Name: Mesure de la chimiotaxie cellulaire avec ECIS / Taxis (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Découvrez la mesure automatisée de la chimiotaxie cellulaire en temps réel avec le système ECIS/Taxis utilisant la détection d'impédance électrique. Cette méthode permet d'observer le mouvement des cellules vers une électrode cible.

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Ce travail a été soutenu par des subventions du National Institutes of Health (ES07408 et EB00208).

1. Préparation des électrodes ECIS / Taxis <ol><li> La surface d'or du réseau d'électrodes ECIS / taxis (constitué de 8 chambres par lame) est d'abord stabilisée par un traitement préalable avec la cystéine 10 mM stérile dans l'eau déminéralisée (dH 2 O) pendant 15 min à température ambiante dans des conditions stériles. </li><li> Aspirer la solution cystéine à partir de chaque chambre d'électrode, rincer 3 fois avec O stérile dH 2, et les remplacer par 250 pi de milieu complet (RPMI 1640, 10% de FBS, 25 mM de tampon HEPES). </li><li> Connectez le réseau d'électrodes à broches de contact sur support tableau instrument pour effectuer une vérification de l'électrode. </li><li> Les chambres qui sont correctement connectés seront mis en évidence en vert sur l'écran d'ordinateur. Si les chambres sont surlignées en rouge, ils ne sont pas connectés et l'électrode doit être repositionné dans le support de tableau à établir des contacts pour toutes les chambres. </li><li> Une fois toutes les chambres sont reliées, cliquez sur le bouton "Vérifier" dans le logiciel du contrôleur pour dissuaderminer la résistance initiale et des valeurs de capacité pour chaque chambre. Les valeurs de résistance devrait se situer entre 1600 et 2000 ohms, et des valeurs de capacité devrait se situer entre 5 et 6 nanofarads pour un tableau 8 Chambre. Si une chambre n'est pas dans ces paramètres acceptables, la chambre individuelle ne doit pas être utilisé pour recueillir des données. </li><li> Débranchez l'électrode du porte-tableau à préparer les chambres individuelles d'agarose. Aspirer à moyen de chambres et laver chaque chambre stérile 3 fois avec dH 2 O. </li></ol> 2. Préparation Agarose Chambers <ol><li> Dans un tube de 15 ml stérile conique en polypropylène, mesure 0,03 g d'agarose GTG Seakem et ajouter 1 ml de PBS stérile. Remplacer le capuchon du tube lâche, et faire fondre l'agarose en autoclave pour un cycle de 2 min liquide (fusion dans un four micro-ondes n'est pas efficace pour ce test). Ce court laps de temps ne va pas fondre le tube conique. Pour les cellules moins exigeants qui ne nécessitent pas de sérum pour la culture (par exemple, Dictyostelium discoideum) 0,5%agarose peut être fait dans le milieu approprié et fondu dans un four micro-ondes. L'autoclave est nécessaire pour les cellules qui nécessitent du sérum, comme ce sera dénaturé si fondu au micro-ondes. </li><li> Ajouter 5 ml de milieu RPMI complet chauffé dans un bain d'eau (55 ° -60 ° C) directement à l'agarose à chaud, à une concentration finale de 0,5% d'agarose et de haut en bas pipette doucement pour mélanger. </li><li> Pipeter 300 ul d'agarose milieu fondu dans chaque chambre, remplacer les ECIS / couverture réseau taxis et de permettre au gel à la température ambiante. </li><li> Pipeter en restant dans le capuchon d'agarose de tube de 15 ml d'évaluer gélifiant agarose. Cet excès d'agarose sera également utilisé dans la partie 4: coupe des puits dans l'agarose. </li></ol> 3. Construire et Affûtage de la canule outil de coupe bien <ol><li> Aiguisez deux jeunes de 14 canules fin calibre émoussée, l'aide d'un 5/64 "bits. Tourner la pointe du foret dans chaque ouverture canule avec une perceuse à vitesse lente, en s'assurant que la foret coupe toute bord intérieur de chaque op canuleforcement pour former un bord tranchant (figure 4A). </li><li> Percez deux trous à travers 1 "x 2" x ¼ "en plexiglas (figure 4B-D) avec un 5/64" bits dans une perceuse à colonne. Insérez chaque aiguisé 14 canule de calibre de sorte qu'il dépasse d'une distance égale dans chaque trou en plexiglas. </li></ol> 4. Coupe Wells en Agarose <ol><li> Stériliser les canules de calibre 14 par une légère flamme des conseils. Avant la coupe de puits dans la chambre de ECIS, permettre à la canule à refroidir à température ambiante, ou refroidir la canule en touchant l'agarose dans le capuchon du tube de 15 ml. Si la température de la canule est trop élevé, l'agarose va fondre comme les puits de la chambre