Name: Méthodes locales et globales de lévaluation de nociception thermique dans Drosophila Les larves (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Découvrez les méthodes d'évaluation de la nociception thermique chez les larves de Drosophila. Cette technique permet de quantifier les réponses comportementales aux stimuli thermiques nocifs et d'étudier le traitement sensoriel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions Christian Landry pour réchauffage de la sonde de conception, Daniel Babcock pour le développement du dosage de la chaleur des larves de la sonde, Sean Sweeney pour suggérer le dosage de chaleur à plaques, la drosophile Bloomington Stock Center pour les stocks de mouches, et Galko membres du laboratoire pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le NIH R01 NS069828 à MJG et une NIH MARC U-STAR de subventions de formation (T34GM079088 à l&#39;Université de Houston-Downtown Scholars Academy) pour l&#39;accès des minorités à des carrières de recherche (AVG).

<ol><li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).</li>
<li>Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((painless%2C+a+Drosophila+gene+essential+for+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">painless, a Drosophila gene essential for nociception.</a> Cell. 113, 261-273 (2003).</li>
<li>Oswald, M., Rymarczyk, B., Chatters, A., Sweeney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+thermosensitive+escape+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">A novel thermosensitive escape behavior in Drosophila larvae.</a> Fly (Austin). 5, 17810(2011).</li>
<li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li>
<li>Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hamlet%2C+a+binary+genetic+switch+between+single-+and+multiple-+dendrite+neuron+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology.</a> Science. 297, 1355-1358 (2002).</li>
<li>Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+regulating+dendritic+outgrowth%2C+branching%2C+and+routing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila.</a> Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).</li>
<li>Walters, E. T., Illich, P. A., Weeks, J. C., Lewin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defensive+responses+of+larval+Manduca+sexta+and+their+sensitization+by+noxious+stimuli+in+the+laboratory+and+field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Defensive responses of larval Manduca sexta and their sensitization by noxious stimuli in the laboratory and field.</a> J. Exp. Biol. 204, 457-469 (2001).</li>
<li>Woolf, C. J., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptors--noxious+stimulus+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Nociceptors--noxious stimulus detectors.</a> Neuron. 55, 353-364 (2007).</li>
<li>Hwang, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li>
<li>Xiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Sweeney, N. T., Li, W., Gao, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+single+neurons+in+vivo+reveals+specific+roles+of+flamingo+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of single neurons in vivo reveals specific roles of flamingo in neuronal morphogenesis.</a> Dev. Biol. 247, 76-88 (2002).</li>
<li>Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+mechanosensory+transduction%3A+mechanoreception-defective+mutations+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila.</a> Neuron. 12, 1195-1206 (1994).</li>
<li>Nitabach, M. N., Blau, J., Holmes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+silencing+of+Drosophila+pacemaker+neurons+stops+the+free-running+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Electrical silencing of Drosophila pacemaker neurons stops the free-running circadian clock.</a> Cell. 109, 485-495 (2002).