Name: Visualisation des propriocepteurs dans Drosophila et pupes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Apprenez à visualiser les organes chordotonaux proprioceptifs chez Drosophila melanogaster par immunomarquage et microscopie confocale. Cette méthode permet d'étudier le développement des organes sensoriels.

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Les auteurs tiennent à remercier le développement des études d&#39;hybridome de la Banque à l&#39;Université de l&#39;Iowa pour nous envoyer des anticorps. Ce travail a été soutenu par une subvention (n ° 29/08) de la Fondation des sciences d&#39;Israël. AS est également soutenue par une subvention de recherche de la DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft).

Avant de commencer <ol><li> Cultiver les cultures mouche souhaités. Conserver les flacons désertes (environ 30 mouches par flacon de 50 ml). Laissez les mouches pondent leurs œufs pour une seule journée dans chaque flacon. Cela permettra l&#39;approvisionnement alimentaire suffisant et les larves de leur permettre d&#39;atteindre une taille maximale avant de ramper hors de la nourriture. Conserver les flacons dans la température appropriée jusqu&#39;au troisième stade larvaire commence à errer sur la paroi du flacon. </li><li> Préparer une pâte fraîche de tampon phosphate salin (PBS) et PBT (0,1% de Tween dans du PBS). Gardez 10 ml de PBS sur la glace. </li><li> Préparer 1-5 ml de fixateur frais (formaldéhyde 4% en PBT) et le garder sur la glace. Nous utilisons en bouteille 37-38% de formaldéhyde comme une solution stock. </li></ol> 1. Dissection et la fixation des larves du troisième <ol><li> Choisissez une errance larve du troisième stade larvaire de la paroi du flacon et le placer dans une chute de 50 ul de PBS glacé sur une plaque de dissection Sylgard (en Sylgard 184 kit élastomère de silicone, Dow Corning Corporation dans untissus boîte de culture). </li><li> Tenez la larve, la face dorsale en place, à proximité des crochets buccaux, à l&#39;aide de pinces fines (Dumont # 5 forceps), et coller une broche d&#39;insectes (minutien, 0,1 mm, en acier inoxydable) dans le cerveau de la larve. </li><li> Prenez l&#39;extrémité postérieure de la larve avec la pince, tirez-le doucement et étirez doucement la larve de la longueur. Tenez-vous un autre axe d&#39;insectes entre les deux stigmates postérieurs. </li><li> Ressort à l&#39;aide de ciseaux couper deux incisions horizontales dans la paroi du corps (perpendiculaire à l&#39;axe antéro-postérieur), à proximité des broches antérieures et postérieures. </li><li> L&#39;aide des ciseaux à ressort couper la paroi du corps larvaire le long de la ligne médiane dorsale de la partie antérieure de l&#39;incision postérieure. </li><li> Retirer les organes internes (intestin, les glandes salivaires, tubes de Malpighi etc) et de la trachée à l&#39;aide de pinces fines. Laver doucement une ou deux fois avec du PBS. </li><li> Prenez les deux volets paroi du corps avec des pinces, les étirer et les épingler à la plaque aide de deux broches d&#39;insectes pour chaque côté. </li><li> Retirez le PBS et ajouter 50 ul d&#39;une solution de fixation (formaldéhyde à 4% en PBT). Incuber 20 minutes à température ambiante. </li><li> Retirer le fixateur. Laver deux fois avec du PBS. Tirez sur les broches d&#39;insectes. Ressort à l&#39;aide de ciseaux couper la tête et la queue des larves en laissant un filet rectangulaire. Transférer le tissu fixé à un tube Eppendorf réfrigérées avec du PBS. </li><li> Une fois un nombre suffisant de larves sont fixés, on peut continuer directement à la coloration d&#39;anticorps. Si une coloration immédiate n&#39;est pas souhaitée, les larves fixe doit être lavé par 3 fois, 5 minutes chacun, avec de l&#39;éthanol 95% et stockés dans de l&#39;éthanol à 95% à -20 ° C. </li></ol> 2. Dissection et la fixation des pupes Partie I <ol><li> Assister aux flacons que pour la fixation des larves, jusqu&#39;au troisième stade larvaire commence à pupariate. Examiner les flacons tous les larves heure et la marque qui ont pupariated. Autoriser