sont coupés, rendant les puits difforme et défectueux. </li><li> Aligner le couple de canule au-dessus des deux points d'or autour de l'électrode cible dans chaque chambre (Figure 2c et 5). Insérez le verticalement canule, sans aucun mouvement horizontal, l'arrêt lors d'un contact en douceur entre la canule etla surface d'électrode. Retirez délicatement la canule, à nouveau, sans aucun mouvement horizontal. Mise en place de puits supplémentaires pour s'opposer à gradients est également possible avec une reconfiguration du gabarit canule. </li><li> Aspirer doucement le bouchon d'agarose laissé par la canule, l'aide d'un stérile à 9 "pipette Pasteur, reliée à la pression sous vide à basse, avec un piège à vide attraper des déchets d'agarose. </li><li> Ajouter 300 ul de milieu RPMI complet à la surface de chaque chambre à 37 ° C, pendant 2 min pour saturer l'agarose, puis aspirer délicatement les médias de la surface et les puits sans déranger l'agarose. </li></ol> 5. Chargement de la Wells <ol><li> Chaque puits est capable de contenir un volume de 7 pl. Pour un puits dans chaque chambre, ajouter 7 pl de suspension de cellules. Pour les cellules T Jurkat, utiliser 2 x10 7 cellules / ml. Ces cellules vont répondre à 7 pl de 200 ng / ml SDF-1α dilué dans du RPMI incomplètes, qui ne dispose pas de sérum. Utiliser les médias comme un seul complètes suite négativerol. </li><li> Après les puits sont chargés, voir chaque chambre du tableau avec un microscope inversé afin de s'assurer que tous les puits ont été coupés et correctement remplie. Les cellules doivent être en dans les limites de la limite du puits. Si elles sont considérées à la fois dans les puits, ou se répandent au-delà de la bordure des cellules bien, puis un écart s'est formé en vertu de l'agarose. Notez les puits mal mis en place, comme les données peuvent ne pas être fiable interprété à partir de ces chambres. </li></ol> 6. Collecte des données <ol><li> Placer l'électrode dans le porte-matrice et re-connecter les pads d'or sur le réseau d'électrodes sur les broches pogo ressort du titulaire et cliquez sur "setup". Les puits qui sont correctement connectés seront surlignés en vert. Si les puits sont rouges, ils ne sont pas connectés et l'électrode doit être repositionné dans le support de tableau. </li><li> Sélectionnez "8WE1" (8 et 1 électrode) à partir du menu déroulant dans le panneau de logiciels pour indiquer la configuration du réseau. </li><li> Sélectionnez «vérifier» dans le contr le logicielpanneau de ol pour déterminer la résistance initiale et des valeurs de capacité pour chaque puits. Les valeurs de résistance devrait se situer entre 1600 et 2000 ohms, tandis que les valeurs de capacité devrait se situer entre 5 et 6 nanofarads. </li><li> Sélectionnez plusieurs fréquences pour mesurer la résistance à plusieurs fréquences. Il ya un choix de personnalisation de fréquences, ou en utilisant un ensemble de fréquences recommandées. Les standards de multiples paramètres d'acquisition de fréquences de saisir les données à 11 fréquences préréglées (52,5, 125, 250, 500, 1.000, 2.000, 4.000, 8.000, 16.000, 32.000 et 64.000 Hz) à un taux de 8 puits par minute. L'intervalle de temps entre les mesures peuvent également être personnalisés. La collecte de données de fréquences multiples permet une analyse de la capacité, l'impédance, et la résistance. Collecte des valeurs de résistance à 4000 Hz est généralement suffisant pour les études de mammifères chimiotactisme des cellules, mais les fréquences supplémentaires peuvent fournir des informations dans d'autres contextes 12,13. </li><li> Durée de l'expérience totale peut être réglé, sur la main droitepanneau, ou l'expérience ne peut être arrêté manuellement, en cliquant sur "Terminer" une fois les cellules ont produit la résistance qui sont indicatifs de l'arrivée à l'électrode. Le temps nécessaire pour que les cellules arrivent à l'électrode dépend du type cellulaire utilisé. </li><li> Cliquez sur "Démarrer" pour lancer la collecte de données. </li></ol> 7. Gestion des données <ol><li> Bien que les données peuvent être exportées vers Excel, le logiciel ECIS 1600R, qui accompagne le système ECISθ est la méthode la plus efficace pour analyser les données ECIS / Taxis. </li><li> Les données du logiciel outil d'analyse barre contient les boutons radio Z, R et C. Ces déterminer si l'impédance, la résistance ou la capacité, respectivement, est tracée sur l'axe vertical contre l'axe des x (temps écoulé). </li><li> ECIS / Taxis de données est plus efficace affiché comme la résistance au fil du temps à 4.000 Hz. Les fluctuations rapides de la résistance, ou microtransients (Figure 1), sont la preuve du mouvement cellulaire sur l'électrode. Compiler, obinning r les points de données de sorte que tous les points sont tracés, n'est pas recommandé pour l'ECIS / taxis, car il sera microtransients moyenne sur les données. </li><li> Une fois que le graphique a été réalisé avec le logiciel ECIS1600R, il peut être exporté en choisissant "graphique à l'exportation" dans le menu Fichier, et enregistré au format. Tif ou. Jpg. