Name: Sur la puce isotachophorèse pour la séparation des ions et purification des acides nucléiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Découvrez l'isotachophorèse sur puce pour la séparation d'ions et la purification d'acides nucléiques. Cette technique électrocinétique permet la préconcentration d'analytes et l'extraction sélective d'ADN et d'ARN.

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<li>Persat, A., Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+nucleic+acids+from+whole+blood+using+isotachophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification of nucleic acids from whole blood using isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 81 (22), 9507-9507 (2009).</li>
<li>Bercovici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+urinary+tract+infections+using+isotachophoresis+and+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of urinary tract infections using isotachophoresis and molecular beacons.</a> Anal. Chem. 83 (11), 4110-4110 (2011).</li>
<li>Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+DNA+from+malaria-infected+erythrocytes+using+isotachophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Extraction of DNA from malaria-infected erythrocytes using isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 83 (24), 9715-9715 (2011).</li>
<li>Persat, A., Chambers, R. D., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+principles+of+electrolyte+chemistry+for+microfluidic+electrokinetics.+Part+I%3A+Acid-base+equilibria+and+pH+buffers%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Basic principles of electrolyte chemistry for microfluidic electrokinetics. Part I: Acid-base equilibria and pH buffers.</a> Lab Chip. 9 (17), 2437-2437 (2009).</li>
<li>Garcia-Schwarz, G., Bercovici, M., Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+dispersion+in+isotachophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Fluid+Mech%22%5BJournal%5D)">Sample dispersion in isotachophoresis.</a> J. Fluid Mech. 1 (1), 1-1 (2011).</li>
<li>Kohlrausch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%C3%9Cber+concentrations-verschiebungen+durch+electrolyse+im+inneren+von+l%C3%96sungen+und+l%C3%96sungsgemischen%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Phys%22%5BJournal%5D)">Über concentrations-verschiebungen durch electrolyse im inneren von lÖsungen und lÖsungsgemischen.</a> Ann. Phys. 298 (10), 209-209 (1897).</li>
<li>Alberty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+boundary+systems+formed+by+weak+electrolytes.+Theory+of+simple+systems+formed+by+weak+acids+and+bases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Moving boundary systems formed by weak electrolytes. Theory of simple systems formed by weak acids and bases.</a> J. Am. Chem. Soc. 72 (6), 2361-2361 (1950).</li>
<li>Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphasic+zone+electrophoresis.+I.+Steady-state+moving-boundary+systems+formed+by+different+electrolyte+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Multiphasic zone electrophoresis. I. Steady-state moving-boundary systems formed by different electrolyte combinations.</a> Biochem. 12 (5), 871-871 (1973).</li>
<li>Persat, A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+by+simultaneous+selective+isotachophoresis+and+hybridization+with+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling by simultaneous selective isotachophoresis and hybridization with molecular beacons.</a> Anal. Chem. , (2011).