les nymphes marquée de développer 30-40 heures à 24 ° C, ou 24-27 heures à 29 ° C. </li><li> En utilisant des pinces fines ramasser 20-30 nymphes de el&#39;âge e approprié et les mettre dans une porcelaine multi-puits plat foncé dissection. Veillez à ne pas endommager les tissus d&#39;intérêt. </li><li> Extrait les nymphes de la coque de nymphose. Commencez par décoller l&#39;opercule et continuer jusqu&#39;à ce que la nymphe est libre. Mettez la nymphe dans un puits rempli de PBT. Continuer l&#39;extraction de tous les nymphes. Étapes 2.4-2.6 devrait être fait en petits lots de cinq nymphes à la fois. </li><li> Lieu cinq nymphes sur une surface plane entre le puits de la boîte de dissection. Avec un couteau de dissection micro couper l&#39;extrémité de la tête et l&#39;extrémité postérieure de l&#39;abdomen (alternativement, il est possible d&#39;utiliser deux paires de pinces pour arracher les trous aux deux extrémités de la pupe). </li><li> Maintenez la nymphe en place à l&#39;aide de pinces fines et d&#39;utiliser une seringue de 1 ml pour laver les organes internes de la pupe, en injectant PBT à travers l&#39;ouverture antérieure. </li><li> Lavez brièvement disséqué nymphe en le plongeant dans un puits rempli de PBS et de le déplacer dans le fixateur froid dans un tube Eppendorf conservé dans la glace. </li><li> Incuber une nuit (ON) à 4 ° C. </li></ol> Partie II <ol start="8"><li> Jeter le fixateur et laver les trois nymphes fois, 5 minutes chacun, avec PBT. Gardez les nymphes lavé sur la glace. </li><li> Remplir deux puits de la boîte de dissection avec PBT. L&#39;utilisation d&#39;un polyéthylène pupes Pasteur pipette de transfert de plusieurs à l&#39;un des puits. </li><li> Se déplacer d&#39;un nymphe à la fois dans le second puits. L&#39;utilisation de deux paires de pinces pointues avec des conseils parfaitement alignés, décoller la cuticule transparente des pupes de l&#39;aile: sécuriser la nymphe au fond du puits à l&#39;aide d&#39;une paire de pince, et doucement déchirer le cuticules en utilisant la seconde paire de pinces. Une fois la cuticule est déchiré, le retirer de l&#39;aile. Veillez à ne pas déconnecter l&#39;aile de la pupe. Après avoir enlevé la cuticule de la lame aile, continuera peler la cuticule de la charnière aile (où les Chos latéraux se trouvent). </li><li> Après avoir enlevé la cuticule aile, on peut tenter décoller la cuticule jambe d&#39;une manière similaire.Beaucoup de jambes sont susceptibles d&#39;être perdus dans le processus, mais en dépit de la faible rendement, cette étape est fortement recommandé car il améliore considérablement la coloration de Chos jambes. Les Chos du haltères et de l&#39;abdomen peut être visualisée sans plus décollement de la cuticule. </li><li> Placez le «pelées» nymphe dans un tube Eppendorf rempli avec du méthanol et de garder à la température ambiante. Continuer décollement de la cuticule de tous les nymphes, et les ajouter dans le même tube. Au moins 10 pupes bien pelées doivent être collectées pour chaque coloration. </li><li> Retirez le méthanol et laver trois fois, à 5 minutes chacune, avec de l&#39;éthanol à 95%. Pupes fixe peuvent être conservés pendant de longues périodes de temps dans l&#39;éthanol 95% à -20 ° C. </li></ol> 3. Immunomarquage de larves et pupes <ol><li> Laver le tissu fixe avec PBT trois fois, à 30 minutes chacune, à température ambiante. Les larves peuvent être lavés avec agitation douce sur un plateau tournant. Les chrysalides sont lavés sans agitation. </li><li> Remplacer le PBT avec le tampon de blocage (PBT + 5% ndu sérum de chèvre ormal) et incuber SUR à 4 ° C. </li><li> Retirer le tampon de blocage et incuber avec des anticorps primaires (dilué dans un tampon de blocage) ON à 4 ° C. </li><li> Laver quatre fois avec PBT comme décrit dans l&#39;étape 3.1. </li><li> Retirez le PBT et incuber avec des anticorps secondaires (dilué dans un tampon de blocage) ON à 4 ° C. </li><li> Laver deux fois avec PBT et une fois avec du PBS comme décrit dans l&#39;étape 3.1. </li><li> Remplacer le PBS par le milieu de montage (Dako