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs Cellulaire chimiotactisme est indiquée par une augmentation de la résistance à 4.000 Hz. L'arrivée de cellules sur l'électrode cible est également indiqué par l'apparition de fluctuations rapides de la résistance appelés microtransients ou MicroMotion tel que décrit dans Opp et. al., 2009 (Figure 1) 14. Un résultat négatif est indiqué par cohérente, ou une légère diminution, de la résistance à 4000 Hz, comme on le voit en rouge dans la figure 1. L'absence de microtransients est aussi un signe d'une absence de mouvement de la cellule à l'électrode. L'augmentation de la résistance est directement proproportionnelle aux nombre de cellules qui traversent l'électrode 10. L'ajout de l'anticorps monoclonal spécifique d'un facteur chimiotactique ou des toxines connues pour interférer avec les récepteurs couplés aux protéines G peuvent bloquer chimiotactisme 11. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig1.jpg"> Figure 1. Chimiotactisme des cellules T humaines Jurkat en réponse à SDF1α. Cellules humaines Jurkat T (2,0.10 6 cellules / ml) ont été exposés à un gradient de SDF-1α (à partir de la concentration de 100 ng / ml) ou RPMI 1640 en tant que contrôle négatif. La résistance normalisée à 4000 Hz a été représentée graphiquement. L'homme cellules Jurkat T déplacé en réponse à SDF-1α, comme en témoigne l'augmentation de la résistance et microtransients, alors qu'aucun mouvement n'a été observée avec l'exposition à RPMI 1640. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig2.jpg"> Figure 2. Vue de dessus un ECIS / taxis Electrode without agarose. Chaque électrode ECIS / Taxis est composé de 8 chambres individuelles. Chaque chambre de partage une grande électrode (a), et contient une électrode de cible individuelle (b). Chaque chambre possède également 2 cercles d'or (c), qui sont utilisés en tant que guide lors de la coupe des puits dans l'agarose avec les canules. Les carrés d'or (d) sont des plots de contact qui se connectent à des broches pogo en vue d'appliquer le courant alternatif à l'électrode. Les électrodes cibles individuelles sont chacun dans le circuit avec l'électrode supérieure compteur (e). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig3.jpg"> Figure 3. Deux puits sont coupés dans chaque chambre d'agarose-remplie. Lorsque le chimioattractant est ajoutée à un bien qu'elle diffuse pour créer un gradient dans l'agarose, avec la plus grande concentration de chemoattract plus proche de la chimioattractant bien. Les cellules se déplacer sous l'agarose vers des concentrations plus élevées de chimioattractant et peut passer au-dessus de l'électrode cible. Commeles cellules traversent l'électrode cible, soit une augmentation de la résistance est enregistré par le logiciel de l'ECIS 1600R. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig4.jpg"> Figure 4. Insertion de deux jeunes de 14 canules de calibre en plexiglas. A) A, B 5/64 "foret est utilisé pour affiner l'extrémité de la canule.) Deux trous doivent être forés dans plexiglas pour accueillir les canules de calibre 14 en fonction de la prise de vue mise en page. C) Utiliser une perceuse à colonne pour s'assurer que les trous sont perpendiculaires à la surface pleixglass. D) Deux canules aiguisé sont insérés à travers ¼ "en plexiglas, 2 mm d'intervalle (mesurée à partir des bords intérieurs). Ces canules sont soigneusement aiguisé inséré dans agarose pour couper les puits. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig5.jpg"> Figure 5. Alignement canules avec des points d'or dans l'ECIS / Taxis chambre. Pour couper les puits, les canules aiguisé doitêtre alignés avec les points d'or flanquantes l'électrode cible sur le fond de la chambre de ECIS / taxis. Le canules doit être inséré verticalement, sans aucun mouvement horizontal, et retiré de la même manière.

