Name: Expression et purification de la protéine transmembranaire de la fibrose kystique conductance Regulator dans Saccharomyces cerevisiae (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: Apprenez à exprimer la protéine CFTR dans Saccharomyces cerevisiae en utilisant un marquage GFP pour surveiller l'expression. Cette méthode permet de produire des quantités milligrammes de CFTR pour la recherche sur la mucoviscidose et le criblage de médicaments.

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Nous remercions le Cystic Fibrosis Foundation (CFF) pour le financement de ce travail par le biais de son Consortium Structure CFTR 3D (numéro de subvention FORD08XX0). Nous reconnaissons l&#39;énorme contribution de tous nos collègues au sein du Consortium à ce travail, en particulier dans la conception des gènes CFTR. Nous reconnaissons également la contribution inestimable des Drs. James Birtley (CNRS Demokritos, Grèce), Mark Young (Université de Cardiff, Royaume-Uni) et David Drew (Imperial College, Londres, Royaume-Uni) dans les premiers stades du travail. Nous remercions tout particulièrement le Dr Ina Urbatsch (Texas Tech. University, Lubbock) pour la lecture critique du manuscrit.

<ol><li>Ford, R. C., Birtley, J., Rosenberg, M. F., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+three-dimensional+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">CFTR three-dimensional structure.</a> Methods Mol. Biol. 741, 329-346 (2011).</li>
<li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22CFTR%29.+J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> CFTR). J. Biol. Chem. 279, 39051-39051 (2004).</li>
<li>Zhang, L., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+location+within+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+investigated+by+electron+microscopy+and+gold+labelling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Domain location within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein investigated by electron microscopy and gold labelling.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1808, 399-404 (2011).</li>
<li>Kiser, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+degradation+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Expression and degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in Saccharomyces cerevisiae.</a> Arch. Biochem. Biophys. 390, 195-205 (2001).</li>
<li>Huang, P., Stroffekova, K., Cuppoletti, J., Mahanty, S. K., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Functional expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1281, 80-90 (1996).</li>
<li>Ahner, A., Nakatsukasa, K., Zhang, H., Frizzell, R. A., Brodsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+heat-shock+proteins+select+deltaF508-CFTR+for+endoplasmic+reticulum-associated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Small heat-shock proteins select deltaF508-CFTR for endoplasmic reticulum-associated degradation.</a> Mol. Biol. Cell. 18, 806-814 (2007).</li>
<li>Fu, L., Sztul, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-associated+complexes+%28ERACs%29+containing+aggregated+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29+are+degraded+by+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">ER-associated complexes (ERACs) containing aggregated cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are degraded by autophagy.</a> Eur. J. Cell. Biol. 88, 215-226 (2009).</li>
<li>Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derlin-1+promotes+the+efficient+degradation+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29+and+CFTR+folding+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Derlin-1 promotes the efficient degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and CFTR folding mutants.</a> J. Biol. Chem. 281, 36856-36863 (2006).</li>
<li>Zhang, Y., Michaelis, S., Brodsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+expression+and+ER-associated+degradation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">CFTR expression and ER-associated degradation in yeast.</a> Methods Mol. Med. 70, 257-2565 (2002).</li>
<li>Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat. Protoc. 3, 784-798 (2008).</li>