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Les méthodes présentées ici ITP permettre la détection rapide, sensible et robuste et la manipulation des molécules ioniques. Le principal défi dans l&#39;utilisation de PTI est un choix approprié de tampons LE et TE. Dans le PTI anionique, nous choisissons généralement que l&#39;anion chlorure de premier plan, car il est un acide fort avec une mobilité absolue très élevée et donc a des propriétés très prévisibles. Par conséquent, le choix de mémoire tampon dans anionique ITP est généralement réduit à choisir un bon TE et contre-ion. Pour sélectifs des expériences axées, le choix TE est essentiel à l&#39;exclusion de contamination des ions. Dans les applications où les contaminants ne sont pas présents, inférieure TE mobilité efficace accélère le taux de mise au point. Nous vous recommandons d&#39;utiliser ce qui suit, relativement bien comportés-anioniques ions TE: MES, MOPS, HEPES, tricine. Choix de contre-ion affecte à la fois le pH du système et TE de mobilité efficace. Contre-courants sont tris (pKa 8,1) et de bis-tris (pKa 6,4). Pour les essais nécessitant un pH inférieur ou supérieur, nous vous recommandons la pyridine (pKa 5,25) etéthanolamine (pKa 9,5), respectivement. Dans les tableaux 1 et 2, pour le PTI anioniques et cationiques, respectivement, nous résumons plusieurs exemples de tampons utiles. Nous prenons HCl comme l&#39;ion anionique LE et de sodium comme ions cationique LE, et nous n&#39;assumons 100 mm Résistance ionique du tampon LE. Le lecteur notera que la force ionique du tampon dans nos protocoles (et dans les tableaux 1-2) est toujours supérieure ou égale à 10 mM. Si, en théorie de la physique des ITP s&#39;applique à une force ionique inférieure à 10 mM, contaminants naturels (par exemple l&#39;acide carbonique provenant de la réaction entre l&#39;eau et du dioxyde de carbone atmosphérique) près du niveau 1 mM limitent souvent l&#39;utilisation pratique de faibles tampons de force ionique. Nous notons que le mécanisme de transduction du signal ne se limite pas aux essais présentés dans ce protocole. Comme nous l&#39;avons brièvement dans la partie 5, en mode plateau purifié zones peuvent être détectées par les changements de conductivité locale, ABSORPTION UVBance, la température, ou d&#39;un indice de réfraction. Dans notre propre groupe, nous avons développé une méthode qui utilise des ampholytes porteurs fluorescents pour la détection sensible et l&#39;identification des analytes inconnus. 5 Dans des expériences de mode de pointe, des sondes spécifiques peuvent être utilisés pour étiqueter les analytes ciblés. Dans un exemple, nous utilisons des balises moléculaires - des sondes oligonucléotidiques qui sont fluorescents lors de l&#39;hybridation à leur séquence cible - pour détecter l&#39;ADN cible ou des molécules d&#39;ARN avec une grande spécificité 11,18. Bien que le PTI est relativement robuste à la dispersion causée par la pression axée débit et EOF, EOF excessive peut conduire à la stagnation de l&#39;interface ITP, où la vitesse moyenne EOF devient égale à la vitesse ITP 14. EOF Cette forte se produit surtout dans des conditions de pH élevé et la force ionique faible. Pour cette raison, nous recommandons l&#39;utilisation de tampons avec un pH de 8 ou moins, et avec la force ionique de l&#39;ordre de 100 mm si commode. Dans notre expérience, PVP est leplus de revêtement efficace pour la suppression EOF en jetons de borosilicate. Toutefois, en raison de ses propriétés de tamisage, le PVP peut ne pas être approprié pour certaines applications, telles que se concentrer l&#39;ADN génomique. Dans les expériences, nous observons que l&#39;ajout de PVP peut réduire considérablement la mobilité ADN génomique absolue (au point où il ne se concentre pas). Dans ces cas, un revêtement silanol tels que Sigmacote en conjonction avec un agent tensio-actif (par exemple Triton X-100) peut également être efficace dans la réduction de EOF 10. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Anion TE (pKa -1) </td></tr><tr><td> Contre-ion tampon (pKa +1) </td><td> MES (6,10) </td><td> MOPS (7,20) </td><td> HEPES (7,50) </td><td> tricine (8.15) </td></tr><tr><td> éthanolamine (9.50) </td><td> 21,41 </td><td> 20,40 </td><td> 17,38 </td><td> 22,85 </td></tr><tr><td> tris (8,08) </td><td> 21,00 </td><td> 19,23 &lt;/ Td&gt; <td> 15,84 </td><td> 17,56 </td></tr><tr><td> bis-tris (6,40) </td><td> 18,22 </td><td> 10,41 </td><td> 7,30 </td><td> 5,23 </td></tr><tr><td> pyridine (5.18) </td><td> 1,01 </td><td> 3,72 </td><td> 2,42 </td><td> 1,48 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. L&#39;ampleur de mobilité effective (× 10 -9 m 2 / V / s) de la zone analyte pure corrigée dans ITP anionique où la LE est de 100 mm et 200 contre-HCl tampon mM. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Cation TE (pKa +1) </td></tr><tr><td> Contre-ion tampon (pKa -1) </td><td> éthanolamine (9.50) </td><td> tris (8,08) </td><td> bis-tris (6,40) </td><td> pyridine (5.18) </td></tr><tr><td> MES (6,10) </td><td> 35,57 </td><td> 21,96 </td><td> 16,39 </td><td> 10,45 </td></tr><tr><td> MOPS (7.20) </td><td> 35,47 </td><td> 20,92 </td><td> 9,76 </td><td> 3,93 </td></tr><tr><td> HEPES (7,50) </td><td> 35,35 </td><td> 19,97 </td><td> 7,77 </td><td> 2,88 </td></tr><tr><td> Tricine (8.15) </td><td> 34,77 </td><td> 16,72 </td><td> 4,50 </td><td> 1,44 </td></tr></tbody></table> Tableau 2. L&#39;ampleur de mobilité effective (× 10 -9 m 2 / V / s) de la zone analyte pure corrigée dans ITP cationique où le LE est de 100 mM de sodium et 200 mM tampon contre-ion.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> REACTIFS </td></tr><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> L&#39;eau distillée </td><td> GIBCO </td><td> 10977 </td><td> RNase / DNase </td></tr><tr><td> Clorox Ultra </td><td> Clorox </td><td> 02489CT </td><td></td></tr><tr><td> l&#39;hydroxyde de sodium (NaOH) </td><td> Mallinckrodt </td><td> 7708 </td><td></td></tr><tr><td> de l&#39;acide chlorhydrique (HCl) </td><td> EMD Chemicals </td><td> HX0603-4 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma de base (tris) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> polyvinylpyrrolidone (PVP) </td><td> Polysciences Inc </td><td> 06067 </td><td> MW 1000000 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 d&#39;acide carboxylique </td><td> Invitrogen </td><td> A20000 </td><td></td></tr><tr><td> tricine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T-9784 </td><td></td></tr><tr><td> bis-tris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4429 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> AM9260G </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> lysozyme </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6876 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green II </td><td> Invitrogen </td><td> S7564 </td><td></td></tr><tr><td> éthanolamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 411000 </td><td></td></tr><tr><td> Rhodamine 6G </td><td> Acros Organics (Geel, Belgique) </td><td> CAS 989-38-8 </td><td></td></tr><tr><td> L-aminoacides </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> LAA21 </td><td></td></tr><tr><td> Puissance SYBR Green ARN-to-C T 1-Step Kit </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4389986 </td><td></td></tr><tr> &lt;td&gt; amorces de PCR </td><td> Integrated DNA Technologies </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> ÉQUIPEMENT </td></tr><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Borosilicate puce microfluidique </td><td> Caliper Life Sciences Inc </td><td> NS12A </td><td> Livré avec ou sans plastique caddy </td></tr><tr><td> Pompe à vide </td><td> Gast </td><td> DOA-P104-AA </td><td></td></tr><tr><td> SourceMeter </td><td> Keithley </td><td> 2410 </td><td> Constant courants et constants modes de fonctionnement de tension </td></tr><tr><td> Microscope inversé à épifluorescence </td><td> Olympe </td><td> IX70 </td><td> Utilisez lampe au mercure (Olympus) ou LED (Thorlabs) pour l&#39;éclairage </td></tr><tr><td> Filtre cube </td><td> Oméga </td><td> XF115-2 </td><td> Excitation / émission: bleu / vert </td></tr><tr><td> Coffre-fort-Verrouiller microtubes </td><td> Eppendorf </td><td> 022363204 </td><td> Une capacité de 1,5 mL </td></tr><tr><td> Centrifuger </td><td> Eppendorf </td><td> 5417C </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 3. Réactifs et équipements spécifiques.