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Les tests décrits ici peuvent être utilisés pour évaluer qualitativement et quantitativement les larves de différents génotypes de la réactivité aux stimuli nocifs thermiques. Une caractéristique principale de l&#39;essai sonde thermique, c&#39;est que le stimulus est donnée uniquement à un seul locus. Cela conduit sans doute à des tirs de seulement un petit sous-ensemble de la classe IV des neurones les plus dans le segment contactés par la sonde et peut-être ceux immédiatement les segments adjacents 11. En raison de la stimulation locale, le dosage sonde thermique imite l&#39;expérience sensoriel commun de détection d&#39;un stimulus nociceptif qui est localisée à un organe particulier la région comme une main en contact d&#39;un poêle chaud. Un inconvénient de l&#39;essai sonde thermique, c&#39;est qu&#39;il a une certaine variabilité d&#39;utilisateur à utilisateur qui peut probablement être attribuée à trois facteurs: i) la pression avec laquelle l&#39;utilisateur applique la sonde à la larve, ii) l&#39;emplacement précis de la sonde sur la chenille par rapport aux neurones sous-jacentes nociceptives, et iii) l&#39;précise angle auquel la sonde en contact avec la surface de la chenille. Nous avons précédemment fait état ​​d&#39;une stratégie quantitative des larves dans les catégories des non-répondeurs, répondeurs lents, et les intervenants rapides en fonction de leur temps de latence de retrait à une température donnée 1. Ici, nous rapportons sur la réactivité des larves à des températures encore plus élevées. Fait intéressant, nous trouvons qu&#39;il ya un plafond pour les larves thermiques réponses nociceptives et que ce plafond se situe entre 52 et 54 ° C. Cela peut indiquer que les larves ne possèdent pas un potentiel récepteur transitoire (TRP) canal capable de déclenchement à des températures supérieures à 52 ° C. Alternativement, il pourrait suggérer que les neurones ou les muscles utilisés pour initier ou mener à bien la réponse du moteur est endommagé avant même de pouvoir fonctionner en retrait aversif. Groupe présente également une analyse différente de l&#39;amplitude du retrait de réponse en utilisant-soit le nombre de rouleaux en tant qu&#39;indicateur de la &quot;robustesse&quot; de la réponse. Naïvement, ons&#39;attendrait à ce que ces paramètres augmentent avec la température augmente ou moment de la stimulation. Étonnamment, nous constatons que ce n&#39;est pas le cas. Les larves stimulé pendant une longue période à une température à l&#39;extrémité inférieure de la fourchette nocive (42 ° C) montrent plus de rouleaux et de passer plus de temps que les larves de roulement sondé à des températures élevées (48-52 ° C). Cela donne à penser que, dans la fenêtre de température nocive c&#39;est surtout la durée de l&#39;exposition qui détermine l&#39;amplitude de la réponse. Depuis que les larves exposées à des températures très nocives (48-52 ° C) de répondre, en moyenne, très rapidement, ils ne présentent pas sous forme de rouleaux plus grand nombre de larves exposées à une température moins nocive pour une plus longue période de temps. L&#39;analyse de l&#39;amplitude de réponse rapportés ici ajoute une autre dimension quantitative le long de laquelle différents génotypes ou des manipulations de l&#39;environnement peuvent être comparés. Une caractéristique principale de l&#39;essai de chaleur à plaques est qu&#39;il s&#39;agit d&#39;une exposition globale à l&#39;nocivesthermique. En tant que tel, il s&#39;apparente davantage à l&#39;animal assis dans un chaudron de chauffage que de toucher un poêle chaud. Même s&#39;il n&#39;est pas clair quand une larve peut vivre un stimulus nocif au niveau mondial à l&#39;état sauvage, dans le labo, les réponses comportementales à cette exposition globale sont plus complexes que ceux observés lors d&#39;une stimulation locale. Un des points forts de l&#39;essai de chaleur à plaques, a également noté par d&#39;autres 3, c&#39;est qu&#39;il a peu d&#39;utilisateur à utilisateur la variabilité, car tout contact de la larve n&#39;est pas une composante du protocole. L&#39;écart ne semble être importante dans la définition de chaque comportement quand commence et cela peut être minimisé avec visualisation répétée / familiarité. Une différence intéressante entre les tests est la température à laquelle les comportements d&#39;évitement commencer. Ce sont beaucoup plus faibles dans l&#39;essai de chaleur à plaques de la sonde thermique. Le comportement préliminaire présenté par les larves en contact avec la sonde thermique (tête et queue relance) peut être un corrélat de la tête de thrash observée à ~ 27 ° C dans le plat de la chaleure dosage. Il est possible que cette réponse reflète «malaise» plus que «la douleur». Nous n&#39;avons pas observé une corrélation entre la flagellation, la saisie, et la paralysie, même à doses élevées (jusqu&#39;à 48 ° C) la température dans le dosage de la sonde thermique et il se peut que d&#39;une masse critique de neurone sensoriel de tir de plus d&#39;une région du corps est nécessaires pour mettre sur