Fluorescent Mounting Medium (Dako Cytomation, Glostrup, Danemark) et incuber à 4 ° C sur ON. </li></ol> 4. Montage des larves <ol><li> Larves sont montés sur une lame de microscope dans une goutte de milieu de montage avec leur cuticule vers le bas et muscles de la paroi du corps vers le haut. Mettez une petite goutte de milieu de montage sur une lamelle propre et l&#39;utiliser pour couvrir la préparation. Ne pas appliquer de pression sur les larves monté. </li></ol> 5. Montage de pupes <ol><li> Préparer deux lames de microscopeavec une goutte de milieu de montage, un pour la dissection et la seconde pour le montage. </li><li> Mettez les pupes de plusieurs sur une des diapositives. </li><li> Ressort à l&#39;aide des ciseaux enlever la tête et la partie postérieure de l&#39;abdomen. </li><li> Séparer la moitié dorsale du thorax de la moitié ventrale en coupant entre les ailes et les jambes. </li><li> Placez les parties du corps disséqués de la nymphe sur la lame de microscope deuxième une goutte de solution de montage. Veiller à ce que les ailes et les pattes sont tendues et essayer de minimiser la superposition des tissus, autant que possible. </li><li> Déposer une goutte de milieu de montage sur une lamelle et placez-le sur l&#39;échantillon. Ne pas appliquer de pression sur l&#39;échantillon monté. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Un exemple de l&#39;immuno-tachées Chos de stade larvaire troisième montre la figure 1. Cet exemple montre un segment bien tendu abdominale dans laquelle sept des huit Chos sont clairement visibles. Les neurones sont de laboratoireELED avec MAb22C10 (1:20, obtenu de la Banque de développement des études d&#39;hybridomes à l&#39;Université de l&#39;Iowa), le plafond, les ligaments, Cap-attachement et les cellules de fixation ligamentaires sont étiquetés avec des anti-αTub85E (1:10, Klein et al,. 2010). Anticorps secondaires pour la coloration fluorescente étaient Cy3, Cy5 ou conjugué anti-mouse/rabbit (1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories). Les échantillons ont été consultés en utilisant la microscopie confocale (LSM 510, Zeiss). Un groupe de Chos aile à la veine ventrale radiale d&#39;un 35 h, âgé de pupe est montré dans la figure 2. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3846/3846fig1.jpg" /> La figure 1 (A) Représentation schématique des six types de cellules qui constituent un organe Ch. simple:. De fixation plafond (CA), le bouchon (C), scolopale (S), neurone (N), le ligament (L) et de l&#39;attachement du ligament (LA ). L&#39;organe LCh5, dans lequel cinq Chos sont regroupés, est étendu à travers le groupe de muscles latéraux transversaux (LT1-4). Le muscle longitudinal latéral (LV1), ventrales muscles longitudinaux (VL1-4) et latéral du muscle oblique (LO1) sont également illustrées. Cellules tendineuses sont illustrés sous forme de sphères brunes (tiré de Klein et al., 2010). (B) Un segment abdominal d&#39;une larve du troisième stade larvaire vu à un grossissement de 10X. Sept des huit Chos présents dans chaque segment abdominal sont évidents: cinq organes latéraux qui forment ensemble l&#39;organe pentascolopidial (LCh5), un seul organe latéral (LCh1) et l&#39;un des deux Chos ventrales (VChB). Les neurones (N) des Chos sont étiquetés avec le marqueur neuronal AcM 22C10 (rouge). Le ligament (L), bouchon (C) et les cellules de fixation (Los Angeles, CA) sont étiquetés avec des anti-αTub-85E (bleu). Les cellules de la coiffe et le ligament sont en outre marquée par un rapporteur GFP Cho-spécifique abritant un élément de régulation du locus dei (Nachman et al, données non publiées). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3846/3846fig2.jpg" /> Figure 2. </strong&gt; Les organes aile chordotonaux à la veine ventrale radiale sont vus à un grossissement de 40X. Les neurones (N) sont marqués par les 22C10 marqueurs neuronaux (Rouge, B). Le ligament (L) et le capuchon (C) les cellules sont co-marqués avec des anticorps anti-αTub85E (Bleu, C) et un Cho-spécifique du transgène rapporteur GFP (Nachman et al, données non publiées).

