Méthodes locales et globales de l'évaluation de nociception thermique dans Drosophila Les larves

L'objectif général de l'expérience suivante est d'évaluer la nociception thermique chez les larves de drosophile. Cette évaluation est réalisée en récoltant des larves de drosophile, puis en les exposant à des stimuli thermiques nocifs dans une étape facultative. Les larves peuvent être irradiées aux UV, ce qui provoque des lésions tissulaires et une sensibilisation nociceptive thermique. Ensuite, chaque larve peut être stimulée localement à l'aide d'une sonde thermique ou de manière globale à l'aide d'une plaque chauffante, afin d'induire des réponses nociceptives pouvant être mesurées de façon quantitative.

La sonde thermique montre que les larves ont un seuil maximal pour la réponse nociceptive à la chaleur, ainsi qu'une relation surprenante entre la température d'entrée et l'amplitude de la réponse provoquée. Le test sur plaque chauffante montre que les larves présentent une séquence stéréotypée de comportements nociceptifs dépendant de la température de l'eau environnante et de l'activité des neurones sensoriels nociceptifs. Les méthodes décrites ici peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la nociception thermique, comme de savoir si les animaux réagissent différemment à des stimuli thermiques douloureux appliqués localement ou de façon globale.

En général, les personnes novices dans le test de la sonde thermique éprouvent des difficultés, car la maîtrise de ce test nécessite de la pratique afin de minimiser les variations de pression, de position et d'angle d'application de la sonde. La démonstration visuelle du test sur plaque chauffante est essentielle, car les comportements induits par l'augmentation de la température doivent être observés pour être pleinement compris. Pour obtenir un nombre suffisant de larves issues d'un génotype défini d'intérêt, faire croître la souche souhaitée directement ou réaliser des croisements dans des flacons contenant de la nourriture pour drosophiles, en utilisant 20 à 30 femelles vierges et 15 à 20 mâles ; cinq jours après la ponte, récolter et nettoyer les larves de troisième stade précoce en prélevant la nourriture ramollie et en les passant à l'eau courante douce à travers un tamis de 630 microns de porosité ; transférer ensuite les larves de troisième stade précoce sur un petit tampon de nourriture humide afin d'éviter la famine et la dessiccation.

Après avoir construit une chambre d'immobilisation, utilisez une pince ou un pinceau pour placer délicatement 10 larves de troisième stade précoce le long de l'intérieur du couvercle, puis fermez. En travaillant sous une hotte, placez la chambre d'immobilisation à l'intérieur d'un bocal d'association contenant un bécher de 10 millilitres avec une boule de coton imprégnée de 1,5 millilitre d'éther de dathyl. Vissez le couvercle du bocal d'association pour exposer les larves aux vapeurs d'éther pendant deux à 2,5 minutes.

Après l'autorisation, retirez la chambre d'autorisation du bocal Coplan et laissez-la quelques secondes sous la hotte afin que les éventuelles vapeurs résiduelles d'éther se dissipent. Utilisez une bouteille pulvérisatrice d'eau pour rincer doucement les larves de la chambre d'autorisation et les transférer dans une petite boîte de Pétri. Absorbez l'humidité des larves anesthésiées, puis fixez-les délicatement, côté dorsal vers le haut, sur une bande de ruban adhésif double face fixée sur une lame de verre microscopique de trois pouces sur un pouce.

Placez la lame sur la surface inférieure d'une chambre d'irradiation aux UV et exposez les larves à la lumière UV pendant six secondes à une intensité de 20 millijoules par centimètre carré. Après l'irradiation, immergez la lame dans l'eau pour faire flotter délicatement les larves hors du ruban adhésif double face. Utilisez une pince ou un pinceau pour placer doucement les larves irradiées dans un récipient de 15 par 45 millimètres.

Un flacon de culture en verre de un dram contenant un millilitre de milieu pour mouches, à laisser récupérer de huit à 24 heures à 25 degrés Celsius ou à la température de culture souhaitée avant de les transférer à nouveau. Pour les tests de nociception thermique, régler d'abord la température de la sonde thermique à la valeur souhaitée. Utiliser un pinceau ou une pince pour transférer délicatement une larve individuelle sur une plateforme plane, en veillant à ce que la larve soit recouverte d'un fin film d'eau.

Afin de minimiser les variations de pression ainsi que de garantir la position et l'angle corrects du stimulateur thermique, la pratique rend parfait. Appuyez délicatement la pointe du stimulateur contre les larves au segment A4, en exerçant une légère pression avec la pointe à un angle d'environ 45 degrés entre le stimulateur et la surface des larves. La pression doit provoquer une légère indentation à la surface des larves et sera généralement suffisante pour empêcher la locomotion.

Continuez à stimuler les larves jusqu'à l'apparition d'une réponse de retrait ou jusqu'à l'atteinte de la limite de coupure de 22 s. Les larves réactives montrent généralement d'abord un comportement préliminaire consistant à soulever la tête et la queue, suivi du comportement de retrait caractérisé par un roulis d'au moins 360 degrés. Une fois le comportement de retrait initié, relâchez le contact avec la sonde et enregistrez la latence ou le temps nécessaire au retrait.

Si aucun comportement de retrait n'est observé dans les 20 secondes, la larve est considérée comme un non-répondeur. Positionner les guides de lumière en fibre optique afin d'assurer un éclairage adéquat et à fort contraste. Pour observer les larves, placer le bloc chauffant sur la plaque chauffante avec la surface plane vers le haut, puis poser la plaque chauffante sur la base du microscope.

