Name: Caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules endothéliales formant colonie dérivés du sang de cordon ombilical humain (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 46 s
Description: Découvrez comment dériver et caractériser les cellules endothéliales formant colonie (ECFC) à partir de sang de cordon ombilical humain. Cette méthode permet d'évaluer leur potentiel prolifératif clonal et leur capacité de formation vasculaire in vivo.

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Dr Yoder est consultant pour les technologies EndGenitor, Inc et un membre du conseil d&#39;administration de Technologies Rimedion, Inc

<ol><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473, 298-307 (2011).</li>
<li>Asahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+putative+progenitor+endothelial+cells+for+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.</a> Science. 275, 964-967 (1997).</li>
<li>Urbich, C., Dimmeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitor+cells%3A+characterization+and+role+in+vascular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology.</a> Circ. Res. 95, 343-353 (2004).</li>
<li>Critser, P. J., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+and+defining+cells+to+engineer+human+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Prolif%22%5BJournal%5D)">Isolating and defining cells to engineer human blood vessels.</a> Cell. Prolif. 44, 15-21 (2011).</li>
<li>Matthias, M., David, N., Josef, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+bench+to+bedside%3A+what+physicians+need+to+know+about+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">From bench to bedside: what physicians need to know about endothelial progenitor cells.</a> Am. J. Med. 124, 489-4897 (2011).</li>
<li>Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel+wall-derived+endothelial+cells+rapidly+proliferate+because+they+contain+a+complete+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells.</a> Blood. 105, 2783-276 (2005).</li>
<li>Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104, 2752-2760 (2004).</li>
<li>Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li>
<li>Reinisch, A., Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Animal+Serum+Free+Expansion+of+Human+Umbilical+Cord+Derived+Mesenchymal+Stromal+Cells+%28MSCs%29+and+Endothelial+Colony+Forming+Progenitor+Cells+%28ECFCs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs.</a> J. Vis. Exp. (32), e1525(2009).</li>
<li>Au, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+in+vivo+potential+of+endothelial+progenitor+cells+from+human+umbilical+cord+blood+and+adult+peripheral+blood+to+form+functional+long-lasting+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels.</a> Blood. 111, 1302-135 (2008).</li>
<li>Critser, P. J., Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+matrix+physical+properties+modulate+endothelial+colony+forming+cell-derived+vessels+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Collagen matrix physical properties modulate endothelial colony forming cell-derived vessels in vivo.</a> Microvasc. Res. 80, 23-30 (2010).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+robust+and+functional+vascular+networks+in+vivo+with+human+adult+and+cord+blood-derived+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells.</a> Circ. Res. 103, 194-202 (2008).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+vasculogenic+potential+of+human+blood-derived+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Blood. 109, 4761-4768 (2007).</li>
<li>Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Large+Scale+Expansion+of+Adult+Human+Endothelial+Colony+Forming+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells.</a> J. Vis. Exp. (32), e1524(2009).</li>
<li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> J. Clin. Invest. 105, 71-77 (2000).</li>
<li>Witting, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Large+Volume+Lentiviral+Vector+Production+Using+Flow+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient Large Volume Lentiviral Vector Production Using Flow Electroporation.</a> Hum. Gene. Ther. , (2011).</li>
<li>Yoon, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+neovascularization+by+mixed+transplantation+of+early+endothelial+progenitor+cells+and+late+outgrowth+endothelial+cells%3A+the+role+of+angiogenic+cytokines+and+matrix+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Synergistic neovascularization by mixed transplantation of early endothelial progenitor cells and late outgrowth endothelial cells: the role of angiogenic cytokines and matrix metalloproteinases.</a> Circulation. , 112-1618 (2005).</li>
<li>Dubois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+progenitor+cell+populations+on+left+ventricular+remodeling+and+myocardial+neovascularization+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential effects of progenitor cell populations on left ventricular remodeling and myocardial neovascularization after myocardial infarction.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 55, 2232-2243 (2010).</li>
<li>Medina, R. J., O'Neill, C. L., Humphreys, M. W., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outgrowth+endothelial+cells%3A+characterization+and+their+potential+for+reversing+ischemic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Outgrowth endothelial cells: characterization and their potential for reversing ischemic retinopathy.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5906-5913 (2010).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

La caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules progénitrices endothéliales putatifs est important d&#39;identifier les CPEF de bonne foi qui sont capables de clonage et de série re-placage dans la culture et de donner lieu à durables et fonctionnels des vaisseaux sanguins implantables in vivo. Sang de cordon ombilical humain est enrichi en CPEF et la concentration de ces cellules circulantes diminue avec le vieillissement ou d&#39;une maladie 10. Des études récentes suggèrent ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Injection d&#39;héparine sodique, USP </td><td> APP Pharmaceuticals </td><td> 504031 </td></tr><tr><td> Ficoll-Pague </td><td> Amersham Biosciences </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> Mélange de canule </td><td> Maersk Medical </td><td> 500.11.012 </td></tr><tr><td> EGM-2 </td><td> Lonza </td><td> CC-3162 </td></tr><tr><td> FBS Défini </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td></tr><tr><td> TrypLE expresse </td><td> Gibco </td><td> 12605 </td></tr><tr><td> Type de Rat collagène </td><td> BD Biosciences </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 356234 </td></tr><tr><td> FcR Bloquer </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-059-901 </td></tr><tr><td> hCD31, FITC ConjugaTed </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555445 </td></tr><tr><td> hCD45, conjuguée au FITC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555482 </td></tr><tr><td> hCD14, conjugué FITC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555397 </td></tr><tr><td> hCD144, PE conjugué </td><td> eBioscience </td><td> 12-1449-80 </td></tr><tr><td> hCD146, PE conjugué </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550315 </td></tr><tr><td> hCD105, PE conjugué </td><td> Invitrogen </td><td> MHCD10504 </td></tr><tr><td> Mme IgG 1, l&#39;anticorps k, conjuguée au FITC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555748 </td></tr><tr><td> Mme IgG 1, l&#39;anticorps k, conjugué PE </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559320 </td></tr><tr><td> Mme IgG 2a, l&#39;anticorps k, conjuguée au FITC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555573 </td></tr><tr><td> Anti-CD31 humain </td><td> Dako </td><td> clone JC70 / A </td></tr><tr><td> Anti-mouse CD31 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553370 </td></tr><tr><td> 0,22 um système de filtration sous vide </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td></tr><tr><td> L&#39;acide acétique glacial, 17.4N </td><td> Pêcheur </td><td> A38-500 </td></tr><tr><td> Antibiotiques antimycosique </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal (FBS) </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td></tr><tr><td> IHC Zinc fixateur </td><td> BD Biosciences </td><td> 550523 </td></tr><tr><td> Sytox vert réactif </td><td> Invitrogen </td><td> S33025 </td></tr><tr><td> Cylindres de clonage, les stériles </td><td> Fisher Scientific </td><td> 07-907-10 </td></tr></tbody></table>

caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules endothéliales formant colonie dérivés du sang de cordon ombilical humain

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Vues de longue date de la formation de nouveaux vaisseaux sanguins par l&#39;intermédiaire d&#39;angiogenèse, vasculogenèse, et artériogenèse ont été récemment passé en revue 1. La présence de progéniteurs endothéliaux circulants (PEC) ont d&#39;abord été identifié chez l&#39;adulte le sang périphérique humain par Asahara et al. En 1997 2 portant une perfusion de nouvelles hypothèses et les stratégies de régénération et de réparation vasculaire. EPC sont des éléments rares, mais normale de la circulation du sang qui abrite des sites de formation de vaisseaux sanguins ou le remodelage vasculaire, et de faciliter soit la vasculogenèse postnatale, l&#39;angiogenèse, ou artériogenèse largement via la stimulation paracrine de paroi de la cuve existante cellules dérivées 3. Aucun marqueur spécifique pour identifier un CBE a été identifié, et à l&#39;heure actuelle l&#39;état du champ est de comprendre que de nombreux types cellulaires, y compris pro-angiogénique souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices, les cellules circulantes angiogéniques, Tie2 + de monocytes, cel progéniteur myéloïdels, les macrophages tumorales associées, et M2 macrophages activés participer à stimuler le processus angiogénique dans une variété de précliniques systèmes de modèles animaux et chez des sujets humains dans plusieurs états pathologiques 4, 5. Cellules endothéliales formant colonie (CPEF) sont rares en circulation des cellules endothéliales viables caractérisés par robuste potentiel prolifératif clonale, une colonie secondaire et tertiaire à la capacité à former des replacage, et sa capacité à former intrinsèque dans les vaisseaux in vivo sur la transplantation dans des souris immunodéficientes 6-8. Alors que CPEF ont été isolées avec succès à partir du sang périphérique de sujets adultes en bonne santé, le sang du cordon ombilical (CB) de la santé des nouveau-nés, et paroi de la cuve de nombreux humains vaisseaux artériels et veineux 6-9, CB possède la plus grande fréquence des CPEF 7 que l&#39;affichage le plus robuste possible clonale proliférative et la forme des vaisseaux sanguins durables et fonctionnelle in vivo 8, 10-13. Alors que la dérivation deECFC à partir du sang périphérique adulte a été présenté 14, 15, ici, nous décrivons les méthodes pour la dérivation, le clonage, l&#39;expansion, et in vitro ainsi que dans la caractérisation in vivo de CPEF du cordon ombilical humain CB.

