Rapid Point-of-Care Test de l'efficacité anticoagulante énoxaparine dans le sang total

La démonstration d'une analyse quantitative rapide de l'inhibition de la coagulation sanguine par le bas poids moléculaire, l'héparine, l'énoxaparine. La contribution de l'énoxaparine est évaluée en retirant son influence à travers la digestion avec de l'héparinase. Une description plus complète de l'analyse est détaillée dans notre article publié.

En guise d’introduction, nous nous référons ici à des travaux publiés sur l’évolution temporelle des concentrations plasmatiques de l’héparine de bas poids moléculaire Enoxaparine chez des sujets humains. Nous démontrons aujourd’hui nos résultats avec un test rapide au point de service pour l’héparine de bas poids moléculaire. Dans ce cas, l’entité est l’énoxaparine.

Les résultats présentés dans cette diapositive montrent la concentration plasmatique chez les patients qui ont reçu le médicament de manière chronique une fois par jour, 40 milligrammes par jour, et le coût en temps de cette dernière administration suivie d’une disparition ultérieure peut alors voir qu’environ quatre heures après l’administration, une concentration maximale de 0,4 unité internationale par ML est atteinte, Et ce niveau se situe dans la gamme thérapeutique du médicament. Un point particulièrement intéressant, cependant, est de savoir combien il reste 12 heures après l’administration, car il existe une directive cliniquement acceptée selon laquelle il faut attendre au moins 12 heures après l’administration d’héparine de bas poids moléculaire, dans ce cas l’énoxaparine, avant d’effectuer une procédure particulièrement invasive, ce qui pourrait entraîner un risque de saignement. Ce qui nous intéresse, c’est qu’il y en a encore une quantité clairement détectable à ce moment-là, et nous nous sommes concentrés sur cela dans certaines de nos études, comme nous le démontrerons.

Ce travail de Sender in etal montre également le fait que les personnes atteintes d’insuffisance rénale ont des niveaux considérablement plus élevés de médicament tout au long de la période, et nous constatons que la ligne directrice de 12 heures pourrait être très inadéquate dans le cas d’un patient atteint d’insuffisance rénale ou, comme on le sait, chez une femme enceinte ou chez les patients obèses. J’aimerais vous présenter les chercheurs qui ont participé à ce projet au New York Medical College. Je m’appelle Mario Osa.

Je suis professeur de pharmacologie ici. Je suis le Dr Surya Patula, professeur agrégé d’anesthésiologie clinique au New York Medical College. Je m’appelle Keshar Kal.

Je suis étudiante en troisième année de médecine. C’est l’appareil que nous utilisons pour ces essais. L’appareil est produit par la société Omicron.

Il peut être utilisé en ligne ou sur batterie, et il s’agit donc d’un véritable point d’attention en ce sens. L’appareil dispose de deux compartiments contrôlés par thermostat et nous utilisons ces compartiments pour une pré-incubation des échantillons dans la préparation du test proprement dit ainsi que pour le test de coagulation lui-même. L’une des principales caractéristiques de l’essai est l’utilisation d’une préparation d’héparinase hautement purifiée et disponible dans le commerce.

Nous l’avons acheté à la société Siemens. Il est fourni sous une forme très stable et est facilement soluble dans une solution saline ou toute solution aqueuse. L’utilisation de l’héparine ACE est particulièrement précieuse dans notre approche car elle nous permet d’obtenir la valeur de base de la coagulation du patient.

En l’absence de toute influence de l’héparine, l’héparine, l’ECA est capable de dégrader complètement l’héparine de faible poids moléculaire et l’héparine non fractionnée, mais notre intérêt particulier ici est l’héparine de faible poids moléculaire et de la dégrader jusqu’à l’inactivité et de produire une valeur pour le temps de coagulation en l’absence de toute influence de l’héparine. Ce que nous illustrons ici, c’est l’évolution temporelle de la dégradation de l’héparine de bas poids moléculaire, en l’occurrence l’énoxaparine par l’héparinase. Les données sont tracées en pourcentage du temps de coupe de base, donc ce que nous voyons ici, c’est que l’énoxaparine a été ajoutée à un anti 10.