<li>Knight, A. W., Billinton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+wood+through+the+trees%3A+A+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Seeing the wood through the trees: A review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Anal. Biochem. 291, 175-197 (2001).</li>
<li>Robinson, K. M., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+nucleotide+sequence+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+gene+for+the+succinate+dehydrogenase+flavoprotein+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and nucleotide sequence of the Saccharomyces cerevisiae gene for the succinate dehydrogenase flavoprotein subunit.</a> J. Biol. Chem. 267, 10101-10107 (1992).</li>
<li>Gnann, A., Riordan, J. R., Wolf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+degradation+depends+on%5BTitle%5D)+AND+%22the+lectins+Htm1p%2FEDEM+and+the+Cdc48+protein+complex+in%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator degradation depends on.</a> the lectins Htm1p/EDEM and the Cdc48 protein complex in. 15, 4125-4135 (2004).</li>
<li>Yoo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-conventional+trafficking+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+through+the+early+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Non-conventional trafficking of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator through the early secretory pathway.</a> J. Biol. Chem. 277, 11401-11409 (2002).</li>
<li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+and+structural+changes+associated+with+phosphorylation+and+nucleotide+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Architecture of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein and structural changes associated with phosphorylation and nucleotide binding.</a> Journal of Structural Biology. 167, 242-251 (2009).</li>
<li>Wellhauser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+modulator+interacts+directly+with+deltaPhe508-CFTR+to+modify+its+ATPase+activity+and+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability.</a> Mol. Pharmacol. 75, 1430-148 (2009).</li>
<li>Ramjeesingh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monomer+is+the+minimum+functional+unit+required+for+channel+and+ATPase+activity+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A monomer is the minimum functional unit required for channel and ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Biochemistry. 40, 10700-10706 (2001).</li>
<li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidylglycerol%3A+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal. Biochem. 259, 89-97 (1998).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Ce document fournit une méthode pour l&#39;expression de la protéine CFTR murin des cellules de levure, ce qui devrait faciliter la recherche sur la fibrose kystique. L&#39;objectif est de relier le présent document avec la sortie de la souris CFTR construction d&#39;ADN, qui sera disponible à travers le Cystic Fibrosis Foundation ( <a href="http://www.cff.org/research/CFFT/">http://www.cff.org/research/CFFT/</a> ). Autre orthologues devrait être disponible plus tard. Transformation des cellules de levure avec le vecteur contenant la protéine CFTR est simple, mais il est important à l&#39;écran pour les colonies exprimant des niveaux élevés de la protéine CFTR. Les niveaux d&#39;expression variables peuvent provenir de plusieurs facteurs, mais le nombre de copies de la cellule plasmide par représente probablement un degré significatif de la variation. Les étapes critiques décrites ici devrait permettre la production de la protéine CFTR des cellules exprimant la protéine CFTR et de levure contenant des membranes microsomales. Une fois la transformation, la croissance, la récolte et la lyse des cellules de levure ont été maîtrisées, Purification de la protéine devrait être possible, et à la figure 3, nous avons donné un exemple de la pureté qui devrait être réalisable dans ce cas comme une référence utile. Ce n&#39;est pas notre intention dans ce manuscrit de fournir une méthodologie détaillée pour la purification de la protéine. Cependant, il ya certaines étapes critiques de purification en aval qui sont spécifiques au système d&#39;expression S.cerevisae, tels que la lyse cellulaire et de purification des microsomes, et ceux-ci ont été inclus en détail dans ce manuscrit. Il convient de mentionner, cependant, qu&#39;en