sur la puce isotachophorèse pour la séparation des ions et purification des acides nucléiques

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Techniques électrocinétiques sont un aliment de base des applications à micro-en raison de leur capacité unique d&#39;effectuer une variété de processus fluidiques et électrophorétique dans des systèmes simples et compacts sans pièces mobiles. Isotachophorèse (PTI) est une technique simple et très robuste qui peut atteindre électrocinétique de séparation 1,2 million de fois préconcentration et efficace et d&#39;extraction basée sur la mobilité ionique. 3 Par exemple, nous avons démontré l&#39;application du PTI à la séparation et la détection sensible de non marqué molécules ioniques (par exemple les toxines, de l&#39;ADN, d&#39;ARNr, miRNA) avec peu ou pas de préparation de l&#39;échantillon 4-8 et à l&#39;extraction et la purification des acides nucléiques à partir des matrices complexes, y compris la culture cellulaire, de l&#39;urine et le sang. 9-12 PTI réalise focalisation et de séparation utilisant un champ électrique appliqué et deux tampons de canal dans un système fluidique. Pour les analytes anioniques, le premier électrolyte (LE) tampon est choisi sette que ses anions ont une plus grande mobilité électrophorétique effective que les anions de l&#39;électrolyte de fuite (TE) du tampon (mobilité efficace décrit la vitesse de dérive observable d&#39;un ion et prend en compte l&#39;état d&#39;ionisation de l&#39;ion, tel que décrit en détail par Persat et al . 13). Après l&#39;établissement d&#39;une interface entre les électrodes en tungstène et LE, un champ électrique est appliqué de telle sorte que les ions LE s&#39;éloigner de la région occupée par des ions TE. Ions de l&#39;échantillon de la race la mobilité efficace intermédiaire avant d&#39;ions TE, mais ne peut pas dépasser ions LE, et aussi ils se concentrent à l&#39;interface LE-TE (ci-après dénommé l &#39;«interface ITP&quot;). En outre, le TE et les zones de formulaire de la conductivité LE respectivement basse et haute, qui établissent un gradient de champ raide électrique à l&#39;interface ITP. Ce gradient de champ des pré-espèces des échantillons car ils se concentrent. Le bon choix des résultats TE et LE dans la focalisation et la purification des espèces cibles à partir d&#39;autres non-ciblées espèces et, finalement, la séparation uneségrégation des espèces d-échantillon. Nous revoyons ici le PTI physique principes qui sous-tend et de discuter de deux modes de fonctionnement: standard &quot;de pointe&quot; et &quot;plateau&quot; modes. En mode de pointe, relativement diluée ions de l&#39;échantillon se concentrer ensemble au sein de chevauchement des pics étroits à l&#39;interface ITP. En mode plateau, ions de l&#39;échantillon plus abondantes atteindre une concentration en régime permanent et séparer en adjacentes plateau-comme zones ordonnées par leur mobilité efficace. Modes de pointe et le plateau se posent sur les mêmes sous-jacents de physique, mais représentent des régimes distincts différenciés par la concentration de l&#39;analyte initiale et / ou la quantité de temps alloué pour l&#39;accumulation de l&#39;échantillon. Nous avons d&#39;abord décrire en détail une expérience en mode modèle de pointe et alors démontrer un essai en mode de pointe pour l&#39;extraction des acides nucléiques à partir de E. la culture de cellules Escherichia. Nous concluons en présentant une analyse en mode plateau, où nous utilisons un non-focalisation traceur (NFT) espèces de visualiser la séparation et parformer quantification d&#39;acides aminés.

Isotachophorèse (PTI) est une séparation solide électrocinétique et de la technique de préconcentration avec des applications allant de la détection de la toxine à la préparation des échantillons. Nous passons en revue les principes physiques de l&#39;ITP et la méthodologie de l&#39;application de cette technique à deux exemples d&#39;applications spécifiques: la séparation et la détection de petites molécules et de purification des acides nucléiques à partir de lysat de culture cellulaire.