Cellules endothéliales formant colonie (CPEF) sont les cellules endothéliales circulantes avec robuste potentiel prolifératif clonal qui affichent intrinsèque<em&gt; In vivo</emNavire&gt; capacité à former des. La caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules endothéliales provenant de excroissance CB est important d&#39;identifier et d&#39;isoler<em&gt; De bonne foi</em&gt; CPEF pour l&#39;application clinique potentielle de réparation des tissus endommagés.

Caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules endothéliales formant colonie dérivés du sang de cordon ombilical humain

Les conceptions établies concernant la formation de nouveaux vaisseaux sanguins via l'angiogenèse, la vasculogenèse et l'artériogenèse ont récemment fait l'objet d'une revue1. La présence de ...

L'objectif général de cette procédure est d'expliquer comment obtenir des cellules formant des colonies endothéliales, ou eCFCs, à partir de sang de cordon ombilical humain. Cette obtention s'effectue en premier lieu en ensemencant des cellules mononucléées provenant du sang de cordon ombilical, puis en clonant et en amplifiant les colonies issues des eCFCs. La deuxième étape consiste à caractériser les cellules in vitro à l'aide d'une nouvelle technique d'essai monocellulaire permettant d'évaluer leur potentiel prolifératif clonal.Enfin, les cellules sont caractérisées au moyen d'un test de formation de vaisseaux in vivo, par la production et l'implantation de gels contenant des CFC-E chez des souris nod skid. En définitive, la formation in vivo de nouveaux vaisseaux remplis de sang de l'hôte peut être évaluée par une coloration à l'hématoxyline et à l'éosine des implants cellulaires contenant des CFC-E. Le principal avantage de ces techniques par rapport aux méthodes existantes réside dans leur capacité à examiner le potentiel prolifératif des cellules endothéliales au niveau de la cellule unique.Les implications de cette technique pourraient être étendues à la recherche d'outils diagnostiques et thérapeutiques pour des maladies telles que la maladie artérielle périphérique ou PAD, car cette technique nous permet d'examiner le potentiel prolifératif et la capacité génique des cellules endothéliales d'un patient. Avant de commencer la procédure, ajoutez un millilitre de collagène de queue de rat, de type I, dans chaque puits d'une plaque de culture tissulaire à six puits, puis incubez la plaque toute la nuit le jour de la procédure. Aliquotez le sang de cordon en unités de 15 millilitres dans des tubes coniques de centrifugeuse de 50 millilitres. Ajoutez ensuite 20 millilitres de PBS à chaque tube et pipetez le mélange plusieurs fois vers le haut et vers le bas.Ensuite, prélevez 15 millilitres de Ficoll-Paque™ dans une pipette, placez l'embout de la pipette au fond du tube contenant le sang dilué et superposez délicatement le Ficoll-Paque™ en dessous du sang. Centrifugez les tubes pendant 30 minutes à 740 × g à température ambiante, sans utiliser le frein de décélération. Après la séparation des cellules, utilisez une pipette de transfert pour retirer la couche trouble de cellules mononucléées à faible densité située à l'interface entre le Ficoll-Paque™ et le plasma dilué. Transférez les cellules recueillies dans un tube conique de 50 millilitres contenant 10 millilitres de milieu EGM-2™ et centrifugez les cellules mononucléées pendant 10 minutes à 515 × g à température ambiante, en utilisant le réglage de frein de décélération élevé. Aspirez soigneusement et jetez le surnageant.Ensuite, après avoir lavé deux fois les cellules en culot avec l'EGM, resuspendez les cellules mononucléées dans l'EGM à raison de 1,25 × 10⁷ cellules par millilitre. Ajoutez maintenant à l’aide d’une pipette 4 millilitres de la suspension de cellules mononucléées dans chaque puits de la plaque revêtue de collagène et incubez les cellules jusqu’à la formation de colonies le premier jour. Après l’incubation, retirez lentement le milieu usé des puits à l’aide d’une pipette, sans perturber les cellules faiblement adhérentes.Ensuite, ajoutez soigneusement quatre millilitres de E GM deux dans