élucidant les réseaux clés dans le développement des cellules individuelles, nous nous rapprochons d'un pas de la capacité à générer ces cellules pour une utilisation en thérapie de remplacement cellulaire. Commencez cette procédure en plaçant la rétine de souris dans une boîte remplie de PBS.

Ensuite, retirez l'humeur vitrée et le cristallin. Puis, enlevez tout l'épithélium pigmentaire rétinien. Incubez la rétine dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Ensuite, tapez doucement sur le tube pour détacher les cellules éventuellement sédimentées. Puis, aspirez et éjectez délicatement le mélange 10 à 20 fois à l’aide d’une pipette P1000. Si de gros agrégats de tissu persistent, incubez le tube pendant 10 minutes supplémentaires à 37 degrés Celsius, puis aspirez et éjectez à nouveau 10 à 20 fois.

Ensuite, ajoutez cinq microlitres d'ADN, à une concentration de 10 unités par microlitre, dans la rétine, et incubez pendant cinq minutes. À température ambiante, homogénéisez délicatement à l’aide d’une pipette P1000, puis répétez l’opération de 10 à 20 fois supplémentaires. Centrifugez à 3000 tr/min pendant trois minutes.

Ensuite, retirez le surnageant et laissez 100 à 200 microlitres de liquide au fond. Tapez doucement sur le tube pour détacher le culot. Ajoutez ensuite un millilitre de HBSS et redispensez le culot par agitation douce.

Centrifugez à 3000 tr/min pendant trois minutes. Une fois terminé, retirez soigneusement le surnageant. Ensuite, resuspendez dans 450 microlitres de PBS contenant 0,1 % de BSA. À l'étape suivante, préparez deux boîtes de six centimètres contenant chacune cinq millilitres de PBS supplémenté de 0,1 % de BSA.

Placer ensuite les cellules dissociées dans une boîte de culture. Laisser les cellules se déposer pendant au moins cinq minutes. Ensuite, placer la boîte contenant les cellules dissociées sous un microscope inversé.

Utilisez une pipette à embout fin avec un tube aspirateur pour récolter une seule cellule. Ensuite, approchez la micropipette de la cellule afin qu'elle pénètre facilement dans la micropipette par action capillaire. Expulsez ensuite la cellule dans une seconde boîte et assurez-vous qu'une seule cellule est récoltée pour le profilage de l'expression génique.

Cela se fait soit en éliminant les cellules parasites, soit en déplaçant la cellule d'intérêt vers un autre emplacement à l'aide d'une nouvelle micropipette. Lorsqu'une cellule individuelle est complètement isolée des cellules voisines, utiliser une nouvelle micropipette pour aspirer la cellule d'intérêt. Ensuite, l'expulser directement dans un tube PCR de 0,2 millilitre contenant 4,5 microlitres de tampon de lyse cellulaire.

Faites tourner brièvement l'échantillon dans une microcentrifugeuse pour immerger la cellule dans le tampon de lyse. Effectuez cette centrifugation après chaque cinquième cellule, puis à nouveau à la fin de la collecte. N'oubliez pas de maintenir le tube sur glace pendant toute la durée de l'isolement des cellules uniques et de recueillir les cellules uniques dans un délai de deux heures suivant la dissociation pour obtenir des résultats optimaux dans cette procédure ; faites tourner brièvement l'échantillon dans une microcentrifugeuse afin de vous assurer que la cellule unique est bien immergée dans le tampon de lyse cellulaire.

Pour favoriser la lyse cellulaire, incubez l'échantillon à 70 degrés Celsius pendant 90 secondes dans un thermocycleur. Placez ensuite immédiatement le tube sur de la glace pendant deux minutes. Pour effectuer la transcription inverse, ajoutez 0,33 microlitre.

3 µL à 200 unités par microlitre, 0,05 µL d'inhibiteur à 40 unités par microlitre et 0,07 µL de la protéine T4 gene 32 dans le tube. Incuber le mélange réactionnel pendant 50 minutes à 50 °C dans un thermocycleur. Après 50 minutes, inactiver l'enzyme à 70 °C pendant 15 minutes supplémentaires.

Lorsque cela est terminé, remettez le tube sur la glace. Pour éliminer l'amorce libre, ajoutez 0,1 microlitre de tampon 10 x exonucléase, 0,8 microlitre d’eau D H2O et 0,1 microlitre d’exonucléase à 20 unités par microlitre dans le tube, puis incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes dans un thermocycleur.

Après 30 minutes, inactiver l'enzyme en incubant le mélange réactionnel à 80 degrés Celsius pendant 25 minutes. À la fin, replacer le tube sur de la glace. Ensuite, ajouter six microlitres du mélange réactionnel de la réaction de queue à l'échantillon.

Incubez-le dans le thermocycleur à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes, à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis maintenez-le à quatre degrés Celsius. Ajoutez ensuite 10 microlitres de l'échantillon portant des queues au mélange de réaction PCR. Réalisez la synthèse du deuxième brin et l'amplification PCR afin de marquer l'ADNc.

Afin d'obtenir une hybridation robuste sur des puces microperforées iMatrix, fragmentez d'abord l'ADNc en ajoutant de 10 à 20 microlitres d'ADNc de cellule unique à huit microlitres de tampon 1x Oneforall. Ensuite, ajoutez un microlitre de cet ADN dilué à une solution réactionnelle de 80 microlitres. Puis, ajoutez 20 microlitres de tampon 5x TDT, 2,5 microlitres de biotine, 6 dDATP et un microlitre de TDT dilué.

Ensuite, ajoutez 20 microlitres de tampon XTDT, 2,5 microlitres de biotine, six D-D-A-T-P et un microlitre de TDT. Incubez une heure et demie à 37 degrés Celsius, puis cinq minutes à 65 degrés Celsius.

Conserver ensuite à moins 20 degrés Celsius ou procéder immédiatement à l'hybridation sur une puces microarray a iMatrix. Voici un exemple représentatif de smears d'ADNc unicellulaires et de bandes de PCR spécifiques aux gènes : les bandes A-F-G-N-H présentent des smears d'ADNc robustes, tandis que les bandes B, C, D et E sont nettement moins intenses. Les ADNc ont été isolés à partir de cellules ganglionnaires rétiniennes fluorescentes, puis analysés à l'aide d'amorces de PCR spécifiques des marqueurs des cellules ganglionnaires rétiniennes, BRN3B et PAC6, ainsi que par PCR spécifique du gène marqueur des photorécepteurs.

CRX a été utilisé pour déterminer le niveau de contamination dans la cellule unique. Les ADNc et les sous-ensembles de cellules ganglionnaires rétiniennes ont été identifiés en recherchant la présence du gène tachykinine un. Les résultats de la micromatrice pour les gènes sélectionnés exprimés dans 22 cellules uniques distinctes sont présentés sous forme de carte thermique.

Les intensités des signaux de la micropuce ont été ajustées pour correspondre à l'intensité de la couleur rouge, tandis que le noir indique l'absence de signal sur la micropuce. Suite à cette procédure, des méthodes supplémentaires telles que la QPCR peuvent être utilisées pour confirmer le profil d'expression génique observé sur la micropuce. Les résultats de l'hybridation de type C peuvent également servir à répondre à d'autres questions que vous pourriez avoir concernant la localisation des cellules exprimant des gènes particuliers.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la manière de dissocier des rétines, d'isoler des cellules individuelles et de générer de l'ADNc à partir de ces cellules uniques, pour l'hybridation sur puces à ADN.