Sur la puce isotachophorèse pour la séparation des ions et purification des acides nucléiques

Les techniques électrocinétiques sont fondamentales pour les applications à microéchelle en raison de leur capacité unique à réaliser une variété de manipulations fluidiques et électrophorétiques...

L'objectif général de cette vidéo est de présenter une technique électrocinétique appelée isotachophorèse, abrégée en ITP, ainsi que ses applications microfluidiques pour la détection et la séparation sensibles d'ions. Premièrement, les principes physiques sous-jacents à l'ITP sont abordés, ainsi que les deux modes standard de fonctionnement, à savoir le mode pic et le mode plateau. L'ITP sur puce est ensuite démontrée à travers trois expériences, en commençant par un protocole simple de préconcentration d'échantillon, où des Fluor fours sont détectés en les focalisant dans un pic net. Deuxièmement, un dosage par ITP utilisé pour la préparation d'échantillons sur puce est présenté, dans lequel l'ADN et l'ARN sont extraits sélectivement à partir d'un lysat de cellules bactériennes.Enfin, un dosage de détection sans marquage est utilisé pour purifier et quantifier les acides aminés à l'aide de l'ITP en mode plateau. En définitive, la purification des acides aminés, la préconcentration d'analytes et l'extraction sélective des acides nucléiques peuvent être réalisées par ITP. Aujourd'hui, nous allons vous présenter les principes physiques et la méthodologie d'une technique électrocinétique polyvalente appelée Isot Apheresis.Notre équipe a été pionnière dans les méthodes de TIP pour la détection sans marquage, la préparation des échantillons et les tests d'hybridation rapides. Nous allons vous présenter trois tests représentatifs qui illustrent la capacité de la TIP à préconcentrer les analytes, extraire les acides lytiques, et purifier ainsi que détecter les acides aminés. Ces tests mettent en évidence la polyvalence de la TIP et démontrent les étapes simples nécessaires pour garantir des expériences reproductibles.Dans le laboratoire. Dans l'échantillon ITP, les ions se concentrent sélectivement à l'interface entre un électrolyte principal et un électrolyte de suivi, abrégés respectivement en LE et TE. Les ions de l'échantillon se déplacent à travers le microcanal à une vitesse constante déterminée par la vitesse des ions principaux.Les ions de l'échantillon se concentrent si leur mobilité électrophorétique effective est encadrée par la mobilité des ions de l'électrolyte de départ (LE) et de l'électrolyte de terminaison (TE), la mobilité étant définie comme le rapport entre la vitesse de dérive de l'ion et le champ électrique local. Les ions de l'échantillon mélangés au TE se déplacent plus rapidement que les ions de TE environnants et s'accumulent donc à l'interface LE-TE. En outre, l'interface de la focalisation isotachophorétique (ITP) s'affine spontanément : les ions LE, qui pourraient diffuser dans la zone TE, subissent un flux de rappel intense et retournent vers la zone frontale. Il en va de même pour les ions TE présents dans la zone LE.Les propriétés d'auto-affûtage et de focalisation de l'I two P contribuent à la robustesse de cette technique et la rendent insensible aux perturbations à l'interface, telles que l'écoulement induit par la pression. En mode pic, les concentrations ioniques de l'échantillon sont nettement inférieures à celles des ions LE et TE. Par conséquent, les ions de l'échantillon contribuent de façon négligeable à la conductivité locale dans ces conditions.Plusieurs analytes se concentrent dans la région de l'interface ITP, formant principalement des pics superposés. Éventuellement, les ions de l'échantillon peuvent atteindre une concentration suffisamment élevée pour se séparer et se concentrer en mode plateau. En mode plateau, les ions de l'échantillon se séparent et s'isolent en zones de concentration localement uniforme et constante, dans un