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<li>Matthews, K. A., Miller, D. F., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+implications+of+the+unusual+spatial+distribution+of+a+minor+alpha-tubulin+isotype+in+Drosophila%3A+a+common+thread+among+chordotonal+ligaments%2C+developing+muscle%2C+and+testis+cyst+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional implications of the unusual spatial distribution of a minor alpha-tubulin isotype in Drosophila: a common thread among chordotonal ligaments, developing muscle, and testis cyst cells.</a> Dev. Biol. 137, 171-183 (1990).</li>
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<li>Todi, S. V., Sharma, Y., Eberl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+molecular+design+of+the+Drosophila+antenna+as+a+flagellar+auditory+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Anatomical and molecular design of the Drosophila antenna as a flagellar auditory organ.</a> Microsc. Res. Tech. 63, 388-399 (2004).</li>
<li>zur Lage, P., Jarman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+of+EGFR+and+notch+signalling+in+the+reiterative+recruitment+of+Drosophila+adult+chordotonal+sense+organ+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Antagonism of EGFR and notch signalling in the reiterative recruitment of Drosophila adult chordotonal sense organ precursors.</a> Development. 126, 3149-3159 (1999).</li>
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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Le protocole décrit dans cette vidéo est un moyen de visualiser Chos proprioceptives pendant les stades larvaires et la nymphe. Les études sur la structure et le développement de Chos proprioceptifs ont été jusqu&#39;à présent essentiellement limitée aux stades embryonnaire et larvaire de disques imaginaux. Ainsi, de nombreux aspects de phases ultérieures de développement, de Chos fois les larves et les adultes, restent encore largement inconnus. Le protocole décrit, combiné avec des outils communs génétiques chez la drosophile, peut être utilisé pour identifier et étudier de nouveaux gènes et les voies qui jouent un rôle dans les étapes ultérieures du développement Chos. Ce protocole a été optimisé pour la visualisation de Cho, mais il peut être adapté pour la coloration des autres tissus, tels que les ailes des pupes 6.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif / outil </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Dumont # 5 (ou # 55) pinces, biologie pointe </td><td> FST </td><td> 11252-20 11252-10 ou (Ou une pince similaires) </td><td></td></tr><tr><td> Austerlitz broches inox insectes d&#39;acier, minutiens 0.1mm </td><td> Co Roboz instruments chirurgicaux </td><td> RS-6083-10 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 kit élastomère de silicone </td><td> Dow Corning Corporation </td><td> 240.4019862 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas ciseaux micro (droite, 7,5 cm, lame 3mm) </td><td> AS Mdeizintechnik GmbH </td><td> 11-590-00 </td><td> Ciseaux Spring Vannas avec des spécifications identiques peuvent être achetés à partir Roboz Surgical Instrument Co. </td></tr><tr><td> Agitateur orbital - Rotamax-120 </td><td&gt; Heidolph </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Dako Fluorescent Milieu de montage </td><td> Dako Cytomation, Glostrup, Danemark </td><td> DK-5302392 </td><td></td></tr><tr><td> X10 PBS formulation </td><td colspan="2"> 2 g / litre de KCl, 2 g / litre de KH 2 PO 4, 80 gr / litre NaCl, 21,7 g / litre de Na 2 O 2 HPO4.7H </td><td> La qualité de PBS est essentiel pour la réussite de ce protocole </td></tr><tr><td> PBT </td><td colspan="2"> X1 PBS + 0,1% de Tween 20 </td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation des propriocepteurs dans<em&gt; drosophila</emles larves&gt; et pupes