dehors des deux méthodes que nous avons utilisés, des méthodes alternatives de cellules de levure de perturbation peuvent être employées, telles que l&#39;utilisation d&#39;une cellule de pression française. La protéine recombinante a un domaine VET-clivable GFP C-terminal qui permet à la protéine à être suivis après induction (fig. 4). Levure ont une protéine intrinsèque 70kDa (probablement succinate déshydrogénase 12) qui entre en fluorescence dans les mêmes conditions 11, ce qui peut fournir une inter utileétalon interne pour les niveaux d&#39;expression relatifs des CFTR dans des extraits cellulaires ou des microsomes entiers (fig. 3). Il est clair à partir des données présentées dans la figure 4 que le moment de la récolte des cellules après induction par le galactose est crucial. Les rendements de baisse CFTR précipitamment après environ 16 heures d&#39;induction, de sorte que il n&#39;y a guère CFTR détectable dans les cellules de levure après 24 heures d&#39;induction. Le rendement de la protéine purifiée est d&#39;environ 1-2mg protéine CFTR par 15 litres culture du fermenteur. La récupération peut être estimée à environ 70% du total CFTR-protéine GFP jusqu&#39;au stade microsomes, et la récupération d&#39;environ 25% de protéine purifiée. Caractérisation de la S. cerevisiae a exprimé la protéine CFTR est en cours. Comme on le voit dans la figure. 4, emplacement de la protéine dans la cellule peut être contrôlée par microscopie de fluorescence. Bien que une grande partie de la fluorescence se trouve autour de la périphérie de la cellule en tant 10 attendue, une partie de la protéine présente une localisation ponctuée, soit dans, oujuste à l&#39;intérieur de la membrane plasmique, qui pourrait être due à CFTR de recyclage grâce à une fin de Golgi / endosome voie 14 ou peut-être un peu en aval du compartiment de le bourgeonnement des vésicules de transport de l&#39;ER 4. Le traitement par PNGaseF, une enzyme qui deglycosylates protéines, ont montré des changements minimes dans la migration de la bande protéine CFTR sur SDS-PAGE, ce qui implique qu&#39;il est non glycosylé, ou a glycosylation minime 15. Expériences sur l&#39;état de phosphorylation de la protéine sont en cours. Dans quelques-unes des détergents testés jusqu&#39;à présent, la protéine purifiée présente une activité ATPase (qui est inhibée par un inhibiteur de la protéine CFTR spécifique 16) à des taux qui sont semblables à ceux publiés antérieurement 2,15. Mesure de l&#39;activité du canal CFTR, il faudra la reconstitution de la protéine purifiée, ce qui impliquerait une étape de purification finale dans un détergent qui a un niveau relativement élevé concentration micellaire critique (cmc) 17. Levure microsomes containing CFTR peut être solublised avec plusieurs détergents couramment utilisés, y compris 18 des détergents tels que le dodécyl maltoside 2, qui sont généralement considérées comme «douces». Cependant, la plupart des détergents haute cmc se sont avérés inefficaces pour solubilsation, jusqu&#39;à présent, ce qui suggère que l&#39;échange dans ces détergents devraient être examinées à un stade tardif de tout régime de purification.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / équipements </td><td> Entreprise </td><td> Catalogue Pas </td></tr><tr><td> FGY217 souche S. cerevisiae, avec suppression pep4 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Base azotée de levure sans acides aminés </td><td> Formedium </td><td> CYN0410 </td></tr><tr><td> Remplissez mélange supplément sans uracile </td><td> Formedium </td><td> DCS0169 </td></tr><tr><td> Agar agar bactériologique </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5306 </td></tr><tr><td> D-galactose </td><td> Pêcheur </td><td> BP656-500 </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Pêcheur </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> Pepstatine A </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4265 </td></tr><tr><td> Leupeptine </td><td> Merck </td><td> 108975 </td></tr><tr><td> Chymostatine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7268 </td></tr><tr><td> Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7626 </td></tr><tr><td> Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E3132 </td></tr><tr><td> Fluorure Aminoethylbenzenesulfonyl (AEBSF) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8456 </td></tr><tr><td> Chlorhydrate de benzamidine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 434760 </td></tr><tr><td> Le diméthylsulfoxyde (DMSO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> dithiothréitol (DTT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td></tr><tr><td> acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) </td><td> Pêcheur </td><td> BP120500 </td></tr><tr><td> Tris-base </td><td> Formedium </td><td> TRIS01 </td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Pêcheur </td><td> P631 </td></tr&gt; <tr><td> D-sorbitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S1876 </td></tr><tr><td> Glycérol </td><td> Pêcheur </td><td> 065017 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6191 </td></tr><tr><td> n-dodécyl-β-D-maltopyranoside </td><td> Affymetrix </td><td> D310S </td></tr><tr><td> Bleu de bromophénol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 114391 </td></tr><tr><td> PageRuler plus les normes de protéines précolorés </td><td> Fermentas </td><td> SM1811 </td></tr><tr><td> NuSep tris-gly gels de gradient 4-20% </td><td> NuSep </td><td> NB10-420 </td></tr><tr><td> Instantanée Bleu de Coomassie Stain </td><td> Novexin </td><td> ISB1L </td></tr><tr><td> Perles de verre, lavé à l&#39;acide </td><td> Sigma </td><td> G8772 </td></tr><tr><td> 50ml stériles Tubes Falcon </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 </td></tr><tr><td> 2mlStériles vis-top flacons </td><td> Sarstedt </td><td> 72.694.005 </td></tr><tr><td> 250ml Erlenmeyer stérile dérouté </td><td> BD Biosciences </td><td> 355119 </td></tr><tr><td> 2l Erlenmeyer stérile dérouté flacons </td><td> BD Biosciences </td><td> 355131 </td></tr><tr><td> Microtubes 2ml </td><td> Sarstedt </td><td> 72.695 </td></tr><tr><td> 0,2 um filtre à seringue </td><td> Sartorius </td><td> FC121 </td></tr><tr><td> tubes ultracentrifugeuse </td><td> Beckman Coulter </td><td> 355618 </td></tr><tr><td> tubes à centrifuger </td><td> Beckman Coulter </td><td> 357000 </td></tr><tr><td> Des pots à centrifuger 1l </td><td> Beckman Coulter </td><td> 969329 </td></tr><tr><td> Orbital incubateur agitateur avec contrôle de température </td><td> New Brunswick Scientific </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision RMicroscope de restauration T </td><td> Applied Vision </td><td></td></tr><tr><td> Centrifugeuse de paillasse </td><td> HERMLE </td><td> Z300 </td></tr><tr><td> Paillasse microcentrifugeuse </td><td> Pêcheur </td><td> 13-100-511 </td></tr><tr><td> Vortex </td><td> Labs étoile </td><td></td></tr><tr><td> Scanner Trio Typhoon </td><td> GE Healthcare </td><td> 63-0055-87 </td></tr><tr><td> Système d&#39;imagerie LAS3000 </td><td> Fuji </td><td></td></tr><tr><td> La cuve de fermentation 20l et l&#39;unité de contrôle </td><td> Applikon </td><td></td></tr><tr><td> Constant perturbateur des systèmes à pile </td><td> Systèmes constants </td><td></td></tr><tr><td> Perturbateur cellule Beadbeater </td><td> BioSpec </td><td> 1107900 </td></tr><tr><td> Mini-beadbeater-16 </td><td> BioSpec </td><td> 607 </td></tr><tr><td> JA-17 rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 369691 </td></tr><tr><td> Optima L-100 Ultracentrifugeuse </td><td> Beckman Coulter </td><td> 392050 </td></tr><tr><td> Rotor 50.2Ti </td><td> Beckman Coulter </td><td> <a href="https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=337901" target="_blank">337901</a> </td></tr></tbody></table>

expression et purification de la protéine transmembranaire de la fibrose kystique conductance regulator dans saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Le régulateur de la conductance transmembranaire de la mucoviscidose (CFTR) est un canal chlorure, que lorsqu&#39;il est muté, peut donner lieu à la fibrose kystique dans humans.There est donc un intérêt considérable dans cette protéine, mais les efforts pour étudier sa structure et l&#39;activité ont été entravés par la difficulté d&#39;exprimer et de purification de quantités suffisantes de la protéine 1-3. Comme beaucoup de &#39;difficiles&#39; protéines membranaires eucaryotes, l&#39;expression dans un organisme en pleine croissance est souhaitable, mais difficile, et dans la levure S. cerevisiae, dans la mesure