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</ol>

David A Knecht et Michael Un Lynes avoir un brevet délivré pour la technologie ECIS / Taxis, qui comme on l&#39;a autorisé par l&#39;Université du Connecticut à Applied Biophysics, Inc

De nouvelles caractéristiques de l&#39;essai ECIS / Taxis incluent sa capacité à automatiser la collecte des données en temps réel comme les cellules répondent aux chimiotactique. Bien que l&#39;application la plus courante de cette technologie est de mesurer les réponses cellulaires à des gradients chimiotactiques individuelles, ou à des gradients constitués de mélanges d&#39;agonistes et des antagonistes de chimiotaxie, l&#39;approche ECIS / Taxis est également prête à des variations de ces configurations qui pourraie...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif </td><td> Entreprise </td><td> Le numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> ECIS Zθ </td><td> Applied Biophysics </td><td></td><td> <a href="http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php">http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php</a> </td></tr><tr><td> Réseau d&#39;électrodes ECIS </td><td> Applied Biophysics </td><td> 8W chimiotactisme </td><td> <a href="http://www.biophysics.com/cultureware.php">http://www.biophysics.com/cultureware.php</a> </td></tr><tr><td> Seakem GTG agarose </td><td> Applications BioWhittaker moléculaires </td><td> 50070 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Cellgro </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone sérum de veau fœtal </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH300703 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / streptomycine </td><td> MP Biomedicals </td><td> 1670049 </td><td> La pénicilline 5000 UI / ml; streptomycine 5 mg / ml </td></tr><tr><td> Tampon HEPES </td><td> MP Biomedicals </td><td> 1688449 </td><td> Solution 1M, le grade de culture cellulaire </td></tr><tr><td> 14 Gauge canule en acier inoxydable (2) 4 pouces </td><td> General Supply Laboratoire </td><td> 5-8365-1 </td><td> Point de Blunt </td></tr></tbody></table>

mesure de la chimiotaxie cellulaire avec ecis / taxis

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Mouvement cellulaire en réponse à des stimuli externes est fondamental pour de nombreux processus cellulaires, y compris la cicatrisation des plaies, l&#39;inflammation et la réponse à l&#39;infection. Procédé pour mesurer la chimiotaxie commune est le dosage chambre de Boyden, dans lequel les cellules et chimioattractants sont séparées par une membrane poreuse. Comme les cellules migrent à travers la membrane vers le chimioattractant, ils adhèrent à la face inférieure de la membrane, ou à l&#39;automne dans les médias sous-jacentes, et sont ensuite colorées et comptées visuellement 1. Dans cette méthode, les cellules sont exposées à un fort gradient chimiotactique et transitoire, qui est pensé pour être une mauvaise représentation des gradients trouvés dans les tissus 2. Un autre système de dosage, la sous-agarose chimiotaxie dosage, 3, 4 mouvement cellulaire mesures sur un substrat solide dans un film mince aqueuse qui se forme sous la couche d&#39;agarose. Le gradient qui se développe dans l&#39;agarose est peu profond et est pensé pour être une applicationropriate représentation des gradients d&#39;origine naturelle. Chimiotactisme peut être évaluée par imagerie microscopique de la distance parcourue. Tant le dosage chambre de Boyden et le dosage de la sous-agarose sont généralement configurés en tant que tests de point de terminaison. Le processus automatisé ECIS / Taxis système combine l&#39;approche sous-agarose avec impédance électrique cellulaire substrat Sensing (ECIS) 5, 6. Dans ce test, électrodes cibles se trouvent dans chacune des chambres 8. Un grande contre-électrode traverse chacune des chambres (8 figure 2). Chaque chambre est remplie avec de l&#39;agarose et deux petits godets sont la coupe dans l&#39;agarose sur chaque côté de l&#39;électrode cible. Un puits est rempli avec la population de cellules d&#39;essai, tandis que