Name: Détermination du nombre de cellules de mammifères, taille des cellules et la santé des cellules à laide du Moxi Mini Z Compteur de cellules automatisé (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 16 s
Description: Découvrez le comptage cellulaire automatisé avec le Moxi Z pour évaluer la concentration, la taille et la santé des cellules mammifères en huit secondes. Cette méthode par impédance offre une précision supérieure à 95%.

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1. Préparation des échantillons <ol><li> Diluer la suspension de cellules avec ORFLO diluant ou un diluant approprié de sorte que la concentration cellulaire se situe dans la plage de fonctionnement de l&#39;instrument (3000 à 500 000 cellules par millilitre de type M de cassette ou de 3000 à 2.500.000 cellules / mL dans la cassette de type S). </li><li> Une dilution de 1:5 à 1:20 (Type M cassette) ou pas de dilution à 1:5 de dilution (cassette de type S) est recommandé pour les lignées cellulaires de mammifères les plus, mais la dilution appropriée dépendra du type de cellule et de la densité de semis. Le volume nécessaire pour un décompte précis est d&#39;environ 75 pi. </li></ol> 2. Le traitement des échantillons <ol><li> Tournez le Z Moxi en appuyant sur ​​le bouton d&#39;alimentation et de l&#39;écran d&#39;accueil s&#39;affiche. </li><li> Appuyez sur le plateau vers le bas et insérez une cassette dans le Z. Moxi L&#39;échantillon pipette 75μL ... l&#39;écran sera affiché. </li><li> Pipeter un échantillon 75 pL dans l&#39;orifice de remplissage de la cassette (ovale bleunumérotés de 1 ou 2, selon le fin de la cassette a été insérée dans l&#39;instrument). Ce sont des cassettes jetables, qui peuvent être utilisés pour les tests 2. Remarque: Placez la pointe de pipette directement dans le chargement et à ~ 45 ° angle de sorte que la pointe est pris sous la lèvre avant du puits. Lors de la distribution, il est important que le vide n&#39;est pas «aller de l&#39;avant» de la distribution du fluide que pourrait causer des poches d&#39;air d&#39;entrer dans la cassette. Il est recommandé d&#39;avoir une petite perle (la taille de l&#39;entrée ainsi) de la forme liquide sur le bien pendant la distribution. </li><li> Pour le comptage des cellules de mammifères les plus, touchez l&#39;écran n&#39;importe où pour commencer. Pour le comptage des particules très petites (de 4 à 8 um de diamètre en moyenne pour le type M et 3-8 um de diamètre en moyenne pour le type S), le Z Moxi peut être exécuté en mode petites particules. Note: le type de cassette est indiqué dans la barre noire dans la partie supérieure de l&#39;écran. Dans ce mode, Moxi Z définit l&#39;échelle de diamètre de 2 à 10 um que la valeur par défaut, et réalise la numération uchanter paramètres optimisés pour la détection de petites cellules. Appuyez sur la touche TOUCH voici un petit bouton Mode de particules (carré noir) pour lancer le test et exécuter dans ce mode. </li><li> Le Z Moxi va commencer le test et les résultats de comptage de cellules sera terminée en environ 8 secondes (type M cassette) ou 15 secondes (cassette de type S). </li><li> Le ajustement de courbe et calculs MVI commencer automatiquement et ne nécessitent que quelques secondes supplémentaires. Quand un ajustement approprié est trouvé, les résultats seront alors automatiquement affichée sur l&#39;écran. </li><li> Pour faire Gating le mode d&#39;acquisition par défaut, appuyez sur la courbe d&#39;ajustement sur ​​le bouton pour basculer le comte en mode d&#39;ouverture de porte. </li><li> À ce stade, la cassette peut être enlevée de l&#39;unité. </li></ol> 3. Gestion des données <ol><li> Si l&#39;échelle AutoMode est éteint, les résultats sont d&#39;abord présentés pour un compte d&#39;ajustement de courbe sur une échelle de 2-34 pm de diamètre (type M cassette) ou 2-26 μm (cassette de type S). Si mise à l&#39;échelle Automode est activé, le Z Moxi automatiquement l&#39;échelle de l&#39;axe horizontal (axe x) à la plage qui est plus proche de la largeur de la courbe de la population-forme tout en assurant toutes les données de courbe d&#39;ajustement est affichée. </li><li> Si l&#39;échelle AutoMode est éteint, pour afficher manuellement les résultats à une résolution plus élevée, touchez l&#39;icône 2-26 um (type M) ou sur l&#39;icône 2-18 um (Type S). Remarque: Le type de cassette est indiqué dans la boîte bleue en haut à gauche de l&#39;écran. Il est recommandé lors du comptage des cellules plus petites ou des particules d&#39;améliorer à la fois les capacités d&#39;ajustement de courbe ainsi que la capacité de l&#39;utilisateur visuellement discrimination nuances des données. </li><li> En augmentant la résolution horizontale, le bouton mise à l&#39;échelle d&#39;ajuster dynamiquement pour permettre à vélo entre les gammes disponibles échelle axe des x: 2-34, 2-26, 2-18 et 2-10 um pour la cassette de type M; ou 2 -26, 2-18, et 2-10 um pour la cassette du type S. Cette fonctionnalité est uniquement dispoble immédiatement après une numération cellulaire. </li><li> Compter informations (cellules par ml) pour la courbe d&#39;ajustement ou de la région fermée est affichée dans une zone noire sous le côté gauche de l&#39;histogramme. Moyenne taille de la cellule d&#39;information est affichée dans la boîte noire sous le côté