ordre déterminé par leur mobilité électrophorétique.Les ions en mode plateau déterminent la conductivité locale. Des ions très dilués peuvent encore se concentrer en mode pic entre les zones de plateau. Pour les dosages présentés dans ce protocole, une puce microfluidique en verre gravée isotropiquement par voie humide et présentant une conception de canal en croix est utilisée.Cependant, l'ITP peut également être réalisée dans des canaux ou des capillaires droits simples, sans intersections ni jonctions. La procédure de nettoyage suivante doit être effectuée avant les expériences afin d'assurer une reproductibilité d'un essai à l'autre et une application réussie des revêtements dynamiques utilisés pour supprimer l'écoulement électro-osmotique. Pour décontaminer le canal, remplissez les réservoirs nord, est et sud avec 10 à 20 microlitres de solution d'eau de Javel à 10 %.Si l'on utilise un support de puce à cales standard, fixer l'extrémité large d'une pipette de 200 microlitres au réservoir ouest de la puce et relier la ligne de vide à un tube de deux millimètres de diamètre intérieur. Appliquer un vide pendant deux minutes, puis vider les réservoirs et les nettoyer soigneusement en remplissant les réservoirs avec de l'eau désionisée et en les vidant à l'aide de la ligne de vide. Effectuer plusieurs fois le rinçage avec de l'eau DI.Répétez ce processus avec de l'hydroxyde de sodium à une molaire. Les surfaces des canaux seront légèrement gravées, produisant une surface propre en verre borosilicaté qui permettra d'établir des propriétés de surface uniformes. Nettoyez les réservoirs avec de l'eau DI, puis rincez les canaux avec du le.Pendant cette période, les propriétés de surface et les revêtements dynamiques atteindront un équilibre au sein des canaux. Pour commencer l'expérience, préparez un millilitre d'électrolyte frontal et un millilitre d'électrolyte de queue. Ensuite, mélangez 90 microlitres de TE avec 10 microlitres d'une solution micromolaire.Alexa Fluor 4 88. Après avoir rincé avec le réservoir vide, rincez plusieurs fois le réservoir avec de l’eau distillée afin de diluer fortement tout LE restant dans le réservoir. Enfin, remplissez ce réservoir avec 20 microlitres de TE contenant le colorant.Placer l'électrode positive dans le réservoir est et l'électrode de masse ou négative dans le réservoir ouest, puis appliquer un courant constant de deux microampères. Le pic d'échantillon migrera à une vitesse constante et la tension entre les réservoirs augmentera à mesure que le tampon TE, de conductivité plus faible, les remplit. Les acides nucléiques présents dans un lysat cellulaire non traité peuvent être purifiés par ITP en choisissant un anion traînant dont la mobilité électrophorétique est inférieure à celle de l'acide nucléique cible, mais supérieure à celle des inhibiteurs ioniques de la PCR.Les inhibiteurs de PCR migrent dans la direction opposée et sont donc également laissés en arrière. Pour commencer, resuspendez le culot de cellules d’E. coli contenant 10 puissance 8 unités formant des colonies dans 80 microlitres d’eau exempte d’ARN, puis ajoutez 10 microlitres d’agent de lyse, mélangez délicatement et incubez cinq minutes à température ambiante. Après l’incubation, ajoutez 10 microlitres d’hydroxyde de sodium 1 M pour élever le pH du lysat à environ 12,5. Actionnez doucement la pipette vers le haut et vers le bas jusqu’à ce que la solution devienne limpide, moment auquel la lyse est terminée.Ensuite, ajoutez 10 microlitres de lysat dans 90 microlitres de Racine 50 millimolaire et de bis triss 100 millimolaire. Cette solution peut désormais être utilisée comme le témoin. Préparez également un millilitre de LE contenant le colorant cyber green, comme décrit dans le protocole écrit, et utilisez le LE pour remplir la puce microfluidique, comme démontré précédemment. Après le rinçage, remplacez le contenu du réservoir est par un produit compatible