de faibles quantités ont été obtenues et de la dégradation rapide de la protéine recombinante a été observée 4-9. Les protéines impliquées dans le traitement de la protéine CFTR chez la levure recombinante ont été décrites 6-9. Dans ce rapport, nous décrivons une méthodologie pour l&#39;expression de la protéine CFTR chez la levure et sa purification en quantités importantes. Le protocole décrit comment les problèmes de protéolyse antérieures peuvent être surmontés et les niveaux d&#39;expression de la façon dontCFTR peut être grandement améliorée en modifiant les conditions de croissance des cellules et en contrôlant les conditions d&#39;induction, en particulier la période de temps avant la récolte des cellules. Les reagants associés à ce protocole (CFTR murin exprimant des cellules de levure ou des plasmides de levure) seront distribués par l&#39;intermédiaire de la Fondation de la fibrose kystique aux États-Unis, qui a parrainé la recherche. Un article décrivant la conception et la synthèse de la protéine CFTR Construct employé dans le présent rapport sera publié séparément (Urbatsch, I.;. Thibodeau, P. et al, non publié). Dans cet article nous allons expliquer notre méthode de début de la transformation des cellules de levure avec le CFTR construire - la levure contenant le plasmide (Fig. 1). Le produit de construction a une protéine fluorescente verte (GFP) fusionnée à la séquence CFTR à son extrémité C-terminale et suit le système développé par Drew et al. (2008) 10. La GFP permet l&#39;expression et la purification de la protéine CFTR à suivre relativement facilement. Le protocole JoVE visualiséesfinitions ol après la préparation de microsomes des cellules de levure, bien que nous incluons quelques suggestions pour la purification de la protéine à partir des microsomes. Les lecteurs peuvent ajouter leurs propres modifications à la procédure de purification microsome, en fonction des derniers essais à effectuer avec la protéine et l&#39;équipement local à leur disposition. La levure a exprimé la protéine CFTR peut être partiellement purifié à l&#39;aide d&#39;ions métalliques chromatographie d&#39;affinité, en utilisant un marqueur polyhistidine intrinsèque de purification. Après chromatographie d&#39;exclusion stérique donne une protéine qui semble être&gt; 90% de pureté, à en juger par SDS-PAGE et Coomassie-coloration du gel.

Les tentatives pour exprimer le régulateur de la conductance transmembranaire de la mucoviscidose (CFTR) dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Ont, jusqu&#39;à présent, abouti à des quantités relativement faibles de protéines. Ce protocole et les réactifs associés distribués par la Cystic Fibrosis Foundation devrait permettre la préparation de quelques milligrammes de cette «difficile» protéine de la membrane eucaryote.

Expression et purification de la protéine transmembranaire de la fibrose kystique conductance Regulator dans Saccharomyces cerevisiae

Le régulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR) est un canal chlorure qui, lorsqu'il est muté, peut être à l'origine de la mucoviscidose chez...

L'objectif général de cette procédure est d'exprimer des quantités de protéine CFTR en milligrammes dans Charmy Visier. Cela est réalisé en sélectionnant d'abord des colonies TRANSFORMANTES pour des essais de croissance et d'expression dans des cultures cellulaires de 50 millilitres. Ensuite, les cellules lysées et les colonies exprimant CFTR sont identifiées.Ensuite, les colonies exprimant le niveau le plus élevé de CFTR sont cultivées dans un fermenteur de 15 litres. Enfin, les cellules sont lysées et les microsomes contenant le CFTR sont préparés. Finalement, les résultats montrent l'expression et l'extraction du CFTR fusionné à la GFP par détection de la fluorescence sur gel et par microscopie de fluorescence.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes d'expression de CFTR réside dans l'utilisation d'un hôte eucaryote simple, peu coûteux, rapide et facile à cultiver. Elle comporte une étiquette de protéine fluorescente verte permettant une surveillance rapide des niveaux d'expression. Enfin, les étapes de biologie moléculaire sont minimisées dans cette procédure.