les puits et remettez la plaque dans l'incubateur. Des colonies apparaissent généralement entre le cinquième et le quatorzième jour, la veille de la procédure. À 50 microlitres de collagène de queue de rat.Placer un type dans chaque puits d'une plaque 96 puits comme précédemment et incuber la plaque toute la nuit le jour de la procédure. Commencer par laver deux fois les cellules ayant été passagées seulement deux à trois fois avec du PBS. Après avoir aspiré le dernier lavage de PBS, placer un cylindre de clonage stérile recouvert de gel autour de chaque colonie, en appuyant fermement chaque cylindre contre la plaque à l’aide de pinces stériles.Ajoutez deux à trois gouttes de milieu triple E chaud dans chaque cylindre de clonage et incubez les cylindres pendant trois à cinq minutes, jusqu'à ce que les cellules commencent à se détacher. Une fois que les cellules ont commencé à se détacher, ajoutez environ 250 microlitres de milieu EGM deux au centre du cylindre et pipetez plusieurs fois vers le haut et vers le bas afin d'obtenir une suspension monocellulaire. Transférez ensuite séparément la suspension monocellulaire provenant de chaque cylindre de clonage dans un tube microcentrifuge individuel.Infectez les cellules dans une plaque de six puits avec des lentivirus exprimant EGFP et récupérez les cellules exprimant EGFP par cytométrie de flux fluorescente. Incubez ensuite les cellules positives pour EGFP et EGM deux dans des plaques revêtues de collagène. Lorsque les CFC-EC sont prêts, collectez-les en utilisant Trip E Express comme vient d'être démontré et resuspendez les cellules dans le milieu EGM deux à une concentration finale d'environ 10⁶ cellules par millilitre.Ensuite, à l’aide d’un trieur à flux avec un débit faible de 20 cellules par seconde, trier une seule cellule ECFC positive pour EGP par puits dans la plaque de 96 puits préalablement préparée et revêtue de collagène, puis ajuster le volume final de chaque puits à environ 200 microlitres par puits avec le milieu EGM deux. Ensuite, utiliser un microscope à fluorescence inversé pour s’assurer que chaque puits contient une seule cellule. Incuber la plaque pendant une période de deux semaines avec deux changements de milieu au jour 14 de la culture.Lavez chaque puits avec 100 microlitres de PBS avant de fixer les cellules avec 100 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 minutes. Pour les CFC qui n'expriment pas l'EGFP, ajoutez le réactif cyt, un colorant nucléaire fluorescent vert, après la fixation au paraformaldéhyde et incubez à quatre degrés Celsius toute la nuit. Utilisez un microscope à fluorescence pour quantifier visuellement le nombre de cellules endothéliales étendues comme indiqué ici : les puits présentant un nombre de cellules endothéliales compris entre deux et 50 sont considérés comme des agrégats de cellules endothéliales.Les puits contenant de 51 à 2000 cellules correspondent à des CFC à potentiel prolifératif faible et ceux contenant 2001 cellules ou plus sont considérés comme des CFC à potentiel prolifératif élevé. Après avoir détaché les cellules avec la triple E comme précédemment indiqué, déterminer le nombre de cellules viables de la culture cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre et du bleu de trypan. Transférer 2,4 millions de cellules viables dans un tube conique de 50 millilitres, puis former un culot cellulaire par centrifugation pendant que les cellules sédimentent.Mélangez soigneusement les composants de la matrice de gel, puis ajustez le pH à 7,4 à l’aide d’hydroxyde de sodium tout en maintenant la solution sur de la glace. Après avoir éliminé le surnageant, resuspendez le culot dans 360 microlitres de e GM deux tiède. Ajoutez ensuite 840 microlitres de la solution de matrice de gel aux cellules et mélangez délicatement la solution jusqu’à ce que les cellules soient complètement suspendues dans le gel. Transférez cette suspension de gel cellulé de un millilitre dans un puits d’une plaque de culture de tissus à 12 puits et incubez la plaque jusqu’à ce que le gel polymérise.Ensuite, avant une incubation nocturne, recouvrez délicatement le gel