ces comportements. Fait intéressant, les comportements de saisie et de la paralysie sont observées à des températures (~ 34 à 37 ° C) ci-dessous l&#39;extrémité inférieure du seuil nociceptif observé avec la sonde thermique indiquant que la stimulation globale peut impliquer sommation des réponses neuronales qui sont insuffisantes pour déclencher un comportement avec les autorités locales application de la sonde thermique. Que ces températures sont effectivement perçu comme nocif pour les larves est soutenue par l&#39;observation que les larves qui commencent le comportement paralysie et sont ensuite autorisés à récupérer la nourriture volée ne pas survivre à la plupart des cas (figure 5C). En outre soutenir l&#39;argument selon lequel la chaleur pldosage est mangé lire les réponses nociceptives est le fait que le blocage de la transmission synaptique dans les neurones sensoriels nociceptifs connus augmente la latence de la plupart des comportements observés (Figure 6). L&#39;observation selon laquelle il n&#39;y a pas augmentation de la latence pour le comportement à plus haute température à fouetter suggère que d&#39;autres neurones sensoriels qui n&#39;expriment pas md-Gal4 peut être nécessaire pour ce comportement. En somme, les deux tests implique d&#39;exposer une larve individu à un stimulus nociceptif thermique de la température définie - la pointe chaude d&#39;une petite sonde métallique dans le dosage locale et l&#39;immersion dans une goutte de rapidement chauffer l&#39;eau dans le dosage global. Les réponses comportementales de larves de drosophile de divers horizons génétiques et / ou exposés à des conditions environnementales variables (par exemple plus ou moins des dommages aux tissus), peuvent être étudiés et quantifiés à l&#39;aide de ces tests. En fin de compte, les résultats de ces essais nous aideront à mieux comprendre les réseaux génétiques qui contrôlent la CNPiception chez la drosophile et d&#39;autres espèces apparentées.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Sonde Thermique </td><td> Pro-Dev génie </td><td> Custom-construits sur demande </td><td> Information de contact peuvent être fournis sur demande </td></tr><tr><td> Bain à sec Incubateur </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-718 </td><td> 1 bloc de chauffage solide et 1 bloc de chauffage avec des puits 16mm </td></tr><tr><td> Leica DFC290 12v/400mA Caméra couleur </td><td> Leica Microsystems </td><td> 12730080 </td><td> Toute l&#39;équivalent appareil photo fera l&#39;affaire. </td></tr><tr><td> Leica MZ6 microscope </td><td> Leica Microsystems </td><td> Numéro de la pièce pour MZ6 corps de zoom (optique porteuse) est 10445614 </td><td></td></tr><tr><td> Schott Ace Modulamp Unité </td><td> Schott North America, Inc </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td> Schott col de cygne double 23 pouces guide de lumière à fibre optique </td><td> Schott North America, Inc </td><td> Schott A08575 </td><td></td></tr><tr><td> Unité de contrôle thermique </td><td> TSCI corp. </td><td> Custom Built </td><td> Les détails peuvent être fournis sur demande </td></tr><tr><td> Zeiss Stemi 2000 microscope </td><td> Zeiss </td><td> NT55-605 </td><td> Toute l&#39;équivalent microscopefera l&#39;affaire. </td></tr><tr><td> Forceps </td><td> FST </td><td> FS-1670 </td><td></td></tr><tr><td> 1mm mailles </td><td> Genesee scientifique </td><td> 57-101 </td><td></td></tr><tr><td> Pinceau </td><td> Dick Blick Art Materials </td><td> 06762-1002 </td><td></td></tr><tr><td> Agent de réticulation UV </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1199289 </td><td></td></tr><tr><td> Jarres </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-816 </td><td></td></tr><tr><td> Bécher 10ml </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-540C </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;éther diéthylique </td><td> Fisher Scientific </td><td> E138-500 </td><td></td></tr><tr><td> 35 x 10 mm boîte de Pétri en polystyrène </td><td> Faucon </td><td> 351008 </td><td> Nous n&#39;avons pas testé plats de substitution. </td></tr><tr><td> Lame de microscope </td><td> Corning </td><td> 26003 </td><td></td></tr><tr><td> Thermocouple </td><td> Omega Engineering, Inc </td><td> HH802U </td><td></td></tr><tr><td> Morceau de vinyle </td><td> Office Depot </td><td> 480009 </td><td></td></tr><tr><td> Microtube </td><td> Denville scientifiqueInc </td><td> C-2170 </td><td></td></tr></tbody></table>