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

La proprioception est la capacité à détecter le mouvement ou la position des parties du corps en répondant à des stimuli qui se posent dans le corps. En drosophiles et autres insectes de la proprioception est assurée par des organes sensoriels spécialisés appelés organes chordotonaux (chos) 2. Comme beaucoup d&#39;autres organes chez la drosophile, Chos développer deux fois au cours du cycle de vie de la mouche. Tout d&#39;abord, les larves de développer Chos cours de l&#39;embryogenèse. Puis, les adultes Chos commencent à se développer dans les disques imaginaux larvaires et de continuer à différencier les cours de la métamorphose. Le développement de Chos larvaires cours de l&#39;embryogenèse a été largement étudié 10,11,13,15,16. La pièce maîtresse de chaque Cho est une unité sensorielle composée d&#39;un neurone et une cellule scolopale. L&#39;unité sensorielle est tendu entre deux types de cellules accessoires qui se fixent à travers la cuticule des cellules spécialisées de fixation épidermiques 1,9,14. Lors d&#39;un mouvement de larves de mouches, le déplacement relatif de l&#39;ecellules de fixation pidermal conduit à l&#39;étirement de l&#39;unité sensorielle et l&#39;ouverture conséquente de spécifiques transitoires récepteurs potentiels vanilloïdes (TRPV) canaux à le segment externe de l&#39;8,12 dendrite. Le signal provoqué est ensuite transférée vers le circuit générateur de motif centrale locomotrice dans le système nerveux central. Chos multiples ont été décrits chez la mouche adulte 7. Ceux-ci sont situés à proximité des articulations des appendices des mouches adultes (les jambes, les ailes et licols) et dans le thorax et l&#39;abdomen. En outre, plusieurs centaines de Chos forment collectivement organe de Johnston dans l&#39;antenne acoustique adulte qui transduisent en énergie mécanique 3,5,17,4. Contrairement à la connaissance approfondie de l&#39;évolution de Chos à l&#39;état embryonnaire, on sait très peu sur la morphologie de ces organes au cours de stades larvaires. En outre, à l&#39;exception de Chos fémorales 18 et l&#39;organe de Johnston, notre knowledge sur le développement et la structure de Chos dans la mouche adulte est très fragmentaire. Nous décrivons ici une méthode pour la coloration et la visualisation de Chos en stade larvaire troisième et pupes. Cette méthode peut être appliquée conjointement avec des outils génétiques afin de mieux caractériser la morphologie et de comprendre le développement des Chos divers chez la mouche.

Une méthode pour visualiser les organes et immunocoloration chordotonaux chez les larves et des pupes de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Est décrite.

Visualisation des propriocepteurs dans<em&gt; Drosophila</emLes larves&gt; et pupes

La proprioception est la capacité de percevoir le mouvement ou la position des parties du corps en répondant à des stimuli provenant de l'intérieur de l'organisme. Chez la drosophile et d'autres...