Une unité internationale par ML entraîne une augmentation d’environ 50 % du temps de coagulation du sang. Ensuite, après diverses périodes d’incubation avec de l’héparinase à 37 degrés centigrades, nous voyons le coût en temps pour la récupération des temps de coagulation de base. En d’autres termes, la dégradation complète de l’énoxaparine jusqu’à l’inactivité.

En termes d’effet anticoagulant, nous le voyons déjà d’une minute et demie. Il y a essentiellement une récupération de 100 % du temps de coagulation de base. Après l’inspection de cette durée, nous avons choisi d’utiliser cinq minutes d’incubation comme pré-incubation standard du sang avant la mesure du temps de coagulation.

Les tubes de dosage pour ce test au point d’intervention ont été légèrement modifiés par rapport à la façon dont nous les recevons du fabricant. Ces tubes étaient à l’origine contenus dans du kaolin activateur, qui est présent pour une mesure du temps de coagulation activé. Nous avons constaté que lorsque nous utilisons le tube sans l’activateur, il augmente considérablement sa sensibilité.

Nous l’avons appelé notre test minimalement activé parce que nous pensons que la seule source d’activation possible serait maintenant la surface en verre du tube et peut-être l’aimant. L’aimant est la partie essentielle du test automatisé. Ces tubes tournent dans les puits de tubes et lorsque l’aimant est piégé par un caillot de densité pour entraîner sa perte de mouvement, cela est détecté et signale la fin de la coagulation.

Nous avons également étudié le test à l’aide de la cartouche de temps Platin à thrombo partiel activée par Omicron. Le dosage est effectué de la même manière. Il y a un peu plus d’activation présente dans ce système.

Notre première étape consiste à reconstituer l’héparinase de lys telle que nous la recevons dans son flacon. Nous ajoutons 0,25 ml de solution saline dans le flacon, puis nous laissons environ 20 secondes pour la dissolution complète. Nous aspirons ensuite tout le contenu du flacon dans une seringue à tuberculine, récupérant généralement environ 0,2 ml à l’étape suivante.

Des ajouts pour la pré-incubation sont ajoutés à des échantillons de sang fraîchement prélevés contenant de l’énoxaparine dans des tubes de vacutainer de trois ml. La première édition représente l’héparinase et elle est en train d’être mélangée en ce moment. Point suivant, il s’agit de l’ajout de 0,2 ml de solution saline dans le tube contenant de l’énoxaparine mais pas d’héparinase pour un volume total d’OV comparable.

Nous utilisons la minuterie intégrée de l’instrument pour compter les 300 secondes. C’est cinq minutes de pré-incubation. Les tubes de vide sont retirés lorsque la pré-incubation est terminée.

L’étape finale est le transfert de deux ml des échantillons pré-incubés dans nos tubes de dosage minimalement activés. Ces tubes sont préremplis d’une centaine de microlitres de chlorure de calcium à 0,25 molaire pour initier la coagulation. Ce premier tube est celui pré-incubé avec de l’héparinase.

Le deuxième échantillon est celui contenant de l’énoxaparine mais pas d’héparinose. Les minuteries expriment le temps écoulé depuis l’ajout de chlorure de calcium, et nous pouvons voir maintenant que le premier échantillon est complet. C’est-à-dire le flacon supérieur à 200 secondes nécessaire à l’achèvement de la coagulation.

L’échantillon qui ne contenait pas d’héparinase est traité plus longtemps et c’est maintenant terminé. Il s’agit d’une simulation de notre résultat typique avec du sang enrichi de 0,4 unité internationale d’énoxaparine par ml. C’est environ 45 secondes de raccourcissement du temps de coagulation à cette concentration d’énoxaparine ou une diminution de 18 % du temps de coagulation.

Comme on peut le voir, la détection de la coagulation est automatisée et les temps sont conservés sur l’instrument jusqu’à ce que l’inspection soit terminée. Nous devons mentionner que nous avons en fait testé ce test à une concentration aussi faible que 0,1 unité internationale d’énoxaparine par ml. Comme nous l’avons noté dans l’introduction, il s’agit de la concentration qui peut être présente 12 heures après une dose thérapeutique typique d’énoxaparine.

Nous avons également été en mesure de détecter de manière fiable à cette concentration.