Caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules endothéliales formant colonie dérivés du sang de cordon ombilical humain

L’objectif général de cette procédure est d’expliquer comment dériver des cellules formant des colonies endothéliales ou des CFC à partir de sang de cordon ombilical humain. Ceci est accompli en plaquant d’abord des cellules mononucléées à partir du sang de cordon ombilical, puis en clonant et en élargissant les excroissances de colonies de CFC E. La deuxième étape consiste à caractériser les cellules in vitro à l’aide d’une nouvelle technique de dosage sur cellule unique du potentiel de prolifération clonale.

Enfin, les cellules sont caractérisées dans un test de formation de vaisseaux in vivo par la production et l’implantation de gels contenant des E CFC chez des souris à patins nod. En fin de compte, la formation in vivo de vaisseaux remplis de sang de novo de l’hôte peut être évaluée par coloration h et e des implants cellulaires contenant de l’ECFC. Le principal avantage de ces techniques par rapport aux méthodes existantes est qu’elles permettent d’examiner le potentiel prolifératif des cellules endothéliales à l’échelle d’une seule cellule.

Les implications de cette technique pourraient être étendues à la recherche d’outils diagnostiques et thérapeutiques pour des maladies telles que l’artériopathie sauvage ou l’AOMI, car cette technique nous permet d’examiner le potentiel prolifératif et la capacité génique des cellules endothéliales d’un patient. Avant de commencer la procédure, ajoutez un millilitre de collagène de queue de rat, tapez un dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à six puits, puis incubez la plaque pendant la nuit le jour de la procédure, aliquote le sang de cordon en unités de 15 millilitres dans des tubes à centrifuger coniques de 50 millilitres. Ajoutez ensuite 20 millilitres de PBS dans chaque tube et pipetez le mélange de haut en bas plusieurs fois.

Ensuite, prélevez 15 millilitres de fial PA dans une pipette, placez la pointe de la pipette au fond du tube de sang dilué et sous-posez soigneusement la centrifugeuse alpac, les tubes pendant 30 minutes à 740 fois G à température ambiante sans le réglage du frein de décélération. Après la séparation des cellules, à l’aide d’une pipette de transfert, enlever la couche brumeuse de cellules mononucléées de faible densité située à l’interface entre le pic fial et le plasma dilué. Distribuez les cellules collectées dans un tube conique de 50 millilitres contenant 10 millilitres de milieu E GM deux et granulez les cellules mononucléées pendant 10 minutes à 515 fois G à température ambiante avec le réglage de frein à haute décélération, aspirez et jetez soigneusement le surnageant.

Ensuite, après avoir lavé les cellules granulées avec EGM deux fois resus, suspendez-les cellules mononucléées dans EGM deux à 1,25 fois 10 à la septième cellule par millilitre. Maintenant, pipetez quatre millilitres de la suspension de cellules mononucléées dans chaque puits de la plaque recouverte de collagène et incubez les cellules jusqu’à ce que des colonies se forment le premier jour. Après l’incubation, retirez lentement le milieu épuisé des puits à l’aide d’une pipette sans déranger les cellules faiblement adhérentes.

Ajoutez ensuite soigneusement quatre millilitres de E GM deux dans les puits et remettez la plaque dans l’incubateur. Les colonies apparaissent généralement entre le cinquième et le 14e jour la veille de la procédure. À 50 microlitres de collagène de queue de rat.

Tapez un dans chaque puits d’une plaque de 96 puits comme précédemment et incubez la plaque pendant la nuit le jour de l’intervention. Commencez par laver les cellules qui n’ont été passées que deux à trois fois avec du PBS. Après avoir aspiré le lavage final de PBS, placez un cylindre de clonage enduit de gel stérile autour de chaque colonie, en pressant fermement chaque cylindre contre la plaque à l’aide d’une pince stérile.

Ajoutez deux à trois gouttes de triple E chaud dans chaque cylindre de clonage et incubez les cylindres pendant trois à cinq minutes jusqu’à ce que les cellules commencent à se détacher. Une fois que les cellules ont commencé à se détacher à environ 250 microlitres d’EGM, deux milieux au centre du cylindre et pipeter de haut en bas pour générer une suspension de cellule unique. Transférez maintenant la suspension unicellulaire de chaque cylindre de clonage séparément dans un microtube de centrifugation individuel.

Infectez les cellules d’une plaque à six puits avec des lentivirus exprimant EGFP et collectez les cellules exprimant EGFP par cytométrie fluorescente. Ensuite, incubez les cellules positives EEG FP et EGM deux dans les plaques recouvertes de collagène. Lorsque les E CFC sont prêts, collectez-les à l’aide du voyage E express comme nous venons de le démontrer et mettez en suspension les cellules et e GM deux milieux à une concentration finale d’environ 10 à la sixième cellules par millilitre.

Ensuite, à l’aide d’un trieur à flux faible avec un faible débit de 20 cellules par seconde, triez un seul EGP positif ECFC par puits dans la plaque à 96 puits préalablement préparée recouverte de collagène, ajustez le volume final de chaque puits avec EGM deux à environ 200 microlitres par puits. Utilisez ensuite un microscope à fluorescence inversée pour vous assurer que chaque puits ne contient qu’une seule cellule. Incuber la plaque sur une période de deux semaines avec deux changements de milieu au jour 14 de la culture.