L'objectif général de cette procédure est de visualiser les organes sensoriels corticaux proprioceptifs chez les larves et les pupe de drosophile. Cela est réalisé en élevant et en collectant d'abord des larves de troisième stade ou des pupe après dissection des larves ou des pupes. Elles sont fixées pour une coloration immunohistochimique.Ensuite, les larves ou les puces fixées sont immunomarquées avec les anticorps appropriés. La dernière étape consiste à monter les échantillons marqués pour l'analyse microscopique. En définitive, une microscopie confocale est utilisée pour visualiser les organes cortonaux.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant le développement post-symbiotique et le schéma des récepteurs prop dans l'oph. Bien que cette procédure puisse fournir des informations sur le développement des récepteurs prop, elle peut également être appliquée à d'autres organes, tels que d'autres types d'organes sensoriels et les tendons. Premièrement, rassemblez les outils, solutions et un flacon de larves errantes nécessaires.Au stade de larve troisième instar, maintenir les solutions de PBS et de fixatif sur de la glace. Prélever une larve troisième instar en déambulation sur la paroi du flacon et la placer dans une goutte de 50 microlitres de PBS glacé sur une plaque de dissection en élastomère de cigar, elle-même placée dans une boîte de culture tissulaire. À l’aide d’un microscope stéréoscopique, maintenir la larve en position dorsale vers le haut, près des crochets buccaux, à l’aide de fines pinces, puis piquer le cerveau avec une épingle à insecte.Prendre l'extrémité postérieure des larves avec la pince. Tirez doucement et étirez délicatement les larves dans le sens de la longueur. Insérez une autre épingle à insecte entre les deux sphères postérieures à l’aide de ciseaux à ressort.Effectuez deux incisions horizontales dans la paroi corporelle perpendiculairement à l'axe antéro-postérieur, en restant près des épingles antérieure et postérieure. Ensuite, incisez la paroi corporelle larvaire le long de la ligne médiane dorsale depuis l'incision antérieure jusqu'à l'incision postérieure. Retirez les organes internes et la trachée à l’aide de fines pinces.Ensuite, rincer délicatement une ou deux fois avec du PBS. Saisir les deux lambeaux de paroi corporelle avec une pince. Les étirer et les fixer sur la plaque à l’aide de deux épingles à insectes de chaque côté.Éliminer le PBS et ajouter 50 microlitres de solution de fixation. Incuber pendant 20 minutes à température ambiante. Après avoir retiré la solution de fixation et lavé deux fois avec du PBS, extraire les épingles à insectes à l’aide de ciseaux à ressort.Couper la tête et la queue de la larve afin d'obtenir un filet rectangulaire. Transférer le tissu fixé dans un tube Eppendorf refroidi contenant du PBS. Une fois que suffisamment de larves ont été fixées, on peut passer directement à la coloration par anticorps.Si une coloration immédiate n'est pas souhaitée, les larves fixées doivent être lavées trois fois pendant cinq minutes chacune avec de l'éthanol à 95 %, puis conservées dans l'éthanol à moins 20 degrés. Surveillez les flacons comme pour la fixation des larves jusqu'à ce que les larves de troisième stade commencent à s'alimenter. Examinez les flacons toutes les heures et marquez les larves qui se sont alimentées.Laisser les jeunes mouches marquées se développer pendant 30 à 40 heures à 24 degrés Celsius, ou pendant 24 à 27 heures à 29 degrés Celsius, en utilisant une pince fine. Sélectionner 20 à 30 jeunes mouches de l'âge approprié et les placer dans une boîte de dissection en porcelaine noire à plusieurs puits. Veiller à ne pas endommager les tissus d'intérêt.Ensuite, extrayez les pupes de leurs logements pupaux. Commencez par retirer l'opercule et poursuivez jusqu'à ce que la nymphe soit libérée. Extrayez toutes les pupes et placez-les dans une cavité remplie de PBT.Placez cinq nymphes sur une surface plane entre les alvéoles de la boîte de dissection à l’aide d’un couteau de microdissection. Coupez l’extrémité de la tête et l’extrémité postérieure de l’abdomen. Maintenez la nymphe en place à l’aide de pinces fines et utilisez une seringue d’un millilitre pour rincer les organes internes de la nymphe en injectant du PBT par l’ouverture antérieure.Lavez brièvement la nymphe disséquée en la trempant dans une cavité remplie de PBS, puis transférez-la dans le fixateur froid contenu dans un tube Eppendorf placé sur de la glace. Incubez l'échantillon toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain.Jetez le fixateur et lavez la puby avec du PBT trois fois pendant cinq minutes par lavage. Gardez la puby pendant le lavage sur de la glace. Remplissez deux puits de la boîte de dissection avec du PBT.