avec deux millilitres de milieu EGM-2 tiède le lendemain, et ce immédiatement avant l'implantation. Utilisez des ciseaux à iris pour disséquer le gel en deux morceaux égaux et remettez les fragments de gel dans le même puits de culture contenant le milieu EGM-2. Après avoir confirmé la sédation par une pincée du orteil, rasez l'abdomen inférieur d'une souris nod, skid anesthésiée âgée de cinq à six semaines, puis nettoyez soigneusement le site chirurgical à l’aide de compresses imbibées d’alcool et de bétadine, en effectuant des rotations.Ensuite, utilisez des ciseaux iris stériles et tranchants pour pratiquer une incision d'environ cinq millimètres dans le quadrant inférieur de l'abdomen, exposant l'espace sous-cutané situé entre la peau et le muscle abdominal. Disséquez par technique contondante la couche dermique du muscle abdominal en deux régions différentes de l'abdomen afin de créer des poches larges de 15 à 20 millimètres, l'une s'étendant supérieurement vers le quadrant abdominal supérieur et l'autre vers une autre zone de l'abdomen. Puis soulevez la couche dermique juste à côté de l'incision.Insérez une moitié du gel dans une poche abdominale, et l'autre moitié du gel dans l'autre poche abdominale. Une fois les gels insérés, fermez chaque incision par deux à trois points de suture à l’aide de sutures en polypropylène 5-0 montées sur une aiguille coupante. Étiquetez les cartes des cages et effectuez la surveillance postopératoire ainsi que l’administration d’antalgiques conformément aux exigences institutionnelles et au protocole.Après avoir sacrifié l'animal au jour 14 après l'implantation, passez un tampon imbibé d'alcool sur l'abdomen de la souris et incisez la peau suivant la ligne de l'incision initiale. Ensuite, excisez des lambeaux de peau situés à l'emplacement probable des gels. Effectuez des incisions circulaires autour des gels pour retirer chaque implant, puis placez les implants excisés dans le fixateur au zinc.En utilisant cette technique de dérivation des CEFC, nous avons observé une prolifération formant des colonies primaires dès le cinquième jour. Remarquez la morphologie en pavé caractéristique de ces cultures de CEFC au jour cinq, indiquée par les flèches. Les colonies étendues expriment des antigènes endothéliaux, mais n'expriment pas d'antigènes hématopoïétiques.Comme le montre cette évaluation phénotypique in vitro représentative des cellules endothéliales et hématopoïétiques, l'immunophénotypage a révélé que les CFC-E expriment des antigènes endothéliaux tels que CD31, CD34, CD144, CD146, FL1, Flk1, Flt4 et NRP2, mais n'expriment pas d'antigènes hématopoïétiques, tels que CD45, CD14, CD11b, c-Kit, CXCR4 ou CD133. Importamment, comme illustré dans ce graphique en barres, les colonies expansées présentent une hiérarchie complète de potentiel prolifératif clonal au niveau de la cellule unique, allant de groupes de deux à 50 cellules jusqu’à des colonies de plus de 2001 cellules. Ces microphotographies de colonies marquées avec le Cyt, un colorant nucléaire fluorescent vert, ont été obtenues après culture de CFC-E issues de sang de cordon à l’échelle de la cellule unique pendant 14 jours.De plus, les CFC forment des vaisseaux sanguins humanisés perfusés avec des globules rouges de l'hôte lorsqu'ils sont implantés chez des souris immunodéficientes. Dans cette coloration hématoxyline-éosine d'implants de gel CELLULARIZE contenant des CFC issues du sang de cordon, on peut observer des microvaisseaux remplis de globules rouges de l'hôte, formés dans le gel de collagène-fibronectine après 14 jours d'implantation. Ici, la coloration brune anti-CD31 humain confirme davantage l'origine humaine de ces vaisseaux.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler les CFC-E à partir de sang de cordon ombilical humain, ainsi que comment cloner, amplifier et caractériser la fonctionnalité des colonies de CFC-E après leur développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs en endothélium vasculaire pour explorer le potentiel prolifératif clonal et la capacité génique des cellules endothéliales provenant de multiples sources.