droit de l&#39;histogramme. </li><li> La valeur MVI est affichée une boîte bleue en haut à droite de l&#39;histogramme. Si le test a été exécuté en mode petite particule, la MVI ne s&#39;applique pas et sera affiché comme «MVI = SPM». En outre, si la concentration de cellules est en dehors de la plage de fonctionnement MVI, un message de «MVI = Out of Range&quot; sera affiché. </li><li> Pour enregistrer l&#39;histogramme en cours, touchez l&#39;icône Terminé. Cela permet d&#39;économiser les données avec un nom de «Test XXX&quot; où XXX est le numéro de test correspondant. </li><li> Pour régler manuellement la porte de l&#39;histogramme, appuyez sur pour basculer l&#39;Fit Curve compte des résultats sur le bouton. Cela rend Gating le mode d&#39;acquisition par défaut. Ensuite, faites glisser chaque marqueur de déclenchement bleu pour définir les portes ou appuyez sur eflèches e gauche et droite (ceux-ci apparaissent en touchant le marqueur de porte bleu) d&#39;ajustement de grille fines seules les cellules entre les marqueurs sont comptés. L&#39;échelle verticale histogramme est automatiquement redimensionnée en fonction de l&#39;amplitude de la population courbe d&#39;ajustement. Pour régler cette échelle verticale, faites glisser l&#39;écran vers le haut ou vers le bas dans la région histogramme. </li><li> Touchez le comte Gated bouton résultats pour ramener l&#39;affichage en mode d&#39;ajustement de courbe et de faire en mode ajustement de la courbe du mode d&#39;acquisition par défaut. </li><li> Ensuite, appuyez sur l&#39;icône Terminé pour enregistrer les résultats et revenir à l&#39;écran d&#39;accueil. Pour supprimer les résultats, appuyez sur l&#39;icône supprimer à tout moment pour supprimer définitivement les résultats du test. </li></ol> 4. L&#39;analyse des données précédemment acquises <ol><li> Pour ouvrir un test enregistrés, appuyez sur l&#39;icône Histogramme sur l&#39;écran d&#39;accueil. </li><li> Icônes pour un maximum de neuf histogrammes enregistrées seront affichées sur l&#39;écran.Appuyez sur l&#39;icône appropriée pour le critère de l&#39;intérêt ou appuyez sur la Page Up et Page Down icônes pour afficher les résultats de tests plus. </li><li> Chaque histogramme sera ouvert dans le mode de comptage soit Curve Fit ou mode de comptage Gated, selon la façon dont il a été enregistré. En mode de comptage Gated, marqueurs de déclenchement peuvent être positionnés comme vous le souhaitez en faisant glisser chaque marqueur de déclenchement bleu indépendamment. Porte automatique en touchant sur ​​le sommet désiré. Touchez pour basculer entre le comte et les modes Gated ajustement de la courbe de comptage. </li><li> Appuyez sur les icônes de zoom et un zoom arrière pour régler l&#39;échelle verticale de l&#39;histogramme. L&#39;échelle verticale peut également être modifié par la verticale passant un doigt sur la place d&#39;affichage (pour augmenter) ou vers le bas (pour diminuer). </li><li> Appuyez sur l&#39;icône Supprimer pour supprimer définitivement les résultats du test. </li><li> Appuyez sur l&#39;icône Terminé pourfermer les résultats des tests et revenir à l&#39;écran d&#39;accueil. (Remarque: vue zoomée ne seront pas enregistrées.) </li></ol> 5. Transfert de données vers un PC <ol><li> Les données peuvent être transférées vers un PC en utilisant l&#39;application Moxichart Orflo ou via transfert USB en branchant le câble USB Moxi Z à un PC ou un Mac. Pour le transfert Bluetooth (MoxiChart), d&#39;abord déterminer ID Bluetooth de l&#39;appareil en appuyant sur ​​l&#39;icône Bluetooth sur l&#39;écran d&#39;accueil de l&#39;unité de Moxi Z. </li><li> Sur l&#39;ordinateur, ouvrez l&#39;application MoxiChart et cliquez sur l&#39;icône Bluetooth dans le coin supérieur droit. Puis, choisissez le périphérique qui correspond à l&#39;ID Bluetooth du Z Moxi et sélectionnez un dossier de destination pour les fichiers téléchargés. </li><li> Moxichart transférera automatiquement tous les fichiers dans le répertoire spécifié via la connexion Bluetooth. </li><li> Les fichiers transférés par Bluetooth (MoxiChart) ou USB peut être ouvert et d&#39;analysezed directement avec l&#39;application MoxiChart ou, parce qu&#39;ils sont formatés. csv, ils peuvent être ouverts directement dans Microsoft Excel ou d&#39;autres programmes d&#39;analyse de données pour l&#39;analyse de plus / custom. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Pour évaluer la précision et l&#39;exactitude des Z Moxi, les chiffres de HEK-293, les cellules HeLa, CHO-K1, la levure, Jurkat E6-1 des cellules, des cellules PC12, et de précision calibré suspensions de perles avec des concentrations allant de 0-500,000 cellules / mL (de type M cassette) et 0-2-2.5e 6 cellules / ml (cassette de type S) ont été comptées et comparées en utilisant un Coulter Z2 et le Z. Moxi Tous les cellules de mammifères ont été obtenus à partir de l&#39;American Type Culture Collection (ATCC) et cultivé comme décrit précédemment 7-11. Brièvement, les cellules ont été cultivées en suspension dans 75 mm 2 flacons de culture tissulaire avec les médias de base de RPMI 1640 (Jurkat E6-1, PC12), MEM (HEK-293, HeLa), ou F12K (CHO-K1) des cellules. Tous les médias a été complétée par10% de sérum de veau fœtal et 100 mg de streptomycine U penicillin/100. Flacons ont été maintenues dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2. Les cellules ont été repiquées tous les 3 jours. Les cellules de levure (X5, C. albicans, Vin 13) ont été donnés et l&#39;utiliser immédiatement comme prévu. Concentrations de l&#39;échantillon initial de ~ 500.000 cellules / ml pour les données de type M et les cassettes de ~ 2-2.5e 6 cellules / ml pour la cassette du type S ont été établies en utilisant le Z2 Coulter. Subséquents des niveaux de concentration théoriques ont été préparés par dilutions successives avec des tampons physiologiques (Isoton II ou une solution saline équilibrée de Hank). À chaque concentration, des échantillons identiques ont été mesurées par les deux systèmes et représentées les unes des autres. Comme on le voit dans la figure 2, il y avait une forte corrélation linéaire (de type M r 2&gt; 0,9886, Type S r 2&gt; 0,9781) entre les chiffres pour tous les échantillons. Les concentrations ont également été comparés à des concentrations cellulaires attendus / théorique à la fois avec le Z et le Moxi Z2 ( <strong&gt; Figure 3) et de nouveau fait preuve de fortes corrélations linéaires (de type M r 2&gt; 0,9758, Type S r 2&gt; 0.9774). Pour évaluer la précision, HEK-293 et ​​nombre de cellules HeLa ont été effectuées en utilisant le Z2 Coulter, Moxi Z, et un hémocytomètre. Le coefficient moyen de variation (CV, n = 19) des numérations cellulaires en utilisant le Z Moxi (Type M cassette), Coulter Z2 et un hémocytomètre ont été calculés avec CV est mesurée à partir de 5 chefs d&#39;accusation distincts dans les cellules 200.000-300.000 / Gamme ml. La petite moyenne CV (Figure 4) de la Z Moxi est comparable à celle de la Z2 et est représentatif du niveau élevé de précision ne peut être atteinte avec Coulter technologies basées sur de comptage. Dimensionnement de précision de l&#39;instrument Moxi Z a été évaluée par la mesure suivante de perles achetées de précision, de polystyrène calibrées. Moyennes des mesures de taille de particules (n = 5) de Moxi Z ont été tracées selon des tailles de fabricant signalés. Comme on le voit in Figure 5, les mesures Moxi Z s&#39;accompagnent pas les valeurs du fabricant avec une forte corrélation linéaire (r 2 = 0,9989). Au-delà de la taille et les informations de comptage, Moxi Z fournit un réactif-libre, l&#39;évaluation générale de la santé de culture cellulaire de mammifère avec un indice de viabilité Moxi rapporté (MVI) de valeur. Cet indice est généré à partir d&#39;un rapport entre le nombre de cellules dans la population d&#39;intérêt par rapport aux chiffres de particules totales. Pour démontrer les capacités de mesure MVI, lectures MVI (Type M cassette) ont été comparés au manuel standard et de cytométrie en flux techniques de mesure en direct / mort. Les populations de morts (&lt;10% de viabilité) HEK-293 et ​​les cellules HeLa ont été créées par des incubations nuit des cellules vivantes dans un fluorure de nutriments sans sodium, contenant un diluant (Isoton II, Beckman Coulter) à 37 ° C. Contrôlés les niveaux de viabilité théoriques ont été préparés par mélange ratiometrically des concentrations connues de cellules vivantes et mortes. Ressolutions ulting ont été analysés pour les niveaux de viabilité, en double exemplaire avec les chiffres et les mesures hémocytomètre deux cytomètre en flux. Mesures ont été faites hémocytomètre en utilisant une traditionnelle mélange 50/50 de 0,1% Solution bleu trypan et les cellules. Mesures de cytométrie de flux ont été faites en utilisant un cytomètre Goyave PCA (Merck) en utilisant le réactif Viacount et le fabricant spécifié par le protocole (Merck). Comme le montre la figure 6, les valeurs de coefficient de corrélation de Pearson (r 2) &quot;de l&#39;ajustement linéaire des données à MVI analogues pourcentages de viabilité hémocytomètre pour&quot; cellules HEK et cellules HeLa ont été r 2 = 0,9937 et r 2 = 0,9728, respectivement. Ces résultats démontrent que cette approche fournit des informations de santé de la culture dans une large gamme de viabilités cellulaires qui se comparent favorablement aux mesures Live / Dead obtenus en utilisant un cytomètre en flux ou hémocytomètre. Tableaux et figures (De Dittami et al, 2011.) 15: Figure 1. Thin-film de comptage Coulter: Le courant électrique est passé à travers la zone de cellule de détection de la cassette à film mince. Comme les cellules circuler seul fichier par l&#39;intermédiaire du CSZ, les augmentations momentanées de tension sont mesurés par le Z. Moxi <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3842/3842fig2.jpg" /> Figure 2. Moxi chiffres Z sont comparables à Coulter Z2 chiffres. Chiffres identiques de suspensions cellulaires et de talon ont été comptées en utilisant à la fois un Z2 Coulter et l&#39;Z. Moxi Averaged valeurs de comptage (n = 3-4) des chiffres Z Moxi ont été tracées par rapport à la Coulter Z2 correspondant comtes et des valeurs r 2 de l&#39;ajustement linéaire ont été déterminés. A) de type M cassette - gamme de concentration de 0 - 500.000 cellules par ml. B) la cassette de type S - gamme de concentration de 0 - 2-2.5e 6 / Bars ml.Error indiquent ± 1 écart-type. Figure 3. Mesures de concentration Moxi Z vs concentrations cellulaires théoriques. A) de type M cassette - des valeurs de concentration théoriques ont été préparés à partir de dilutions en série d&#39;un 500.000 initiales cellules par ml d&#39;échantillon B) de cassettes de type S -. Valeurs de concentration théoriques ont été préparés à partir de dilutions en série d&#39;une initiale 2 - 2.5e 6 cellules / ml d&#39;échantillon. Barres d&#39;erreur indiquent ± écart-type 1. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3842/3842fig4.jpg" /> Figure 4. Coefficient de variation pour le Z2 Coulter, Moxi Z (Type M cassette), et hémocytomètre. Le coefficient moyen de variation (CV, n = 19) de cellules HEK-293 et nombre de cellules HeLa pour chaque approche ont été calculés avec CV mesurées à partir de 5 séparés chefs d&#39;accusation de HEK-293 et ​​les cellules HeLa dans le 200.000 - 300.000 cellules par ml. gamme Barres d&#39;erreur indiquent ± écart-type 1. Figure 5. Précision des mesures de taille de particules en utilisant Moxi Z-Z Moxi mesurée taille des billes (Type M cassette) vs fabricant indique la taille du cordon. Barres d&#39;erreur indiquent ± écart-type 1. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/3842/3842fig6.jpg" /> Figure 6. Évaluation de la santé de la culture à l&#39;aide MVI - Comparaison des mesures de MVI (Type M cassette) et Goyave PCA Viacount viabilité par rapport visuels, trypan bleu compte de la viabilité colorées à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre.

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</ol>

Gregory M. Dittami et SE Ayliffe sont des employés de Technologies Orflo, la société qui a conçu, fabrique et vend le Moxi Z. Richard D. Rabbitt fournit à temps partiel, de l&#39;expertise de conseil versés aux technologies de l&#39;Orflo. La production et l&#39;accès gratuit à cet article est sponsorisé par Technologies Orflo.

La mise en œuvre de l&#39;approche sous-jacente Coulter peut être très déterministe de la précision globale des mesures. Une zone critique est la correction des numérations cellulaires premières pour «coïncidence» des événements où deux ou plusieurs cellules en même temps passer à travers l&#39;ouverture et sont évalués comme un seul événement électrique. «Les événements de coïncidence&quot; contribuer à l&#39;erreur qui varie en fonction d&#39;un certain nombre de facteurs, y compris la taille des cellules et le degré de regroupement (Davis et al 1967) 6. En conséquence, la correction de coïncidence requise pour un échantillon donné ne peut être prédit, variant considérablement entre les cellules / particules types et même entre les différentes cultures de types de cellules identiques. Créée théorie, ancrée dans les publications initiales par Coulter, consiste à appliquer un ajustement logarithmique des données brutes sur la base du nombre d&#39;événements observés et empiriquement déterminée, le facteur de correction de particules spécifique, z. Bien que des chiffres exacts peuvent être correctement réalisé avec tson algorithme de correction, il est limité dans son application pratique en raison des grandes variations de valeurs de z entre les types de cellules et de la difficulté de prévoir avec exactitude correspondant à sa valeur. Ici, en utilisant le nombre &quot;vrai&quot; cellule identifiée par le raccord Moxi courbe Z en conjonction avec l&#39;algorithme de correction de coïncidence, le Z Moxi corrige de façon dynamique pour une coïncidence pour obtenir les concentrations réelles. Lorsque comparés aux résultats obtenus à l&#39;aide de haut de gamme Coulter Z2, Z Moxi produit compte comparables à travers une gamme de concentration de 0 à 500.000 cellules / ml (de type M cassette) et 3000 - 2-2.5e 6 cellules / ml (cassette de type S) . En outre, le Z Moxi atteint cette précision de comptage avec un coefficient similaire faible variation dans le nombre et la précision dans granulométrie qui est caractéristique de l&#39;étalon-or, Coulter-technique dans le comptage des cellules. En outre, les données présentées ici indiquent que le Z Moxi peut fournir de précieuses informationsen ce qui concerne la santé globale des cultures cellulaires. Le Z Moxi s&#39;appuie sur l&#39;approche d&#39;ajustement de courbe avec un algorithme de logiciel propriétaire pour déterminer ce bilan de santé de la culture. Les modifications morphologiques associées à la mort cellulaire, tels que blebbing, se décomposer, et les distorsions volumétriques (Kataoka et Tsuruo 1996, Liegler et al 1995, Sheridan et al 1981) 12-14, permettent à l&#39;Moxi-Z à distinguer les différences entre les impédimétriques vivent les populations et les morts cellulaires / débris des populations. Le MVI est généré par l&#39;analyse de la distribution de la taille de la culture / particules pour identifier les contributions relatives des débris de particules, rétrécis cellules nécrotiques, et la courbe ajustée-population de cellules d&#39;intérêt. La valeur MVI reflète donc un indice de population ou d&#39;une mesure ratiométrique des chiffres de population monodisperses en ce qui concerne le profil de la population globale des particules. Cette valeur est alors algorithmiquement-ajustées des statistiques basées sur la population et des observations empiriques. Because de la MVI regarde d&#39;autres paramètres que les approches traditionnelles de coloration, on ne s&#39;attend pas à refléter ces techniques, mais fournit plutôt un autre point de vue précieux sur la santé d&#39;une culture cellulaire, en