méthodes locales et globales de l&#39;évaluation de nociception thermique dans<em&gt; drosophila</em&gt; les larves

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

Dans cet article, nous démontrons essais pour étudier la nociception thermique larves de drosophile. Un test implique une stimulation spatialement restreint (local) de 1,2 nocicepteurs thermiques tandis que le second implique un gros (global) d&#39;activation de la plupart ou tous les neurones de ces 3. Ensemble, ces techniques permettent de visualiser et de quantifier les fonctions comportementales de Drosophila neurones sensoriels nociceptifs. La larve drosophile est un système modèle établi pour étudier la nociception thermique, une réponse sensorielle à des températures potentiellement dangereux qui est évolutif conservés entre espèces 1,2. Les avantages de la drosophile pour de telles études sont la relative simplicité de son système nerveux et de la sophistication des techniques génétiques qui peuvent être utilisés pour disséquer la base moléculaire de la biologie sous-jacente 4-6 dans la drosophile, comme dans tous les métazoaires, les responsabe à des stimuli thermiques nocifs implique généralement une &quot;nocifensive« retrait aversion pour le stimulus présenté 7. Ces stimuli sont détectés par les terminaisons nerveuses libres ou nocicepteurs et l&#39;amplitude de la réponse organismique dépend du nombre de nocicepteurs recevant le stimulus nociceptif 8. Chez la drosophile, ce sont les neurones de classe IV arborisation dendritique sensoriels qui détectent des stimuli nocifs thermiques et mécaniques 9 en plus de leur rôle récemment découvert que les photorécepteurs 10. Ces neurones, qui ont été très bien étudiés au niveau de développement, s&#39;arborisent sur ​​la feuille de la barrière épidermique et établir des contacts avec presque toutes les cellules épidermiques 11,12. Le seul axone de chaque neurone projets de classe IV dans la moelle épinière ventrale du système nerveux central 11 où ils peuvent se connecter à neurones de second ordre que le projet vers le cerveau. Dans des conditions de base, neuro nociceptif sensorielns ne se déclenche pas jusqu&#39;à un seuil relativement élevé est atteint. Les tests décrits ici permettent au chercheur de quantifier les réponses comportementales de base ou, vraisemblablement, la sensibilisation qui en découle des dommages aux tissus qui suit. Chaque test provoque distincts mais connexes locomotrices réponses comportementales aux stimuli nocifs thermiques et permet au chercheur de visualiser et de quantifier les différents aspects de la nociception thermique larves de drosophile. Les tests peuvent être appliqués pour les larves de génotypes désirés ou larves élevées dans différentes conditions environnementales qui pourraient avoir une incidence nociception. Depuis la nociception thermique est conservé à travers les espèces, les résultats glanés dans la dissection génétique chez la drosophile sera probablement notre compréhension de la nociception thermique dans d&#39;autres espèces, y compris les vertébrés.