l&#39;autre contient les sources de chimioattractant diffusion (Figure 3). Courant passé à travers le système peut être utilisé pour déterminer le changement de résistance qui se produit en tant que cellules passer l&#39;électrode cible. Les cellules sur la cible Electrodee augmenter la résistance du système 6. En outre, des fluctuations rapides de la résistance représentent des changements dans les interactions des cellules avec la surface des électrodes et sont en cours indicatif de changements de forme cellulaire. Le système ECIS / Les taxis peuvent mesurer le mouvement de la population cellulaire en temps réel sur de longues périodes de temps, mais il est aussi assez sensible pour détecter l&#39;arrivée d&#39;une cellule unique à l&#39;électrode cible. Dictyostelium discoidium est connu pour migrer en présence d&#39;un folate gradient 7, 8 et sa réponse chimiotactique peut être mesurés avec précision par ECIS / taxis 9. Chimiotactisme des leucocytes, en réponse à SDF1α et aux antagonistes de chimiotaxie a également été mesurée avec ECIS / Taxis 10, 11. Un exemple de la réponse des leucocytes à SDF1α est illustré à la figure 1.

Le système ECIS / Taxis est un système automatisé, en temps réel test qui mesure la chimiotaxie cellulaire. Dans cet essai, les cellules se déplacent sous une couche d&#39;agarose pour arriver à une électrode cible. Mouvement cellulaire est mesurée par l&#39;apparition de la résistance en courant alternatif courant 0.

Mesure de la chimiotaxie cellulaire avec ECIS / Taxis

Le mouvement cellulaire en réponse à des stimuli externes est fondamental pour de nombreux processus cellulaires, notamment la cicatrisation des plaies, l'inflammation et la réponse à...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer la chimiotaxie dans un dosage automatisé en temps réel, utilisant la détection par impédance électrique sur support cellulaire, ou EIS. Cela est réalisé en préparant d'abord les électrodes axxis en remplissant chaque chambre avec 0,5 % d'agarose dans un milieu RPMI complet. L'étape suivante consiste à découper simultanément deux puits dans l'agarose de chaque chambre à l'aide d'un gabarit d'aiguille de calibre 14, puis à aspirer les deux bouchons d'agarose de chaque chambre.Un puits est rempli avec une suspension unique de cellules, tandis que l'autre est rempli avec un chémotactique. Ensuite, l'électrode est reliée au système ISIS en forme de thêta à travers le support de réseau, placé dans un incubateur réglé aux paramètres atmosphériques appropriés au type cellulaire testé. Enfin, la chimiotaxie cellulaire peut être observée en mesurant en temps réel la variation de résistance lorsque les cellules atteignent l'électrode cible située entre les deux puits.Le principal avantage du test axxis par rapport aux méthodes existantes, telles que le test de chambre de Boyden ou les tests classiques sous agarose basés sur microscope, est qu'il permet des mesures automatisées en temps réel de la chimiotaxie sans nécessiter d'interventions continues sur le système. Pour commencer la préparation des électrodes, stabilisez la surface en or du réseau d'électrodes ISIS Texas par un prétraitement avec une solution stérile de 10 millimolaire de cystéine dans de l'eau déionisée pendant 15 minutes à température ambiante, en conditions stériles. Après le prétraitement, aspirez la solution de cystéine de chaque chambre d'électrode.Rincez trois fois avec de l'eau déionisée stérile et remplacez par 250 microlitres de milieu complet. Ensuite, reliez le réseau d'électrodes aux broches de contact sur le support du réseau d'instrument pour effectuer un contrôle des électrodes. Les chambres correctement connectées seront mises en évidence en vert sur l'écran de l'ordinateur.Si les chambres sont surlignées en rouge, elles ne sont pas connectées, et l'électrode doit être repositionnée dans le support de réseau pour établir des contacts pour toutes les chambres. Une fois que toutes les chambres sont connectées, cliquez sur le bouton de validation dans le contrôleur logiciel ISYS Theta pour déterminer les valeurs