particulier en ce qui concerne les débris et les contaminants microbiens. En résumé, le compteur de cellules Moxi-Z est un instrument de paillasse ultra léger qui fournit des analyses précises, reproductibles de comptage des cellules, la taille des cellules, et la santé des cellules en utilisant le principe de Coulter et des algorithmes logiciels d&#39;ajustement de courbe combinée avec une technologie de capteur à couche mince brevetée . Avec la cassette de type M, il est capable de compter des particules allant de 4 à 25 microns de diamètre (plage dynamique de 2 - 34 microns), en 8 secondes. Avec cassette du type S, il est capable de compter des particules allant de 3 à 20 microns de diamètre (plage dynamique de 2 - 26 microns), en 15 secondes. En outre, le Moxi-Z effectue des évaluations de santé, sans l&#39;utilisation de réactifs. C&#39;est intégration du travail beaucoup moinsnsive et subjective que le comptage manuel. En comparaison à la norme Coulter comptage, le Moxi est plus rapide, beaucoup plus petite, fournit de plus amples renseignements, nécessite un entretien beaucoup moins, c&#39;est plus facile à utiliser, et est une fraction du coût.

<table border="1" ><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> ORFLO diluant </td><td> ORFLO </td><td> MXA006 </td><td></td></tr><tr><td> Distributeur Cassette </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Stocke jusqu&#39;à 25 cassettes pour pratique de distribution </td></tr><tr><td> Câble USB </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Connecte instrument pour PC / Mac ou d&#39;un adaptateur </td></tr><tr><td> Adaptateur secteur (modèles américains et européens seulement) </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Connecte le câble USB à une prise secteur </td></tr><tr><td> USB Flash Drive </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Magasins Moxi le logiciel Z et mode d&#39;emploi </td></tr><tr><td> Perles Vérifier l&#39;étalonnage </td><td> ORFLO </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cassette d&#39;étalonnage électronique </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Cassette électronique pour vérifier le fonctionnement correct du système et d&#39;étalonnage </td></tr></tbody></table>

détermination du nombre de cellules de mammifères, taille des cellules et la santé des cellules à l&#39;aide du moxi mini z compteur de cellules automatisé

Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Le dénombrement de particules et de cellules est utilisé dans diverses applications, notamment la culture cellulaire de routine, l'analyse hématologique et les contrôles industriels1-5. Une avancée décisive dans les technologies de dénombrement de cellules/particules a été le développement de la technique Coulter par Wallace Coulter il y a plus de 50 ans. Cette méthode repose sur l'application d'un champ électrique à travers un orifice de taille micrométrique et le confinement hydrodynamique de particules uniques à travers cet orifice. L'obstruction provoquée par les particules dans l'orifice entraîne une variation mesurable de l'impédance électrique, directement et précisément corrélée à la taille/au volume des cellules. L'adoption de cette méthode comme référence dans le dénombrement de cellules/particules découle de la précision et de l'exactitude exceptionnelles qu'elle assure dans la mesure de la taille et du nombre de particules, particulièrement en comparaison avec les méthodes manuelles et les technologies basées sur l'imagerie (précision de l'ordre de 98 % pour les compteurs Coulter contre 75 à 80 % pour les systèmes manuels ou basés sur la vision). Ce résultat s'explique par le fait que, contrairement aux approches fondées sur l'imagerie, la technique Coulter réalise une mesure véritablement tridimensionnelle (3D) des cellules/particules, réduisant ainsi fortement les interférences dues aux débris et à l'agrégation en calculant des informations volumétriques précises sur les cellules/particules. Dans l'ensemble, cette méthode permet de compter et de dimensionner les cellules de façon plus exacte, moins fastidieuse, moins chronophage et moins subjective que les autres techniques de dénombrement6.
Malgré l'importance de la technique de Coulter dans le comptage cellulaire, son utilisation généralisée dans les études biologiques courantes a été limitée en raison du coût et des dimensions des instruments traditionnels. Bien qu'un instrument fondé sur la méthode de Coulter et moins coûteux ait été mis au point, il présente des limitations par rapport à ses homologues plus chers en ce qui concerne la correction des « événements de coïncidence », lors desquels deux cellules ou plus traversent simultanément l'orifice et sont mesurées en même temps. Une autre limitation des technologies de Coulter existantes est l'absence de paramètres permettant d'évaluer l'état général de santé des échantillons cellulaires. Par conséquent, des techniques supplémentaires doivent souvent être utilisées en complément du comptage par méthode de Coulter afin d'évaluer la viabilité cellulaire. Cela allonge le temps de configuration expérimentale et augmente les coûts, car les méthodes traditionnelles d'évaluation de la viabilité nécessitent la coloration des cellules et/ou l'utilisation d'équipements coûteux et encombrants, tels qu'un cytomètre en flux.