Mettre en marche la plaque chauffante à puissance maximale et laisser environ 15 minutes pour que la température se stabilise à 95 degrés Celsius. Prélever 80 microlitres d'eau distillée et déposer la goutte d'eau au centre d'une boîte de Pétri en polystyrène de 60 par 15 millimètres à l'aide d'une micropipette. Utiliser une pince pour placer délicatement une larve propre au stade de troisième instar au milieu de la goutte d'eau, en introduisant le moins d'eau supplémentaire possible.

Placez délicatement la boîte de Pétri sur le bloc chauffant solide du plateau chauffant. Ajustez rapidement la position de la boîte afin que les larves entières et la goutte d'eau soient visibles. Déclenchez le chronomètre.

Pour l'instant, la boîte de Pétri est placée sur le bloc chauffant solide de la plaque chauffante et le temps d'apparition de chaque comportement est enregistré. Cinq. Des comportements locomoteurs stéréotypés sont observés lors du transfert de la larve immergée dans l'eau sur la plaque chauffante. Le comportement normal en l'absence de chaleur implique une locomotion en parapluie, accompagnée de mouvements de tête de recherche.

Le comportement de secousse de la tête peut survenir ensuite, lorsque la larve déplace rapidement sa tête en mouvement avant ou latéral. Ce mouvement ressemble à leur locomotion normale dans l'eau, mais il est plus saccadé et accompagné d'un roulis persistant. Ce comportement se produit lorsque la larve effectue un roulis latéral d'au moins 360 degrés complets.

Cela peut se produire un nombre variable de fois et implique parfois des roulades incomplètes. Aux fins de l'évaluation du comportement, ne comptabilisez que les roulades complètes de 360 degrés. Ce comportement est le plus similaire à la scène avec application locale de la sonde thermique pendant le comportement de flagellation.

La larve effectue des mouvements rapides de contraction et de relâchement le long de l'axe antéro-postérieur, rapprochant très brièvement la tête de la queue. Le fouettage est souvent observé en succession rapide, deux fois ou simultanément avec le roulis. Enfin, la larve présente un comportement de crise, souvent suivi de paralysie. Pendant le comportement de crise, la larve s'étire le long de l'axe interopostérieur et présente une fréquence élevée de contractions corporelles complètes.

Un comportement de tremblement sans paralysie par courbure apparaît lorsque la larve cesse tout mouvement. Chez certaines larves, cette phase est permanente, tandis que d'autres présentent ensuite un mouvement pulsatile de faible fréquence. Sur ce graphique représentant le pourcentage de larves réagissant dans chaque catégorie, on observe un plafond de la réponse larvaire à la nociception thermique. Dans le test à l'aiguille chauffante, 100 % des larves sont des répondeurs rapides jusqu'à une température de l'aiguille de 52 degrés Celsius.

Cependant, à 54 degrés Celsius et au-dessus, 90 % ou plus des larves ne réagissent pas, même après 20 secondes de contact. Bien que ces larves continuent de bouger après la coupure au 22e essai, le nombre de roulades ou la durée passée en comportement de retrait d’aversion peut également être mesuré et représenté graphiquement. De manière surprenante, une relation inverse semble exister entre la température du stimulateur et la robustesse de la réponse, les températures plus basses provoquant apparemment un nombre plus élevé de roulades.

Cinq comportements locomoteurs stéréotypés sont observés lors du transfert de la larve immergée dans l'eau vers la plaque chauffante. Les latences moyennes auxquelles ces comportements sont observés sont indiquées ici, de même que les températures moyennes de la goutte d'eau mesurées pour chaque latence dans les conditions optimales de test présentées ici. Le pourcentage de larves présentant chaque comportement distinct variait de 77 à 100 %. Bien que les comportements de roulis et de fouet soient parfois omis, se chevauchent ou se produisent dans l'ordre inverse, le pourcentage de larves ayant survécu après l'initiation du comportement de paralysie dans le test sur plaque chauffante est indiqué ici. Les larves ont été chauffées jusqu'à la paralysie, puis retirées pour être placées dans des conditions de culture standard afin de se rétablir.

Les larves témoins ont reçu un traitement équivalent, sauf qu'elles n'ont pas été exposées à la chaleur, et la formation de PPE chez les adultes viables a été quantitative entre le septième et le treizième jour. Ici, MD G quatre induit l'expression de transgènes régulés par UAS dans les quatre classes de neurones sensoriels périphériques multidendritiques. UAS ou un delta C exprime une version modifiée du canal potassique rectificateur ouvert de drosophile, nécessaire à la transmission synaptique, tandis que UAS orrc un delta NC exprime une version encore plus modifiée de ce même canal, qui n'interfère pas avec la transmission synaptique.

Remarquez que seules les larves portant à la fois le conducteur MD GAL4 et le transgène UAS ORC1ΔC présentent des latences accrues pour quatre des cinq comportements observés. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mesurer les réponses locales et globales des larves de Drosophila à des stimuli thermiques nocifs. Ces procédures peuvent être combinées à d'autres méthodes, comme l'analyse génétique, afin d'identifier les gènes nécessaires à la nociception thermique. Lors de la réalisation du test à la sonde chauffante, il est important de veiller à minimiser les variations de pression, de position et d'angle de contact de la sonde.