initiales de résistance et de capacité pour chaque chambre ; les valeurs de résistance doivent se situer entre 1600 et 2000 ohms, et les valeurs de capacité entre cinq et six nanos pour un réseau de huit chambres. Si une chambre individuelle ne se situe pas dans ces paramètres acceptables, elle ne doit pas être utilisée pour recueillir des données.Ensuite, déconnectez l'électrode du support de matrice pour préparer les chambres individuelles de aros. Aspirez le milieu des chambres et rincez chaque chambre trois fois avec de l'eau déionisée stérile. Pour commencer l'installation des chambres de aros, préparez une solution de aros contenant le milieu RPMI, comme indiqué dans le protocole écrit.Introduisez 300 microlitres de milieu aros fondu dans chaque chambre, puis transférez le reste de l'agros dans le bouchon d'un tube de 15 millilitres. Pour évaluer la prise en gel de l'agros, remettez le couvercle du dispositif ISIS axxis array et laissez gélifier à température ambiante afin de former la canule réutilisable. À l’aide de l’outil de découpe des puits, aiguisez deux canules sans biseau de calibre 14.À l’aide d’un foret de cinq soixante-quatrièmes de pouce, faire tourner la pointe du foret dans chaque ouverture de canule à l’aide d’un perceuse à faible vitesse, en veillant à ce que le foret découpe tout le pourtour intérieur de chaque ouverture de canule. Pour former un tranchant bien aiguisé, percer deux trous dans du plexiglas avec un foret de cinq soixante-quatrièmes de pouce. À l’aide d’un perceuse à colonne, insérer chaque canule de calibre 14 aiguisée dans l’un des trous de manière à ce qu’elles dépassent toutes à la même distance du plexiglas.Stérilisez l'outil de canule de calibre 14 en chauffant légèrement les extrémités de la canule avant de découper les puits dans la chambre EIS. Refroidissez la canule en touchant l'agar dans le bouchon du tube de 15 millilitres. Si la température de la canule n'est pas suffisamment abaissée, l'agar fondra lors de la découpe des puits de la chambre, ce qui rendra les puits déformés et défectueux.La découpe des puits sans compromettre l'intégrité de l'agar est l'aspect le plus délicat de cette procédure. Cela nécessite un alignement précis de la canule et une pression de vide très faible. Alignez la paire de canules au-dessus des deux points dorés entourant l'électrode cible dans chaque chambre.Insérez la canule verticalement sans aucun mouvement horizontal, en vous arrêtant au moment du contact doux entre la canule et la surface de l'électrode. Retirez soigneusement la canule sans aucun mouvement horizontal à l'aide d'une pipette Pasteur stérile de cinq pouces reliée à une pression de vide faible avec un piège à vide. Pour récupérer les déchets d'agarose, aspirez délicatement les bouchons d'agarose laissés par l'outil de canule.Ensuite, ajouter 300 microlitres de milieu RPMI complet à la surface de chaque chambre à 37 degrés Celsius pendant deux minutes afin de saturer les aros. Après deux minutes, aspirer délicatement le milieu de la surface et des puits sans perturber les aros. Chaque puits peut contenir un volume de sept microlitres par puits dans chaque chambre et sept microlitres de suspension cellulaire.Dans cette démonstration, les cellules T jca sont utilisées à une concentration de deux fois dix puissance sept cellules par millilitre. Ensuite, chargez sept microlitres du chémotactique dans le deuxième puits des chambres. Pour les cellules T JCA, 200 nanogrammes par millilitre de sdf un alpha dilué dans du milieu incomplet.Le RPMI est utilisé comme chémotactique pour une charge témoin négative. Ajouter sept microlitres de milieu complet uniquement dans le deuxième puits. Une fois les puits chargés, observer chaque chambre du réseau au microscope inversé afin de s'assurer que tous les puits ont été correctement découpés et remplis.Les cellules doivent se trouver à l'intérieur des limites de la cavité. Si des cellules sont observées dans les deux cavités ou s'étendent au-delà de la bordure de la cavité, un espace se forme sous les aros. Remarque : les cavités mal configurées