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Cellules endothéliales progénitrices formant colonie (CPEF) sont un outil prometteur pour étudier l'homéostasie vasculaire et de réparation.

L&#39;isolement et expansion à grande échelle des cellules adultes humaines Colony Forming progénitrices endothéliales

Ce protocole décrit l'isolement et à l'expansion ultérieure des cellules stromales mésenchymateuses et les cellules endothéliales formant colonie sans l'utilisation de sérum animal pour générer des paires autologues à des fins de transplantation expérimentale.

Isolement et animale expansion sans sérum du cordon ombilical humain dérivé cellules stromales mésenchymateuses (CSM) et des cellules endothéliales progénitrices Colony Forming (CPEF)

Les cellules formant colonie (CFC) de dosage est un dosage in vitro dans les progéniteurs hématopoïétiques, qui forment des colonies dans un milieu semi-solide. Une combinaison de la morphologie des colonies, la morphologie cellulaire et la cytométrie de flux sont utilisés pour évaluer la capacité des progéniteurs à proliférer et se différencier ainsi les différentes lignées hématopoïétiques.

Colonie de cellules de formage (CFC) Dosage pour les cellules hématopoïétiques humaines

Ce protocole permet la génération et la caractérisation fiables de cellules endothéliales de croissance sanguine (BOEC) à partir d’un petit volume de sang périphérique adulte. Les BOEC peuvent être utilisés comme substitut des cellules endothéliales de patients atteints de troubles vasculaires et comme substrat pour la génération de cellules souches pluripotentes induites.

Génération et de la Culture du sang excroissance des cellules endothéliales de sang périphérique humain

cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) proviennent de (hemogenic) des cellules endothéliales spécialisées au cours du développement, mais on sait peu sur le processus par lequel certaines cellules endothéliales spécifient pour devenir la formation du sang. Nous démontrons une méthode basée sur la cytométrie de flux permettant l'isolement simultané des cellules endothéliales hemogenic et HSPC de tissus embryonnaires murines.

Isolement des cellules embryonnaires murines Hemogenic endothéliales

Ce protocole vise à isoler les cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical. Parmi les applications incluent l’utilisation de ces cellules comme biomarqueur pour identifier les patients à risque cardiovasculaire, traitement des maladies ischémiques, et constructions de création valve tissulaire cardiaque et vasculaire.

Isolement des cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical humain

Ici, nous présentons un protocole pour former précisément l'endothélium hémogène à partir de cellules souches pluripotentes humaines dans une condition sans mangeoire et sans xéno. Cette méthode aura de larges applications dans la modélisation des maladies et le dépistage des composés thérapeutiques.

Différenciation hémogénique de l'endothélium par des cellules souches pluripotentes humaines dans une condition définie sans mangeoire et sans xéno

Ici, nous présentons un protocole pour la caractérisation immunophenotypic et la différenciation induite par cytokine du sang de cordon dérivé CD34- cellules hématopoïétiques de tige et progénitrice aux quatre lignées myéloïdes. Les applications de ce protocole comprennent des études sur l'effet des mutations de la maladie myéloïde ou de petites molécules sur la différenciation myéloïde descellules CD34.

Différenciation pan-myéloïde du sang de cordon humain Dérivé CD34- Cellules hématopoïétiques de tige et progénitrice

Le système d'analyse sphéroïque de co-culture tridimensionnaux est conçu pour imiter l'angiogenèse physiologique. Les sphéroïdes de co-culture sont formés par deux précurseurs de cellules vasculaires humaines, Les ECFC et les MSC, et incorporés dans le gel de collagène. Le nouveau système est efficace pour évaluer les modulateurs angiogéniques, et fournit des informations plus pertinentes à l'étude in vivo.

Système d'analyse d'angiogenèse tridimensionnel utilisant des sphéroïdes de co-culture formés par des cellules de formation de colonies endothéliales et des cellules souches mésenchymales

Présenté ici est un protocole simple pour la différenciation dirigée des cellules endothéliales hémogènes à partir de cellules souches pluripotentes humaines en environ 1 semaine.

Différenciation dirigée de cellules endothéliales hémogéniques à partir de cellules souches pluripotentes humaines

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, ...

Caractérisation des cellules endothéliales de croissance sanguine (BOEC) à partir du sang périphérique porcin

Découvrez comment dériver et caractériser les cellules endothéliales formant colonie (ECFC) à partir de sang de cordon ombilical humain. Cette méthode permet d'évaluer leur potentiel prolifératif clonal et leur capacité de formation vasculaire in vivo.

Caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules endothéliales formant colonie dérivés du sang de cordon ombilical humain (Vidéo) | JoVE Journal

Caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules endothéliales formant colonie dérivés du sang de cordon ombilical humain

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