Le compteur cellulaire automatisé Moxi Z mini, décrit ici, est un instrument de table ultra-compact qui associe la précision du principe de Coulter à une technologie de capteur à couche mince afin de permettre un comptage et un dimensionnement précis des particules comprises entre 3 et 25 micromètres, selon la cassette de comptage utilisée. La cassette de type M peut être utilisée pour compter des particules dont le diamètre moyen varie de 4 à 25 micromètres (plage dynamique de 2 à 34 micromètres), et la cassette de type S peut être utilisée pour compter des particules dont le diamètre moyen varie de 3 à 20 micromètres (plage dynamique de 2 à 26 micromètres). Étant donné que le système utilise une méthode de mesure volumétrique, la plage de 4 à 25 micromètres correspond à une gamme de volume cellulaire de 34 à 8 180 fL, et la plage de 3 à 20 micromètres correspond à une gamme de volume cellulaire de 14 à 4 200 fL, ce qui est pertinent lors de la mesure de particules non sphériques. Pour effectuer un comptage de cellules de mammifères à l’aide du Moxi Z, les cellules à compter sont d’abord diluées avec ORFLO ou un diluant similaire. Une cassette de comptage cellulaire est insérée dans l’appareil, puis l’échantillon est chargé dans l’orifice de la cassette. Des milliers de cellules sont aspirées, en file indienne, à travers une « zone de détection cellulaire » (CSZ) dans la membrane à couche mince en 8 à 15 secondes. À l’issue de l’analyse, l’appareil utilise un ajustement de courbe propriétaire conjointement à un algorithme logiciel propriétaire pour effectuer une correction des événements de coïncidence, ainsi qu’une évaluation de l’état général de la culture en déterminant le rapport entre le nombre de cellules dans la population d’intérêt et le nombre total de particules. Les décomptes totaux de particules incluent les cellules mortes rétractées et désintégrées, ainsi que d’autres débris et contaminants. Les résultats sont présentés sous forme d’histogramme avec un ajustement automatique de la courbe, et des seuils pouvant être ajustés manuellement selon les besoins.
En fin de compte, le Moxi Z permet un comptage avec une précision et une exactitude comparables à celles du Coulter Z2, considéré actuellement comme la référence, tout en fournissant des informations supplémentaires sur la santé des cultures. En outre, il atteint ces résultats plus rapidement, avec un encombrement réduit, une manipulation et une maintenance nettement plus simples, et à une fraction du coût des technologies comparables.

Le Moxi Z miniature compteur de cellules automatisé est un nouvel instrument qui combine le principe Coulter avec la technologie brevetée du capteur à couche mince et d&#39;un algorithme logiciel propriétaire pour effectuer le calibrage et le comptage d&#39;une gamme de taille large de particules ainsi que pour déterminer la santé globale de monodisperse cultures de cellules de mammifères. Ce protocole décrit l&#39;utilisation de cet instrument pour le comptage et l&#39;évaluation de la santé des cultures cellulaires.

Détermination du nombre de cellules de mammifères, taille des cellules et la santé des cellules à l&#39;aide du Moxi Mini Z Compteur de cellules automatisé

Le comptage de particules et de cellules est utilisé pour diverses applications, notamment la culture cellulaire de routine, l'analyse hématologique et les contrôles industriels1-5. Un ...

Le compteur cellulaire automatisé Mxi Z Mini est un instrument de table ultra-compact qui effectue des décomptes très précis de cellules et de particules. En combinant le principe TER, considéré comme la méthode de référence, avec une technologie brevetée de capteur en film mince. Les cassettes utilisées avec le Mxi Z sont des capteurs microfluidiques de précision permettant d'obtenir des décomptes cellulaires.Une cassette est insérée à l'avant de l'appareil et 75 microlitres d'échantillon sont chargés dans le port d'échantillonnage. Lorsque l'analyse commence, les cellules sont aspirées en file indienne à travers une zone de détection cellulaire située dans la membrane en film mince de la cassette, des milliers de cellules par échantillon étant comptabilisées tandis qu'elles traversent la zone de détection. Le volume précis de chacune est déterminé par une mesure d'impédance.Après huit secondes, la concentration cellulaire, la taille moyenne des cellules et l'indice de viabilité cellulaire sont affichés, accompagnés d'un histogramme complet à haute résolution de l'ensemble de la population de particules. Les données de l'échantillon peuvent ensuite être analysées et stockées directement sur l'appareil ou transférées vers un Mac ou un PC via Bluetooth ou USB. Le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres systèmes tels que les hémocytomètres ou les compteurs cellulaires automatisés basés sur l'image est qu'elle est nettement plus fiable, avec une exactitude et une précision supérieures à 95 %, contre 75 à 80 % pour les systèmes basés sur l'image.En outre, il mesure la taille des cellules, est beaucoup plus rapide et n'est pas sujet à interprétation. Bien que cette méthode soit idéale pour le comptage d'un million de cellules, elle peut être appliquée à un large éventail d'applications de comptage cellulaire en raison de son étendue dynamique élevée.Ces applications incluent le dénombrement des globules blancs, des globules rouges, des protozoaires, des algues et des levures. Commencez cette expérience en diluant une suspension fraîchement prélevée de cellules HEK 293 dans un milieu ayant une conductivité physiologique, comme le diluant