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la mucoviscidose, comme les propriétés biophysiques de la protéine CFTR. Les implications de cette technique s'étendent vers les thérapies contre la mucoviscidose, car elle pourrait permettre de nouveaux criblages médicamenteux fondés sur la protéine purifiée. De nouvelles catégories de médicaments pourraient découler de ces substances qui interagissent directement avec la protéine.Le défaut principal dans la fibrose kystique devrait être plus spécifique et potentiellement avoir moins d'effets pléiotropes. En outre, la purification de grandes quantités de la protéine est importante pour obtenir une structure à haute résolution du CFTR. La conception de médicaments basée sur la structure protéique devrait améliorer les médicaments existants et potentiellement conduire à la découverte de nouveaux médicaments.La publication de cet article et de la vidéo associée est liée à la distribution d'ADN ou de cellules transformées par la Fondation pour la fibrose kystique. Si vous souhaitez obtenir ces matériaux, veuillez contacter Elizabeth Joof à la Fondation pour la fibrose kystique. Vous devrez remplir un accord de transfert de matériaux.Cette méthode peut fournir des informations sur l'utilisation d'une étiquette GFP pour l'expression de protéines membranaires, comme cela a été introduit par David Drew et ses collaborateurs de l'Imperial College de Londres. Les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés lors de la transformation. Les rendements peuvent être faibles et le moment de la récolte des cellules est critique afin d'obtenir de bons niveaux d'expression.Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode lors d'une visite de David Drew et de ses collaborateurs dans notre laboratoire. Ils menaient des études structurales sur des protéines membranaires qu'ils avaient exprimées et purifiées à partir de levure en utilisant ce système. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la transformation cellulaire, la croissance cellulaire après induction et l'isolement de microsomes sont des étapes difficiles, et une publication est liée à la mise à disposition d'un réactif.La vidéo aidera également à standardiser le protocole afin que différents laboratoires puissent comparer leurs résultats. Cette procédure sera démontrée par Tracy Remington et Natasha Kant, toutes deux étudiantes diplômées dans notre laboratoire. Liam o Ryan, l'autre coauteur de l'article, se trouve actuellement en Nouvelle-Zélande et n'a pas pu participer à la démonstration. Après la transformation de la souche s visi FGY 2 1 7 avec un plasmide levure codant pour le gène C-F-T-R-G-F-P huit hiss, sélectionnez cinq à dix colonies bien séparées sur une plaque de transformation.Transférez chaque colonie dans un tube stérile Falcon de 50 millilitres contenant neuf millilitres de milieu de base azotée pour levures ou milieu YNB et un millilitre de glucose. Incubez les cultures pendant la nuit pendant 16 heures à 250 tr/min et à 30 degrés Celsius dans un incubateur agitateur orbital afin de préparer des stocks de glycérol pour chacune des colonies sélectionnées. Ajoutez de manière aseptique 0,8 millilitre des cultures de nuit à 0,2 millilitre de glycérol stérile dans des vials vissables étiquetés.Vortexer brièvement et conserver à moins 80 degrés Celsius. Diluer les cultures restantes à un volume final de 50 millilitres dans du YMB contenant 250 microlitres de milieu de glucose. Faire croître les cultures dans des flacons Erlenmeyer bafflés de 250 millilitres étiquetés, jusqu’à une DO 600 comprise entre 0,7 et 0,8, à 250 tr/min et 30 degrés Celsius dans un incubateur agitateur orbital. Induire les cultures en ajoutant 5 millilitres de milieu de galactose à chaque flacon. Réduire la température de l’incubateur à 25 degrés Celsius et faire croître pendant la nuit pendant 16 heures.Transférez les cultures dans des tubes Falcon de 50 millilitres. Récoltez les cellules par centrifugation à 3 500 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius dans une centrifugeuse de table, pendant que la centrifugeuse est en marche. Préparez des microtubes à vis de deux millilitres contenant environ 300 microlitres de billes de verre lavées à l'acide et placez-les sur de la glace.Jetez les surnageants et resuspendez chaque culot dans 800 microlitres de tampon de resuspension cellulaire glacé ou CRB contenant des