ne permettent pas une interprétation fiable des données provenant de ces chambres.Pour commencer la collecte de données, placez l'électrode dans le support de réseau. Reconnectez les pastilles en or du réseau d'électrodes aux broches ressorts du support en utilisant le système de clic configuré dans le logiciel ISIS theta. Les puits correctement connectés seront mis en surbrillance en vert.Si les puits sont rouges, ils ne sont pas connectés et l'électrode doit être repositionnée dans le support de réseau à partir du menu déroulant. Dans le panneau logiciel, sélectionnez huit W un point-virgule. Cela indique la configuration du réseau. Huit.Dans le panneau de contrôle logiciel, sélectionnez une électrode pour vérifier et déterminer les valeurs initiales de résistance et de capacité. Pour chaque électrode, sélectionnez plusieurs fréquences afin de mesurer la résistance à différentes fréquences. La collecte de données à plusieurs fréquences permet l'analyse de la capacité, de l'impédance et de la résistance.Il est possible de personnaliser les fréquences ou d'utiliser un ensemble de fréquences recommandées. Les paramètres standard d'acquisition multifréquence permettent d'acquérir des données à 11 fréquences prédéfinies à raison de huit puits par minute. L'intervalle de temps entre les mesures peut également être personnalisé.La durée totale de l'expérience peut être définie dans le panneau de droite. En alternative, l'expérience peut être arrêtée manuellement en cliquant sur terminer. Une fois que les cellules ont produit une résistance indiquant qu'elles sont arrivées à l'électrode, cliquez sur démarrer pour lancer la collecte des données.Bien que les données puissent être exportées vers Excel, le logiciel EISs 1600 R accompagnant le système EISs theta constitue la méthode la plus efficace pour analyser les données d'impédance électrochimique (EISs taxes). La barre d'outils d'analyse des données du logiciel contient des boutons radio, Z, R et C, qui déterminent respectivement si l'impédance, la résistance ou la capacité est tracée sur l'axe des ordonnées, tandis que l'axe des abscisses représente le temps écoulé. Les données d'impédance électrochimique (EISs taxes) s'affichent de manière optimale sous forme de résistance en fonction du temps à 4 000 hertz.Les fluctuations rapides de la résistance ou les micro-transitoires sont des indices de mouvements cellulaires sur l'électrode. Compiler ou courber les points de données de manière à ce que tous les points ne soient pas inclus n'est pas recommandé pour l'axe esys, car cela aurait pour effet de lisser les micro-transitoires dans les données. Une fois le graphique créé, avec le logiciel ISIS 1600 R, il peut être exporté en choisissant « Exporter le graphique » dans le menu Fichier, puis enregistré au format TIFF ou JPEG.Des cellules T JERK CAT humaines ont été exposées à un gradient de SDF-1α afin de stimuler leur déplacement ou à du RPMI 1640 en tant que contrôle négatif. La résistance normalisée à 4 000 hertz a été reportée ici. La chimiotaxie cellulaire est indiquée par une augmentation de la résistance à 4 000 hertz lorsque les cellules T J CAT humaines migrent en réponse au SDF-1α.L'arrivée des cellules sur l'électrode cible est indiquée par l'apparition de fluctuations rapides de la résistance appelées micro-transitoires. L'augmentation de la résistance est directement proportionnelle au nombre de cellules traversant l'électrode. Un résultat négatif est indiqué par une résistance stable ou par une légère diminution de la résistance à 4 000 hertz.Ce phénomène est observé lorsque les cellules sont exposées au RPMI 1640. L'absence de micro-transitoires constitue également un indicateur de l'absence de mouvement cellulaire au niveau de l'électrode. Outre cette procédure de base, d'autres modifications peuvent être apportées pour utiliser le système Esys, Texas afin de surveiller le déplacement cellulaire en présence d'anticorps monoclonaux spécifiques d'un chémoadjuvant, de modificateurs pharmaceutiques ou de toxines.

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