pour flux ou le PBS, jusqu'à la concentration appropriée. Triturez doucement afin de minimiser l'agrégation cellulaire et assurez-vous que l'appareil est débranché de l'alimentation électrique.Ensuite, allumez le mxi Z en appuyant sur le bouton d'alimentation ; l'écran d'accueil s'affichera. Le mxi Z utilise des cassettes jetables de type M ou S, qui sont des capteurs microfluidiques de précision. Chaque cassette possède deux ports de chargement indiqués par une forme ovale bleue et marqués un ou deux.Chaque cassette peut être utilisée pour deux tests. Les cassettes de type M ont une plage de fonctionnement de 3000 à 500 000 cellules par millilitre. La plage pour les cassettes de type S est de 3000 à 2,5 millions de cellules par millilitre.Appuyez fermement sur le plateau et insérez une cassette pour assurer l'homogénéité de l'échantillon en l'inversant lentement plusieurs fois. Ensuite, prélevez 75 microlitres d'échantillon. Insérez fermement la pointe de la pipette dans le port d'échantillonnage, en tenant la pipette à un angle de 45 degrés, puis délivrez l'échantillon dans le port d'une seule pression fluide, en veillant à ce que tout l'échantillon ait été expulsé.Appuyez sur l'écran dans le cercle désigné ou n'importe où sauf dans la zone du mode de petites particules pour commencer le comptage. Le mxi Z lancera le test et les résultats du comptage cellulaire seront disponibles en huit secondes. Avec la cassette Type M, les résultats sont automatiquement affichés à l’aide d’un algorithme propriétaire d’ajustement de courbe qui ajuste la population cellulaire unique d’intérêt et corrige également le comptage total pour la coïncidence.Événements ou cas où plusieurs particules ou agrégats traversent simultanément la zone de détection de la cellule. Notez que, bien que ces événements de coïncidence se situent en dehors de la zone d'ajustement de la courbe à droite, ils sont néanmoins inclus dans le nombre total de décomptes. Une fois un ajustement approprié trouvé, un histogramme haute résolution de l'ensemble de la population échantillonnée est affiché, accompagné des valeurs numériques de la concentration cellulaire, du diamètre moyen et du volume moyen.En outre, un indice de population Moxie ou valeur MPI est fourni comme indicateur de la santé générale de la culture. Les valeurs situées à l'extrême gauche de l'histogramme sont normales et représentent le seuil de bruit de fond du système, ajusté afin d'optimiser la sensibilité du système ainsi que les comptages éventuels de débris présents dans l'échantillon. Une fois l'analyse de l'échantillon terminée, retirez la cassette de l'appareil, sélectionnez « Terminé » pour enregistrer les données, puis revenez à l'écran d'accueil.Un indicateur visuel confirme que l'échantillon a été analysé. Si un second échantillon doit être analysé, retournez la cassette et insérez-la dans l'appareil. Après une analyse en mode normal, les résultats sont affichés selon un ajustement de courbe sur une échelle de taille de quatre à 34 micromètres pour la cassette de type M ou de trois à 26 micromètres pour la cassette de type S. Pour recentrer l'axe des x entre quatre et 26 micromètres, appuyez sur l'icône de redimensionnement.Appuyez successivement sur l'icône de redimensionnement pour modifier l'échelle de l'axe des x selon les échelles suivantes : de quatre à 18 micromètres, de quatre à 10 micromètres, puis de nouveau de quatre à 34 micromètres. Revenez en mode d'ajustement de courbe si désiré. Le numéro du test pour l'analyse en cours est affiché en haut de l'histogramme dans une boîte verte.Les données seront enregistrées selon le numéro du test. Appuyez sur l'icône de délimitation pour activer ou désactiver le mode de délimitation, ce qui permet la délimitation manuelle de l'histogramme. Ceci fait de la délimitation le mode d'acquisition par défaut. Les délimitations peuvent être modifiées en faisant glisser les marqueurs bleus de délimitation gauche et droit ou en touchant l'un des marqueurs, puis en les déplaçant progressivement à l'aide des touches fléchées qui apparaissent.Les valeurs de comptage affichées et les informations moyennes de dimensionnement sont calculées uniquement à partir des particules comprises dans la plage de sélection. Appuyez sur l'icône de validation pour enregistrer les résultats et revenir à l'écran d'accueil. Pour ouvrir un test enregistré, appuyez sur l'icône d'histogramme située sur l'écran d'accueil.Des icônes pour jusqu'à neuf histogrammes enregistrés seront affichées simultanément ; appuyez sur la flèche vers le bas ou vers le haut, ou faites glisser vers le haut ou vers le bas pour afficher d'autres pages. Consultez d'autres résultats de tests au besoin et sélectionnez l'icône du test souhaité. Chaque histogramme s'ouvrira soit en mode d'ajustement de courbe, soit en mode avec fenêtrage.En fonction de la manière dont il a été enregistré, le type de cassette utilisé pour le test, soit M soit S, sera indiqué en haut à gauche de l'écran. Enregistré. Les histogrammes peuvent également être basculés entre les modes de sélection et d'ajustement de courbe ; pour sélectionner automatiquement le pic souhaité, touchez-le. Ceci définit les positions optimales de sélection pour le pic sélectionné.Cela est particulièrement utile dans les situations à pics multiples. Pour indiquer un pic d'intérêt, appuyez sur les icônes de flèches de zoom et de dézoom pour ajuster l'échelle de comptage sur l'axe Y de l'histogramme. L'échelle verticale peut également être modifiée en faisant glisser un doigt vers le haut sur le pic pour diminuer ou vers le