À l’aide d’une pipette en polyéthylène, transférez plusieurs nymphes dans l’un des puits. Ensuite, déplacez une nymphe à la fois dans le deuxième puits.À l’aide de deux paires de pinces fines à pointes parfaitement alignées, fixez la nymphe au fond du puits, puis déchirez délicatement la cuticule. Le retrait de la cuticule des ailes constitue l’aspect le plus difficile de cette procédure. Nous perdons toujours certaines ailes lors de cette étape, ce qui explique pourquoi nous commençons la procédure avec un nombre relativement élevé de nymphes.Une fois que la cuticule est déchirée, retirez-la de l’aile en prenant soin de ne pas détacher l’aile du pupa. Après avoir retiré la cuticule de la lame de l’aile, poursuivez en décollant la cuticule de la charnière de l’aile.Une fois que l'écaille de l'aile a été pelée, on peut tenter de peler l'écaille des pattes de manière similaire. De nombreuses pattes risquent d'être perdues au cours de cette opération, mais malgré le faible rendement, cette étape est fortement recommandée car elle améliore grandement la coloration des organes corticaux des pattes. Placer la nymphe dans un tube einor rempli de méthanol et la conserver à température ambiante.Continuer à retirer la cuticule de tous les puy et les ajouter au même tube pour un total d'au moins 10 puy bien décapés. Pour chaque coloration, éliminer le méthanol et rincer trois fois pendant cinq minutes chacun avec de l'éthanol à 95 %. Les puy fixés peuvent être conservés longtemps dans de l'éthanol à 95 % à moins 20 degrés avant la coloration immunologique.Pour monter les larves, déposez une goutte de milieu de montage sur une lame de microscope, puis positionnez les larves avec les cuticules orientées vers le bas et les muscles de la paroi corporelle vers le haut. Placez une petite goutte de milieu de montage sur une lame couvre-objet propre et utilisez-la pour recouvrir la préparation sans exercer aucune pression sur les larves montées. Pour monter la pupy.Préparez d'abord deux lames de microscope avec une goutte de milieu de montage, une pour la dissection et l'autre pour la montaison. Placez plusieurs pu sur l'une des lames, puis utilisez la paire de ciseaux à ressort pour enlever la tête et la partie postérieure de l'abdomen. Ensuite, séparez la moitié dorsale du thorax de la moitié ventrale en coupant entre les ailes et les pattes.Placer les pièces dissectées du pupa dans la goutte de milieu de montage. Sur la deuxième lame, s'assurer que les ailes et les pattes sont étirées et tenter de minimiser autant que possible le recouvrement des tissus. Enfin, déposer une goutte de milieu de montage sur une lamelle et la placer au-dessus de l'échantillon sans appliquer une pression excessive.Ce micrographie confocale d'organes cortonaux immuno-marqués chez une larve de troisième stade montre un segment abdominal bien étiré, dans lequel sept des huit organes cortonaux sont clairement visibles. Les cinq organes latéraux qui forment ensemble l'organe lipidique penasco, un organe latéral unique et l'un des deux organes cortonaux ventraux sont apparents. Les neurones des organes cortonaux sont marqués à l'aide du marqueur neuronal, l'anticorps monoclonal 22 C 10, et apparaissent en rouge.Le cap ligamentaire et les cellules d'attachement sont marqués avec l'anticorps Antifa tubuline 85 E et apparaissent en bleu. Les cellules du cap et du ligament sont en outre marquées avec un organe cochléaire corti tonal. Rapporteur GFP spécifique portant un élément régulateur pour le locus Delilah.Ici, les organes toniques alaires situés au niveau de la veine radiale ventrale sont visibles sur cette micrographie confocale d'une nymphe âgée de 35 heures. Les neurones sont marqués par le marqueur neuronal 22 C 10, en rouge et montrés dans le panneau B. Les cellules du ligament et les cellules cap sont co-marquées par les anticorps Antifa tubulin 85 E, en bleu et visibles dans le panneau C, ainsi que par un organe tonique alaire. Un transgène rapporteur GFP spécifique est représenté en vert.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière visualiser les organes corticaux proprioceptifs chez la larve et la nymphe dans l'oph. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit qu'elle a été optimisée pour l'utilisation des anticorps décrits. Différents anticorps peuvent nécessiter des conditions de fixation et de coloration légèrement différentes.Ainsi, lors de l'utilisation de cette procédure avec différents anticorps, il convient de déterminer les conditions optimales pour les anticorps utilisés.

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