Lavez chaque puits avec 100 microlitres de PBS avant de fixer les cellules avec 100 microlitres d’aldéhyde paraforme à 4 % pendant 30 minutes. Pour les CFC qui n’expriment pas l’EGFP, ajoutez du réactif cyt, un colorant nucléaire fluorescent vert après fixation au paraformaldéhyde et incubez à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Utilisez un microscope à fluorescence pour quantifier visiblement le nombre de cellules endothéliales élargies, comme démontré ici, les puits avec un nombre de cellules endothéliales de deux à 50 sont considérés comme des amas de cellules endothéliales.

Les puits avec 51 à 2000 cellules ont un faible potentiel de prolifération e CFC et les puits avec 2001 ou plus sont considérés comme des e CFC à fort potentiel de prolifération. Après avoir détaché les cellules avec triple E express comme précédemment, obtenir un nombre de cellules viables de la culture cellulaire par hémomètre, cytomètre et bleu trian. Transférez 2,4 millions de cellules viables dans un tube conique de 50 millilitres, puis granulez les cellules par centrifugation pendant que les cellules sont filifiées.

Mélangez soigneusement les composants de la matrice de gel, puis ajustez le pH à 7,4 avec de l’hydroxyde de sodium tout en gardant la solution sur de la glace. Après avoir jeté le surnageant, remettre en suspension le granulé dans 360 microlitres de chaud e GM deux. Ajoutez ensuite 840 microlitres de la solution de matrice de gel aux cellules et mélangez soigneusement la solution jusqu’à ce que les cellules soient complètement suspendues dans le gel Transférez cette suspension de gel cellularisée d’un millilitre dans un puits d’une plaque de culture tissulaire de 12 puits et incubez la plaque jusqu’à ce que le gel polymérise.

Ensuite, avant d’incuber pendant la nuit, couvrez doucement le gel avec deux millilitres d’EGM chaud deux le lendemain et immédiatement avant l’implantation. Utilisez des ciseaux à iris pour disséquer le gel en deux morceaux égaux et remettez les morceaux de gel dans la même culture contenant e GM deux milieu. Après avoir confirmé la sédation par pincement des orteils, rasez le bas-ventre d’un enfant de cinq à six semaines anesthésié, faites glisser la souris et nettoyez soigneusement le site chirurgical en tournant des tampons d’alcool et de bétadine.

Ensuite, utilisez des ciseaux à iris tranchants stériles pour faire une incision d’environ cinq millimètres dans le quadrant inférieur de l’abdomen, exposant l’espace sous-cutané entre la peau et le muscle abdominal. Émoussé. Disséquez la couche dermique du muscle abdominal dans deux zones différentes de l’abdomen pour créer des poches de 15 à 20 millimètres de large, l’une menant au-dessus du quadrant abdominal supérieur et l’autre dans une autre zone de l’abdomen. Ensuite, en soulevant la couche dermique, il suffit de se blottir contre l’incision.

Insérez la moitié du gel dans une poche abdominale dans l’autre moitié du gel dans l’autre poche abdominale. Une fois les gels insérés, fermez chaque incision avec deux à trois points de suture à l’aide de cinq sutures en polypropylène sur une aiguille coupante. Étiqueter les cartes de cage et effectuer la surveillance postopératoire et l’analgésie conformément aux exigences de l’établissement et du protocole.

Après avoir sacrifié l’animal le 14e jour de l’implantation, frottez l’abdomen de la souris avec des tampons imbibés d’alcool et coupez la peau dorlotée jusqu’à la ligne d’incision d’origine. Ensuite, excisez des lambeaux de peau dorlotés à l’emplacement probable des gels. Coupe circonférentiellement autour des gels pour retirer chaque implant, puis place les implants excisés dans le fixateur de zinc.

En utilisant cette technique de dérivation ECFC, nous avons observé une croissance de la formation de la colonie primaire dès le cinquième jour. Notez la morphologie des galets de ces cinq cultures ECFC du jour comme l’indiquent les pointes de flèches. Les colonies élargies expriment des antigènes endothéliaux, mais n’expriment pas d’antigènes hématopoïétiques.

Comme le montre cette évaluation phénotypique représentative in vitro des cellules endothéliales et hématopoïétiques, l’immunophénotypage a révélé que les CFC e expriment des antigènes endothéliales tels que CD 31, CD 34, CD 1 44, CD 1 46, FL un, flick one, flip quatre et NRP deux, mais n’expriment pas les antigènes hématopoïétiques, CD 45 CD 14, CD 11 BC Kit CXCR quatre ou CD 1 33. Il est important de noter que, comme le montre ce graphique à barres, les colonies étendues présentent une hiérarchie complète du potentiel de prolifération clonale au niveau de la cellule unique, allant de grappes de deux à 50 cellules jusqu’à des colonies de plus de 2001. Ces micrographies de colonies colorées au cyt, un colorant nucléaire fluorescent vert, ont été obtenues après que des CFC E dérivés du sang de cordon aient été cultivés au niveau de la cellule unique pendant 14 jours.

De plus, les CFC e forment des vaisseaux sanguins humanisés qui sont perfusés avec les globules rouges de l’hôte lorsqu’ils sont implantés dans des souris immunodéficientes. Dans cette coloration h et e des implants de gel ECFC dérivés du sang de cordon modal, des microvaisseaux remplis de globules rouges de l’hôte qui se sont formés dans le gel de fibronectine de collagène après 14 jours d’implantation peuvent être observés. Ici, la coloration anti-humaine du CD 31 en brun confirme encore l’origine humaine de ces vaisseaux.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de dériver les CFC à partir du sang de cordon ombilical humain, et de la façon de cloner, d’étendre et de caractériser la fonctionnalité des colonies ECFC après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs en endothélium vasculaire pour explorer le potentiel de prolifération clonale endothéliale et la capacité génique des cellules endothéliales obtenues à partir de sources multiples.