Dans cet article, nous démontrons essais pour étudier la nociception thermique<em&gt; Drosophila</em&gt; Larves. Un test implique une stimulation spatialement restreint (local) des nocicepteurs thermiques<sup&gt; 1,2</sup&gt; Tandis que le second implique un gros (global) d&#39;activation de la plupart ou tous les neurones de ces<sup&gt; 3</sup&gt;. Ensemble, ces techniques permettent de visualiser et de quantifier les fonctions comportementales de<em&gt; Drosophila</em&gt; Nociceptives des neurones sensoriels.

Méthodes locales et globales de l&#39;évaluation de nociception thermique dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Les larves

Dans cet article, nous présentons des essais permettant d'étudier la nociception thermique chez les larves de Drosophila. L'un des essais consiste en une stimulation spatialement restreinte (locale) de...

Le but général de l'expérience suivante est de mesurer la nociception thermique chez les larves de drosophile. Cette mesure est réalisée en récoltant des larves de drosophile, puis en les exposant à des stimuli thermiques nocifs dans une étape facultative. Les larves peuvent être irradiées aux rayons UV, ce qui provoque des lésions tissulaires et une sensibilisation nociceptive thermique. Ensuite, chaque larve peut être sondée localement à l’aide d’une sonde chauffante ou globalement à l’aide d’un plateau chauffant, afin d’induire des réponses nociceptives pouvant être mesurées de façon quantitative.La sonde thermique montre que les larves présentent un seuil maximal pour la réponse nociceptive à la chaleur, ainsi qu'une relation surprenante entre la température d'entrée et l'amplitude de la réponse provoquée. Le test sur plaque chauffante montre que les larves exhibent une séquence stéréotypée de comportements nociceptifs dépendant de la température de l'eau environnante et de l'activité des neurones sensoriels nociceptifs. Les méthodes décrites ici peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la nociception thermique, telles que de savoir si les animaux réagissent différemment à des stimuli thermiques nocifs appliqués localement ou de manière globale.En général, les personnes novices dans le test de la sonde thermique éprouvent des difficultés, car la maîtrise de ce test nécessite de la pratique afin de minimiser les variations de pression, de position et d'angle d'application de la sonde. La démonstration visuelle du test sur plaque chauffante est essentielle, car les comportements induits par l'augmentation de la température doivent être observés pour être pleinement compris. Pour obtenir un nombre suffisant de larves issues d'un génotype défini d'intérêt, faire croître la souche désirée directement ou réaliser des croisements en flacons contenant du milieu pour drosophiles, en utilisant 20 à 30 femelles vierges et 15 à 20 mâles. Cinq jours après la ponte, récolter et nettoyer les larves de troisième stade précoce en prélevant délicatement le milieu ramolli et en les rinçant à l’eau courante douce à travers un tamis de 630 microns de diamètre. Transférer ensuite les larves de troisième stade précoce vers un petit tampon d’aliment humide afin d’éviter la famine et la dessiccation.Après avoir monté une chambre d’assommoir, utiliser une pince ou un pinceau pour placer délicatement 10 larves de troisième stade précoce le long de l’intérieur du couvercle, puis fermer. Travailler sous une hotte aspirante, placer la chambre d’assommoir à l’intérieur d’un bocal d’association contenant un bécher de 10 millilitres avec une boule de coton imprégnée de 1,5 millilitre d’éther de dathyl. Visser le couvercle du bocal d’association afin d’exposer les larves aux vapeurs d’éther pendant deux à 2,5 minutes.Après l'autorisation, retirez la chambre d'autorisation du bocal Coplan et laissez-la quelques secondes sous la hotte afin que les vapeurs résiduelles d'éther se dissipent. Utilisez une bouteille d'eau pulvérisatrice pour rincer doucement les larves de la chambre d'autorisation et les transférer dans une petite boîte de Pétri. Séchez