inhibiteurs de protéase. Transférez les suspensions dans des tubes microfuge et conservez-les sur glace. Chargez les cellules dans un homogénéisateur à billes mini et faites fonctionner pendant trois minutes.Placer les tubes dans une microcentrifugeuse de banc et centrifuger à 3 500 ×g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Transférer les surnageants contenant les membranes vers des tubes de microcentrifugeuse propres et placer sur de la glace. Recueillir les membranes brutes en centrifugeant à vitesse maximale à quatre degrés Celsius dans une microcentrifugeuse de banc pendant deux heures.Jetez le surnageant et resuspendez chaque culot dans 50 microlitres de tampon CFTR glacé dans de nouveaux tubes microcentrifuges propres. Mélangez 15 microlitres de chaque suspension avec 15 microlitres de colorant de charge double concentration à l’aide d’une pipette.Ne pas faire bouillir les échantillons, car cela provoquerait la formation d'agrégats insolubles dans le SDS par la protéine CFTR et d'autres protéines membranaires, ainsi que la dénaturation de la balise GFP. Déposer les échantillons ainsi qu'un marqueur protéique précoloré sur un gel gradient glycine à quatre à 20 %, puis faire migrer à 150 volts pendant 40 minutes. Après avoir effectué la fluorescence en gel afin d'identifier les cellules les plus expressives et vérifié l'expression par coloration au Kumasi, repiquer la souche cellulaire la plus expressive à partir de son stock en glycérol sur une nouvelle plaque YNBA et incuber à 30 degrés Celsius pendant deux à trois jours.Conserver la plaque jusqu'à deux semaines à quatre degrés Celsius pour préparer des pré-cultures pour le fermenteur. À l’aide d’un anneau stérile, prélever une zone carrée de cellules d’un centimètre de côté sur la plaque A-Y-N-B-A et l’ajouter à 45 millilitres de milieu YMB et à cinq millilitres de milieu de glucose afin d’obtenir une DO 600 d’environ 0,1. Faire croître les cultures à 250 tr/min et à 30 degrés Celsius dans un incubateur agitateur orbital jusqu’à ce que la DO 600 atteigne un. Séparer la culture entre deux flacons Erlenmeyer de deux litres munis de plots, chacun contenant 450 millilitres de milieu YMB et 25 millilitres de glucose. Faire croître le milieu toute la nuit à 250 tr/min à 30 °C dans un incubateur agitateur orbital jusqu'à ce que l'OD 600 atteigne 1,2. Pour préparer le fermenteur, préparer 11,2 litres de YNB et ajouter 8,28 grammes supplémentaires de YNB et 0,95 gramme de supplément de dropout afin de compenser l'ajout de glycérol lors de l'induction.Ensuite, ajoutez aseptiquement les 11,2 litres de YNB et 75 millilitres de milieu de glucose dans un réacteur de fermentation stérile de 20 litres, puis réglez la température de fonctionnement à 30 degrés Celsius. Puis ajoutez aseptiquement les pré-cultures au réacteur. Réglez la vitesse d'agitation à environ 800 tr/min et ajustez le débit d'air comprimé à environ 15 décimètres cubes par minute.Lorsque la culture atteint une DO à 600 nm de 1,2, induire en ajoutant de manière aseptique 1,5 litre de milieu galactose et 1,2 litre de glycérol. Réduire la température à 25 degrés Celsius et laisser la culture croître pendant 16 heures à l’aide d’une pompe péristaltique. Transférer la culture dans des tubes de centrifugation d’un litre prérefroidis, placés sur de la glace.Récupérez les cellules par centrifugation pendant 30 minutes à 3 500 ×g à 4 °C. Resuspendez les cellules dans 150 millilitres de tampon de resuspension froid (MRB, pour « micro zone Resus suspension buffer ») contenant des inhibiteurs de protéase et 1 millimolaire de DTT. À partir de ce stade, effectuez toutes les manipulations à 4 °C. Utilisez un disrupteur cellulaire pour lyser les cellules.Ensuite, transférez les lysats dans des tubes Falcon de 50 millilitres et faites tomber les débris cellulaires par centrifugation à 3 500 ×g et à 4 °C pendant 15 minutes. Pour éliminer les mitochondries, transférez le surnageant dans des tubes de centrifugation refroidis et centrifugez à 14 000 ×g à 4 °C pendant 30 minutes. Ensuite, pour récupérer les microsomes, transférez le surnageant dans des tubes d'ultracentrifugation refroidis et centrifugez à 200 000 ×g à 4 °C pendant 90 minutes.Versez soigneusement et jetez le surnageant et ajoutez deux millilitres de tampon CFTR glacé