Visualisation des propriocepteurs dans Drosophila et pupes

L’objectif global de cette procédure est de visualiser les organes cortones proprioceptifs chez les larves et la puby de la drosophile. Ceci est accompli en élevant d’abord et en récoltant le troisième chez les larves étoilées ou puby après la dissection des larves ou pupi. Ils sont fixés pour l’immuno-marquage.

Ensuite, les larves fixes ou pupi sont immuno-colorées avec les anticorps appropriés. La dernière étape consiste à monter les échantillons colorés pour la microscopie. En fin de compte, la microscopie confocale est utilisée pour visualiser les organes cortones.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur le développement post-symbionique et la structuration des récepteurs prop chez oph. Bien que cette procédure puisse donner un aperçu du développement des récepteurs prop, elle peut également être appliquée à d’autres organes tels que d’autres types d’organes sensoriels et de tendons. Tout d’abord, rassemblez les outils nécessaires, les solutions et une fiole d’errance.

Troisièmement, chez les larves étoilées, gardez les solutions PBS et FIXATIVE sur la glace. Retirez une troisième larve étoile errante de la paroi du flacon et placez-la dans une goutte de 50 microlitres de PBS glacé sur une plaque de dissection en élastomère de cigare dans une boîte de culture tissulaire. À l’aide d’un microscope à dissection, maintient les larves, côté dorsal vers le haut, près de la bouche, crochete avec une pince fine et enfonce une épingle à insecte dans le cerveau.

Saisissez l’extrémité postérieure des larves à l’aide de la pince. Tirez doucement et étirez doucement les larves dans le sens de la longueur. Collez une autre épingle à insectes entre les deux sphères postérieures à l’aide de ciseaux à ressort.

Découpez deux incisions horizontales dans la paroi du corps perpendiculairement à l’axe antérieur postérieur, en restant près des broches antérieure et postérieure. Ensuite, coupez la paroi du corps larvaire le long de la ligne médiane dorsale, de l’incision antérieure à l’incision postérieure. Retirez les organes internes et la trachée à l’aide d’une pince fine.

Ensuite, lavez doucement une ou deux fois avec du PBS. Saisissez les deux rabats de la paroi du corps avec une pince. Étirez-les et épinglez-les à l’assiette à l’aide de deux épingles à insectes de chaque côté.

Retirez le PBS et ajoutez 50 microlitres de solution fixatrice. Incuber pendant 20 minutes à température ambiante. Après avoir retiré le fixateur et lavé deux fois avec du PBS, retirez les épingles à insectes à l’aide de ciseaux à ressort.

Coupez la tête et la queue de la larve en laissant un filet rectangulaire. Transférez le tissu fixé dans un tube einor réfrigéré avec du PBS. Une fois qu’un nombre suffisant de larves est fixé, on peut passer directement à la coloration par anticorps.

Si une coloration immédiate n’est pas souhaitée, les larves fixées doivent être lavées trois fois toutes les cinq minutes chacune avec de l’éthanol à 95 %, puis stockées dans l’éthanol à moins 20 degrés. Occupez-vous des flacons comme pour la fixation des larves jusqu’à ce que les larves du troisième stade commencent à manger. Examinez les flacons toutes les heures et marquez les larves qui ont mangé.

Laissez le pube marqué se développer pendant 30 à 40 heures à 24 degrés Celsius, ou 24 à 27 heures à 29 degrés Celsius à l’aide d’une pince fine. Choisissez 20 à 30 pube de l’âge approprié et mettez-les dans un plat de dissection multi-puits en porcelaine foncée. Attention à ne pas endommager les tissus d’intérêt.

Ensuite, extrayez les pupi de leurs pupilles. Commencez par décoller l’opercule et continuez jusqu’à ce que la chrysalide soit libre. Extrayez tous les pupi et mettez-les dans un puits rempli de PBT.

Placez cinq puy sur une surface plane entre les puits du plat de dissection à l’aide d’un couteau de micro-dissection. Coupez le bout de la tête et l’extrémité postérieure de l’abdomen. Maintenez la chrysalide en place à l’aide d’une pince fine et utilisez une seringue d’un millilitre pour laver les organes internes de la chrysalide en injectant du PBT par l’ouverture antérieure.

Lavez brièvement la chrysalide disséquée en la trempant dans un puits rempli de PBS et déplacez-la dans le fixateur froid dans un tube einor maintenu sur de la glace. Incuber le puy toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain.

Jetez le fixateur et lavez le puby avec du PBT trois fois pendant cinq minutes par lavage. Gardez le wash puby sur de la glace. Remplissez deux puits du plat de dissection avec du PBT.