délicatement les larves anesthésiées, puis fixez-les fermement en position dorsale vers le haut sur une bande de ruban adhésif double face fixée sur une lame de microscope en verre de trois pouces sur un pouce.Placez la lame sur la surface inférieure d'une chambre d'irradiation UV et exposez les larves à la lumière UV pendant six secondes à une intensité de 20 millijoules par centimètre carré. Après l'irradiation, immergez la lame dans l'eau pour faire flotter délicatement les larves hors du ruban adhésif double face. Utilisez une pince ou un pinceau pour placer doucement les larves irradiées dans un récipient de 15 par 45 millimètres.Un flacon de culture en verre d'un dram contenant un millilitre de milieu pour mouches, à laisser récupérer pendant huit à 24 heures à 25 degrés Celsius ou à la température de culture souhaitée avant de les transférer à nouveau. Pour les tests de nociception thermique, régler d'abord la température de la sonde thermique à la valeur souhaitée. Utiliser un pinceau ou des pinces pour transférer délicatement une larve individuelle sur une plateforme plane, en veillant à ce que la larve soit recouverte d'un film d'eau mince.Afin de minimiser les variations de pression ainsi que de garantir la position et l'angle corrects du thermoprobe, la pratique fait la perfection. Appuyez délicatement la pointe du probe contre les larves au segment A4, en exerçant une légère pression avec la pointe à un angle d'environ 45 degrés entre le probe et la surface des larves. La pression doit provoquer une légère indentation à la surface des larves et sera généralement suffisante pour empêcher la locomotion.Continuer à stimuler les larves jusqu'à l'apparition d'une réponse de retrait ou jusqu'à atteinte de la limite de coupure à 22. Les larves réactives montrent typiquement d'abord un comportement préliminaire consistant à lever la tête et la queue, suivi par le comportement de retrait consistant à effectuer un roulis d'au moins 360 degrés. Une fois le comportement de retrait initié, interrompre le contact avec la sonde et enregistrer la latence ou le temps mis pour effectuer le retrait.Si aucun comportement de retrait n'est observé dans les 20 secondes, la larve est considérée comme un non-répondeur. Positionner les guides de lumière en fibre optique afin d'assurer un éclairage adéquat et à fort contraste. Pour observer les larves, placer le bloc chauffant sur la plaque chauffante avec la surface plane vers le haut, puis poser la plaque chauffante sur la base du microscope.Activez la plaque chauffante sur le réglage élevé et laissez environ 15 minutes pour que la température se stabilise à 95 degrés Celsius. Mesurez 80 microlitres d'eau distillée et déposez une goutte d'eau au centre d'une boîte de Pétri en polystyrène de 60 par 15 millimètres à l'aide d'une micropipette. Utilisez une pince pour placer délicatement une larve propre au stade de troisième stade larvaire dans le milieu de la goutte d'eau, en introduisant le moins d'eau supplémentaire possible.Placez délicatement la boîte de Pétri sur le bloc chauffant solide du plateau chauffant. Ajustez rapidement la position de la boîte afin que les larves entières et la goutte d'eau soient visibles. Déclenchez le chronomètre.Pour le moment, la boîte de Pétri est placée sur le bloc chauffant solide de la plaque chauffante et le temps d'apparition de chaque comportement est enregistré. Cinq. Des comportements locomoteurs stéréotypés sont observés lors du transfert de la larve immergée dans l'eau sur la plaque chauffante. Le comportement normal en l'absence de chaleur implique une locomotion en parapluie, accompagnée de mouvements de tête de recherche.Le comportement de secousse de la tête peut survenir ensuite, lorsque la larve déplace rapidement sa tête en mouvement avant ou latéral. Ce mouvement ressemble à leur locomotion normale dans l'eau, mais il est plus saccadé et accompagné d'un roulis persistant. Ce comportement se produit lorsque la larve effectue un roulis latéral d'au moins 360 degrés complets.Cela peut se produire