contenant des inhibiteurs de protéase et un millimolaire de DTT dans chaque tube. À l’aide d’un pinceau, remettez délicatement les culots en suspension. Ensuite, complétez chaque tube avec du tampon CFTL et vortexez. Centrifugez la suspension à 100 000 ×g à quatre degrés Celsius pendant 60 minutes.Jetez l'agent supin et utilisez un pinceau pour répéter le processus de suspension de Resus dans deux millilitres de tampon CFTR glacé contenant des inhibiteurs de protéase et un millimolaire de DTT. Récupérez les microsomes resuspendus, puis ajustez le volume final à 50 millilitres avec du tampon CFTR et mélangez soigneusement. Conservez une aliquote d'un millilitre pour une électrophorèse SDS et stockez les microsomes à moins 80 degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils soient nécessaires pour extraire le CFTR des microsomes.Se référer au protocole écrit. La transformation de la levure avec le plasmide contenant CFTR n'est pas efficace à 100 %. Un écran à petite échelle représentatif de l'expression de CFTR dans des colonies sélectionnées à la suite d'une expérience de transformation permettra d'obtenir environ une colonie sur quatre exprimant la protéine indiquée.Voici les résultats d'un criblage de cinq colonies prélevées à partir d'une boîte de Pétri. Une colonie présente un niveau élevé d'expression de la protéine de fusion C-F-T-R-G-F-P. Les niveaux de fluorescence de C-F-T-R-G-F-P varieront considérablement entre les expériences, la colonie quatre montrant une fluorescence d'au moins 10 fois supérieure à celle de la bande fluorescente intrinsèque d'environ 70 kilodaltons.Même avec un niveau d'expression élevé de C-F-T-R-G-F-P comme indiqué à gauche, il est peu probable que la bande de C-F-T-R-G-F-P soit discernable dans l'extrait cellulaire par coloration au kumasi, comme on le voit à droite. Cette figure montre la présence de C-F-T-R-G-F-P au sein des microsomes. Les résultats de cette expérience sont importants non seulement pour évaluer l'efficacité de l'induction de l'expression, mais aussi pour vérifier que les microsomes ont été préparés avec soin et que la protéolyse a été minimisée.Comme illustré ici. La croissance des cellules au-delà de 16 heures entraînera une diminution de l'expression de CFTR. Ceci est probablement dû à la dégradation de la protéine, peut-être en raison d'une surexpression du système de contrôle qualité protéique de la levure.Il est donc conseillé de surveiller les niveaux d'expression de CFTR après l'induction, en utilisant la fluorescence en gel et l'imagerie fluorescente. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de suivre la croissance cellulaire à l'aide de mesures d'OD 600. Essayez d'abord tout à petite échelle avant de passer à une plus grande échelle, et vérifiez l'expression protéique en fonction du temps. Après induction, le moment optimal pour récolter les cellules pouvant varier d'un laboratoire à l'autre.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'exprimer des quantités en milligrammes de la protéine CFTR chez la levure Scro Visier. Suite à cette procédure, la protéine CFTR peut être purifiée à partir des microsomes de levure afin d'être caractérisée davantage sur les plans biochimique et biophysique. Depuis son développement par David Drew et ses collaborateurs, cette technique a ouvert la voie à une meilleure expression des protéines membranaires eucaryotes.Nous espérons que ce travail aura un impact sur la recherche sur la fibrose kystique en permettant aux laboratoires du monde entier de produire la CFTR à l’aide d’un système d’expression bon marché et facile à utiliser. Ce travail n’aurait pas été possible sans le soutien de la Cystic Fibrosis Foundation et, bien sûr, de nos collègues du Consortium sur la structure tridimensionnelle de la CFTR. N’oubliez pas que le travail avec tout organisme recombinant est strictement réglementé, et que les procédures de manipulation et d’élimination doivent être approuvées par l’organisme réglementaire compétent avant le début de toute expérimentation.

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Expression et purification de la protéine transmembranaire de la fibrose kystique conductance Regulator dans Saccharomyces cerevisiae (Vidéo) | JoVE Journal

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