À l’aide d’une pipette en polyéthylène. Transférez plusieurs puby dans l’un des puits. Ensuite, déplacez une chrysalide à la fois dans la seconde. Puits.

À l’aide de deux paires de pinces tranchantes avec des pointes parfaitement alignées, fixez la chrysalide au fond du puits, puis déchirez doucement la cuticule. L’ablation de la cuticule de l’aile est l’aspect le plus difficile de cette procédure. Nous perdons toujours une partie des ailes au cours de cette étape, c’est pourquoi nous commençons la procédure avec un nombre relativement important de nymphes.

Une fois la cuticule déchirée, décollez-la de l’aile. Faire attention de ne pas déconnecter l’aile de la nymphe. Après avoir décollé la cuticule de la lame de l’aile, continuez à décoller la cuticule de la charnière de l’aile.

Une fois que la cuticule de l’aile a été pelée, on peut essayer de décoller la cuticule de la patte de la même manière. De nombreuses jambes sont susceptibles d’être perdues dans le processus, mais malgré le faible rendement, cette étape est fortement recommandée car elle améliore considérablement la coloration des organes cortoniques des jambes. Placez la chrysalide dans un tube einor rempli de méthanol et conservez-la à température ambiante.

Continuez à décoller la cuticule de tous les puy et ajoutez-les dans le même tube pour un total d’au moins 10 puy bien pelés. Pour chaque tache, retirez le méthanol et lavez-le trois fois cinq minutes chacun avec de l’éthanol à 95 %. Le puy fixe peut être conservé pendant de longues périodes dans de l’éthanol à 95 % à moins 20 degrés avant l’immuno-coloration.

Pour monter les larves, placez une goutte de support de montage sur une lame de microscope, puis positionnez les larves avec les cuticules vers le bas et les muscles de la paroi corporelle vers le haut. Mettez une petite goutte de milieu de montage sur une lamelle propre et utilisez-la pour couvrir la préparation sans appliquer de pression sur les larves montées. Pour monter le puby.

Tout d’abord, préparez deux lames de microscope avec une goutte de support de montage, l’une pour la dissection et la seconde pour le montage. Placez plusieurs pu sur l’une des lames puis utilisez les ciseaux à ressort pour retirer la tête et la partie postérieure de l’abdomen. Ensuite, séparez la moitié dorsale du thorax de la moitié ventrale en coupant entre les ailes et les pattes.

Placez les parties du corps disséquées de la chrysalide dans la goutte de support de montage. Sur la deuxième diapositive, assurez-vous que les ailes et les pattes sont étirées et essayez de minimiser autant que possible la superposition des tissus. Enfin, placez une goutte de support de montage sur une lamelle et placez-la sur l’échantillon sans appliquer de pression excessive.

Cette micrographie confocale des organes cortoniques immuno-colorés chez un tiers chez les larves étoilées montre un segment abdominal bien étiré dans lequel sept des huit organes cortoniques sont clairement visibles. Les cinq organes latéraux qui forment ensemble l’organe lipidique du pénis, un seul organe latéral et l’un des deux organes cortoniques ventraux sont évidents. Les neurones de l’organe cortone sont marqués avec le marqueur neuronal, un anticorps monoclonal 22 C 10, et représentés en rouge.

La coiffe ligamentaire et les cellules d’attache sont étiquetées avec Antifa tubulin 85 E et sont indiquées en bleu. Les cellules de la coiffe et du ligament sont en outre marquées avec un organe cortitonal. Rapporteur GFP spécifique abritant un élément régulateur pour le locus de Dalila.

Ici, les organes tonaux corti de l’aile au niveau de la veine radiale ventrale sont montrés dans cette micrographie confocale d’une nymphe âgée de 35 heures. Les neurones sont marqués par le marqueur neuronal 22 C 10, et représentés en rouge et dans le panneau B. Les cellules du ligament et de la coiffe sont co-marquées avec des anticorps antifa tubuline 85 E représentés en bleu et dans le panneau C, ainsi qu’un organe cortitonal. Transgène rapporteur GFP spécifique indiqué en vert.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de visualiser les organes cortones proprioceptifs chez les larves et les nymphes chez l’oph. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler qu’elle a été optimisée pour l’utilisation des anticorps décrits. Différents anticorps peuvent nécessiter des conditions de fixation et de coloration légèrement différentes.

Ainsi, lors de l’utilisation de cette procédure avec différents anticorps, il faut trouver les conditions optimales pour les anticorps utilisés.