un nombre variable de fois et implique parfois des roulades incomplètes. Aux fins de l'évaluation du comportement, ne comptabiliser que les roulades complètes de 360 degrés. Ce comportement est le plus proche de la scène avec application locale de la sonde chauffante observée lors du comportement de fouet.La larve présente des mouvements rapides de contraction et de relâchement le long de l'axe antéro-postérieur, rapprochant très brièvement la tête de la queue. Des mouvements de fouettage sont souvent observés en succession rapide, parfois simultanément avec des roulades. Enfin, la larve manifeste un comportement de crise, souvent suivi par une paralysie. Pendant le comportement de crise, la larve s'étire le long de l'axe postéro-antérieur et présente une fréquence élevée de contractions corporelles généralisées.Un comportement de tremblement sans paralysie par fléchissement apparaît lorsque les larves cessent tout déplacement. Chez certaines larves, cet arrêt est permanent, tandis que d'autres présentent ensuite un mouvement pulsé de faible fréquence. Sur ce graphique représentant le pourcentage de larves réagissant dans chaque catégorie, on observe un plafond de la réponse larvaire à la nociception thermique. Dans le test à la sonde chauffante, 100 % des larves sont des répondeurs rapides jusqu'à une température de la sonde de 52 degrés Celsius.Cependant, à 54 degrés Celsius et au-dessus, 90 % ou plus des larves ne réagissent pas, même après 20 secondes de contact. Bien que ces larves continuent de bouger après la coupure au 22e essai, le nombre de roulades ou la durée passée en comportement de retrait d’aversion peut également être mesuré et représenté graphiquement. De façon surprenante, une relation inverse semble exister entre la température du stimulateur et la robustesse de la réponse, les températures plus basses provoquant apparemment un nombre plus élevé de roulades.Cinq comportements locomoteurs stéréotypés sont observés lors du transfert de la larve immergée dans l'eau vers la plaque chauffante. Les latences moyennes auxquelles ces comportements sont observés sont indiquées ici, de même que les températures moyennes de la goutte d'eau mesurées pour chaque latence dans les conditions optimales de test présentées ici. Le pourcentage de larves présentant chaque comportement distinct variait de 77 à 100 % ; bien qu'occasionnellement, les comportements de roulis et de fouet soient omis, se chevauchent ou se produisent dans l'ordre inverse. Le pourcentage de larves ayant survécu après l'initiation du comportement de paralysie dans le test sur plaque chauffante est indiqué ici. Les larves ont été chauffées jusqu'à la paralysie, puis retirées pour être placées dans des conditions de culture standard afin de se rétablir.Les larves témoins ont reçu un traitement équivalent, sauf en ce qui concerne l'exposition à la chaleur, et la formation de PPE chez les adultes viables a été quantitative entre le jour sept et le treize. Ici, MD G quatre induit l'expression de transgènes régulés par UAS dans les quatre classes de neurones sensoriels périphériques multidendritiques. UAS ou one delta C exprime une version modifiée du canal potassique rectificateur ouvert de drosophile, nécessaire à la transmission synaptique, et UAS orrc un delta NC exprime une version encore plus modifiée du même canal qui n'interfère pas avec la transmission synaptique.Remarquez que seuls les larves portant à la fois le conducteur MD GAL4 et le transgène UAS ORC1ΔC présentent des latences accrues pour quatre des cinq comportements observés. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mesurer les réponses locales et globales des larves de Drosophile aux stimuli thermiques nocifs. Ces procédures peuvent être combinées à d'autres méthodes, comme l'analyse génétique, afin d'identifier les gènes nécessaires à la nociception thermique. Lors de la réalisation du test à la sonde chauffante, il est important de veiller à minimiser les variations de pression, de position et d'angle de contact de la sonde.