bas pour augmenter. Appuyez sur l'icône retour pour fermer ce test et revenir à l'écran d'accueil.Les données peuvent être transférées vers un Mac ou un PC à l'aide de l'application moxie chart. Pour ce faire, appuyez d'abord sur l'icône Bluetooth de l'écran d'accueil de l'unité Moxie Z. L'unité affichera son identifiant Bluetooth sur l'ordinateur ; ouvrez l'application moxie chart, puis cliquez sur l'icône Bluetooth située dans le coin supérieur droit.Ensuite, choisissez l'appareil correspondant à l'identifiant Bluetooth du Z et le dossier de destination sélectionné pour les fichiers téléchargés, en plus du Bluetooth. Une autre méthode pour transférer des données du Mxi Z vers un ordinateur consiste à utiliser un câble USB et à traiter l'appareil comme un périphérique USB ordinaire. Avec les fichiers de données, les fichiers provenant d'une unité Mxi Z connectée via USB peuvent être copiés dans n'importe quel répertoire de l'ordinateur.Les fichiers peuvent être ouverts et analysés directement avec l'application Mxi Charles ou, étant donné qu'il s'agit de fichiers au format CSV, ils peuvent être ouverts directement dans Microsoft Excel ou d'autres programmes d'analyse de données afin que l'utilisateur puisse comparer les résultats du comptage effectué avec le Mxi Z à ceux obtenus. À l'aide d'un outil de comptage, des suspensions identiques de billes étalonnées de précision et de cellules de mammifères ont été comptées par les deux méthodes. Quatre tailles différentes de billes, allant de six à 15,6 microns de diamètre, ainsi que plusieurs lignées cellulaires différentes, ont été testées.La moyenne de trois à quatre comptages a été tracée, comme on peut le voir ici. Les valeurs obtenues étaient presque identiques, ce qui indique que le Moxie Z est capable d'obtenir des comptages précis sur une large gamme de tailles, démontrant ainsi l'étendue des concentrations pouvant être évaluées avec précision à l'aide du Mxi Z. Les mêmes billes et cellules ont été diluées en série à partir d'une concentration initiale de 500 000 cellules par millilitre pour la cassette de type M ou d'environ 2,5 million de cellules par millilitre pour la cassette de type S. Les concentrations cellulaires théoriques ont ensuite été tracées en fonction des comptages obtenus, comme indiqué ici. Les concentrations mesurées correspondaient aux concentrations cellulaires théoriques, démontrant un comptage précis sur toute la plage dynamique de chaque cassette : de 3 000 à 500 000 cellules par millilitre pour les cassettes de type M et de 3 000 à 2,5 millions de cellules par millilitre pour les cassettes de type S. Afin d'examiner la variabilité des résultats obtenus, cinq comptages distincts de cellules HEK 293 et de cellules HELOC, dans la gamme de 200 000 à 300 000 cellules par millilitre, ont été réalisés à l'aide d'un Callas Z deux, d'un Moxi Z et d'un hémocytomètre.Comme on peut le voir sur ce graphique, le coefficient de variation moyen était comparable entre le Z two et le mxi Z, et nettement inférieur à celui du hémocytomètre, ce qui indique que la reproductibilité du Mxi Z est comparable à celle du call to Z two et supérieure à celle du hémocytomètre. Afin de démontrer la précision du Mxi Z dans la détermination de la taille des particules, des billes fabriquées ont été mesurées à l’aide du Mxi Z. Cinq mesures pour chaque taille de bille ont été effectuées, puis moyennées et tracées en fonction de la taille de bille indiquée par le fabricant. Le Mxi Z a mesuré les billes à la taille indiquée par le fabricant.La valeur de R carré était de 0,9989, démontrant ainsi la capacité du Mxi Z à évaluer la culture. Les mesures de l'indice de santé cellulaire ont été enregistrées à l'aide du Mxi Z pour des préparations identiques de cellules mortes ajoutées, de cellules HEK et de cellules HeLa, puis comparées aux résultats visuels d'exclusion du bleu de trypan pour le pourcentage de viabilité des mêmes échantillons, ou au cytomètre en flux Guava PCA, à des fins de comparaison. Les mesures de viabilité des échantillons ont également été représentées sur le graphique, comme on peut le voir ici.La viabilité calculée pour les cellules HGK et LAR obtenue à l’aide du Mxi Z était comparable aux mesures de viabilité obtenues par la méthode d’exclusion au bleu de Trian, avec des valeurs de r carré de 0,9937 et 0,9728 respectivement. Les données obtenues sont également comparables à celles obtenues à l’aide du guava PCA avec le cytomètre en flux, avec des valeurs de R carré de 0,9724 pour les cellules EK et de 0,9585 pour les cellules hela. Bien que dans certains cas l’indice de santé cellulaire puisse concorder avec les approches classiques de viabilité, il s’agit d’une technique entièrement nouvelle et différente d’évaluation de la santé, qui par conséquent ne correspond pas toujours exactement aux techniques plus anciennes.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment obtenir facilement des informations sur la santé cellulaire, la taille des cellules et le nombre de cellules lors de la réalisation de cette procédure. Il est important de s'assurer que la densité cellulaire se situe dans la plage appropriée.

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Détermination du nombre de cellules de mammifères, taille des cellules et la santé des cellules à laide du Moxi Mini Z Compteur de cellules automatisé (Vidéo) | JoVE Journal

Détermination du nombre de cellules de mammifères, taille des cellules et la santé des cellules à l'aide du Moxi Mini Z Compteur de cellules automatisé

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