PCR.Rincez le réservoir ouest avec de l'eau désionisée et remplissez-le de 20 microlitres de te. Appliquez 1000 volts entre les réservoirs est et ouest pour commencer l'expérience. Le courant entre ces réservoirs diminuera à la fin de l'expérience.L'échantillon sort dans le réservoir de l'acide lactique en même temps que cette solution. La courbe du courant en fonction du temps atteint généralement une valeur stable. Mélangez délicatement le contenu du réservoir en actionnant la pipette plusieurs fois vers le haut et vers le bas.Ensuite, extraire le volume de cinq microlitres pour analyse par RT-PCR quantitative. L'ITP peut également être utilisé pour séparer et concentrer de petits ions en plateaux adjacents et détectables entre le TE et le LE, permettant ainsi la détection selon les propriétés physicochimiques observées. Voici un dosage avec traceur non concentrant, dans lequel une espèce ionique fluorescente est ajoutée au LE.L'espèce fluorescente ne se focalise pas, mais sa concentration s'adapte à un champ électrique local et permet ainsi la visualisation des zones purifiées du plateau. Commencez par préparer un millilitre d'électrolyte frontal contenant le cationique Fluor four rod Domine six G et un millilitre d'électrolyte de suivi. Mélangez ensuite 90 microlitres de TE avec 10 microlitres chacun d'arginine 50 millimolaire et de lysine 50 millimolaire pour charger l'échantillon par injection finie.Distribuez 20 microlitres d'Ellie dans les réservoirs ouest et nord, et placez l'échantillon d'acide aminé dans le réservoir est. Ensuite, appliquez un vide dans le réservoir sud pendant une minute. Après avoir rincé le réservoir est avec de l'eau DI, remplacez son contenu par du te.Comme étape finale, appliquez 500 volts entre les réservoirs est et ouest lors d'expériences en mode crête avec le marqueur fluorescent Alexa Fluor 4 88. L'intensité de fluorescence globale peut être intégrée et comparée à une courbe d'étalonnage afin d'obtenir une concentration quantitative. Les informations présentées ici proviennent d'expériences réalisées sur une gamme de courants appliqués, révélant cet échantillon.La largeur du pic est inversement proportionnelle au courant. Ceci est un exemple d'extraction d'acides nucléiques à partir d'un lysat cellulaire complet par ITP en mode pic. Le pic total d'acides nucléiques en ITP présente souvent une forme non idéale.Dans les expériences d'extraction des acides nucléiques, l'échantillon est laissé en contact avec le réservoir LE et extrait à l’aide d’une pipette pour analyse par RT-q-PCR, permettant d’obtenir des résultats de transcription inverse quantitative. La PCR a confirmé la purification réussie de l’ARN ribosomique 16 s et de l’ADN ribosomique 16 s à partir du contrôle négatif de culture bactérienne ; les cycles seuils pour l’ARN ribosomique 16 s et l’ADN ribosomique 16 s étaient chacun supérieurs à 30 cycles, comme attendu. La méthode ITP en mode plateau a été réalisée pour deux acides aminés, l’arginine et la lysine, en utilisant le test NFT avec RUMINE six G comme traceur fluorescent sous-vitesse.Ici, l'intensité de fluorescence relative par rapport à l'intensité de la zone LE ou TE peut être utilisée pour l'identification des zones, tandis que les largeurs des zones permettent la quantification. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension physique de l'ITP et de la méthodologie sous-jacente à trois tests distincts fondés sur l'ITP. En particulier, nous avons montré comment utiliser l'ITP pour purifier des acides aminés, préconcentrer des analytes et extraire sélectivement des acides nucléiques.N'oubliez pas que le travail avec des tensions élevées peut être extrêmement dangereux. Vous devez toujours prendre des précautions, telles que l'utilisation d'équipements limitant le courant et le maintien d'une distance suffisante par rapport aux électrodes.

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