local-global-methods-assessing-thermal-nociception-drosophila

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Ici, nous décrivons une procédure rapide simple et fiable pour déterminer la température minimale à laquelle des rats ou des souris montrent un comportement...

Détermination rapide du seuil thermique nociceptive chez les rats diabétiques

Les larves de drosophile ont des neurones sensoriels dédiés – les nocicepteurs – dont la réponse à des stimuli thermiques potentiellement nocifs déclenche des comportements aversifs – ou dits « nocifensifs » chez l’animal. Cette vidéo décrit une méthode d’évaluation de la nociception thermique en enregistrant le comportement larvaire en réponse à l’application locale d’une sonde de chaleur sur la cuticule. Cette méthode est donc appelée dosage par sonde thermique locale.

Dosage local par sonde thermique : une méthode pour évaluer la nociception des températures élevées chez les larves de drosophile

Des études de la morphogenèse neuronale utilisant la drosophile arborisation dendritique larvaire (da) neurones bénéficient de la visualisation in situ des protéines neuronales et épidermiques par immunofluorescence. Nous décrivons un procédé qui permet d'améliorer l'analyse par immunofluorescence des neurones DA et des cellules épidermiques entourant en retirant le tissu musculaire de la paroi du corps de la larve.

Enlèvement de<em&gt; Drosophila</em&gt; Muscle Tissue de Fillets larvaires pour immunofluorescence Analyse des neurones sensoriels et les cellules épidermiques

Ici , nous démontrons un essai de roman pour étudier nociception froid chez les larves de drosophile. Ce test utilise une sonde à effet Peltier sur mesure intégrée capable d'appliquer un stimulus froid délétère focale et se traduit par des comportements quantifiables à froid spécifiques. Cette technique permettra en outre la dissection moléculaire et cellulaire de nociception froid.

Nouveau test pour froid dans nociception<em&gt; drosophile</em&gt; larves

Nous présentons ici un protocole pour déterminer la température environnementale préférée des larves de drosophile à l’aide d’un gradient thermique continu.

Un dosage de Gradient de température pour déterminer les préférences thermiques de larves de drosophile

Nous présentons ici un protocole pour déterminer automatiquement la performance locomotrice de la drosophile aux changements de température à l’aide d’une arène programmable à température contrôlée qui produit des changements de température rapide et précis dans le temps et l’espace.

Une méthode automatisée pour déterminer la Performance de la drosophile en réponse aux changements de température dans l’espace et le temps

Le but de ce protocole est de montrer comment effectuer un essai amélioré pour la nociception mécanique chez les larves de Drosophila. Nous utilisons l'analyse ici pour démontrer que l'hypersensibilité mécanique (allodynie et hyperalgésie) existe chez les larves de Drosophila.

Un test amélioré et des outils pour mesurer la nociception mécanique chez les larves de Drosophila

L'évaluation et le traitement de la douleur chez les nourrissons est difficile parce que les bébés ne peuvent pas verbalement le rapport de leur expérience. Dans cette vidéo, nous décrivons les méthodes quantitatives et des techniques électrophysiologiques analyse qui peut être utilisé pour mesurer la réponse à des événements nocifs du système nerveux du nourrisson.

Mesures électrophysiologiques et d&#39;analyse de la nociception chez les nourrissons humains

Drosophila melanogaster est un système modèle génétiquement et comportemental souple qui a été utilisée pour comprendre la base moléculaire et cellulaire de nombreux processus biologiques importants pour plus d'un siècle 1. Drosophile a été bien exploitée afin de mieux comprendre la base génétique du comportement à la mouche.

Méthodes de dosage à Drosophila Comportement

Une méthode pour visualiser les organes et immunocoloration chordotonaux chez les larves et des pupes...

Visualisation des propriocepteurs dans<em&gt; Drosophila</emLes larves&gt; et pupes

Découvrez les méthodes d'évaluation de la nociception thermique chez les larves de Drosophila. Cette technique permet de quantifier les réponses comportementales aux stimuli thermiques nocifs et d'étudier le traitement sensoriel.

Méthodes locales et globales de l'évaluation de nociception thermique dans

Explorer plus de vidéos