Name: Développement sexuel et la libération des ascospores dans Fusarium graminearum /em (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Découvrez comment induire le développement sexuel et la libération des ascospores chez Fusarium graminearum. Ces techniques permettent d'évaluer la recombinaison génétique et de cribler des mutants pour l'étude de la reproduction fongique.

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Ce travail a été soutenu par une subvention de la National Science Foundation (MCB-0923794 à FT).

1. Produire périthèces <ol><li> Agar Centre carotte inoculer 10 en a 6,0 cm de diamètre boîte de Pétri avec une souche fertile de F. graminearum (PH Recommander-1). </li><li> Lieu inoculé plats sous les lumières lumineuses fluorescentes à température ambiante (18-24 ° C) et laisser croître jusqu&#39;à ce que le mycélium a atteint le bord extérieur de la boîte de Pétri (3-5 jours). Les lampes domestiques commerciaux fluorescentes fonctionnent très bien pour stimuler la formation de corps de fructification et de décharge. </li><li> Retirez délicatement le mycélium aérien avec un cure-dent stérile. </li><li> Distribuer 1,0 ml de 2,5% de Tween 60 aq à la surface avec une Hockeystick verre stérile ou d&#39;extrémité arrondie d&#39;une tige en verre stérile. </li><li> Remettre les assiettes à la lumière. Ne pas ajouter de Parafilm à plaques. </li><li> Après 24 h, la surface des plaques doit avoir un aspect brillant. Si mycélium réapparaît, la surface gratter et une nouvelle demande de Tween-60 solution. </li><li> Observer le développement des périthèces cours de la semaine prochaine. Les étapes intermédiaires dedéveloppement périthèce peut être récolté en grattant doucement la surface de l&#39;agar-agar et surgelés pour extraction de l&#39;ARN (Figure 1). </li><li> Les spores mûres vont s&#39;accumuler sur le couvercle de la plaque par jour 7. Au départ, ces ne sera visible que sous un microscope à dissection, mais le jour 9, ils se sont accumulés à une densité suffisante de manière à être visible à l&#39;œil nu. </li></ol> 2. Essai de décharge des ascospores <ol><li> Au jour 6 après l&#39;application de la solution de Tween, couper un cercle de 1 cm de diamètre sur l&#39;agar-agar avec un perce-bois. Alternativement, un scalpel peut être utilisé pour enlever un segment de taille similaire. Le cercle peut être coupé en deux et chaque moitié placé sur une lame de microscope en verre. </li><li> Orienter les pièces afin que la surface contenant les fructifications est perpendiculaire à la surface de la diapositive, et les spores sont tirés vers le bas la longueur de la glissière. </li><li> Placer la lame dans une chambre humide pendant la nuit sous les lumières. Les spores vont s&#39;accumuler sur lesla lame et être visible à l&#39;œil nu le matin suivant (Figure 2). </li><li> Spores accumulées peuvent être lavés de la lame à l&#39;eau et quantifiés si vous le souhaitez. </li><li> Inhibiteurs potentiels de la décharge d&#39;ascospores peuvent être analysés en les ajoutant à l&#39;arrière du bloc de gélose pendant le montage de l&#39;essai. Certains inhibiteurs de canaux ioniques qui permettent de réduire la décharge ont déjà été testés avec cette technique 15. </li></ol> 3. Génération d&#39;une descendance recombinante <ol><li> Initier traverser en inoculant agar carotte avec deux souches de F. graminearum (un Nit + et l&#39;autre à lentes), plaçant les points de inoculation sur des côtés opposés de la boîte de Petri. </li><li> Une fois que les hyphes ont rempli la surface, grattez partie aérienne et appliquer une solution de Tween-60 tel que décrit ci-dessus. Utilisation d&#39;un marqueur de noter sur le côté de la boîte de Petri, où les hyphes répondre. </li><li> Retour cultures à la lumière et incuber jusqu&#39;à périthèces se sont développés, et ont cirrhes êtrearmes à feu pour former de l&#39;périthèces long de l&#39;intersection entre les deux cultures. </li><li> Sous le microscope de dissection, mettre en voir les périthèces long de l&#39;intersection des deux cultures. Utilisation une broche d&#39;insecte, stérilisé et trempée dans de l&#39;eau stérile, un toucher cirrhus long de ce bord légèrement avec l&#39;extrémité de la broche. L&#39;humidité sur la broche devrait permettre aux cirrhus de s&#39;en tenir à la broche. </li><li> Rincer l&#39;extrémité de la broche avec les cirrhus sur elle dans 200 ul d&#39;eau stérile dans un tube Eppendorf de se laver les spores hors tension. </li><li> Flamme de la broche, l&#39;humidifier et reprendre un autre cirrhus. Très 10 à 15 cirrhes, et placer chacun dans un tube séparé de l&#39;eau. </li><li> Tubes vortex brièvement suspendue contenant cirrhes. </li><li> Retirer 60 pl de la suspension de spores avec une pipette et le lieu sur un milieu MMTS 1 dans un plat de Pétri de 9 cm. Étaler avec une crosse de hockey stérile. La suspension de spores restant peut être conservé à 4 ° C pendant jusqu&#39;à une semaine et réétalées si nécessaire. </li><li> Incubationte à la température ambiante (la lumière n&#39;est pas nécessaire) pendant 3-5 jours jusqu&#39;à ce que les très petites colonies apparaissent (Figure 3). Il y aura deux sortes de phénotypes entre les colonies. Les colonies lentes aura hyphes moins nombreuses que les colonies + NIT. Cirrhes de recombinaison périthèces se montrent les deux phénotypes colonie en proportion à peu près égale. Jeter les plaques avec des colonies de seulement un phénotype unique sur eux. Notez que, parfois, plus de deux phénotypes survenir en raison de la ségrégation des autres facteurs. </li><li> Déplacer les colonies à V8 ou de l&#39;agar de carotte pour le stockage. Colonies de test sur gélose de Czapek Dox (les souches lentes ne poussent pas sur Czapek Dox) et sur le PDA avec le chlorate (0,5 M chlorate de potassium; les souches + NIT ne poussent pas sur PDA avec le chlorate) pour confirmer le phénotype correcte. Examinez ces colonies pour les qualités souhaitées. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Produire des périthèces Le but est d&#39;avoir une pelouse depérithèces sans mycélium ou des spores apparentes. La surface de la culture sera semblable au velours noir (Figure 1). À 24 h après l&#39;application de Tween la surface de la gélose doit avoir un léger lustre. Si mycélium réapparaissent, puis la plaque peuvent ne pas avoir été gratté assez pour induire le développement périthèce. Ascospores décharge Toujours prévoir dans votre test de plusieurs blocs de gélose à partir de la souche de type sauvage. Si ceux qui ne se déclenchent pas, alors soit vos périthèces sont trop jeunes ou trop vieux. Si ils sont trop vieux, alors de nombreux hyphes apparaîtra au-dessus de la surface de la culture en lui donnant une teinte blanchâtre. Si ce n&#39;est pas le cas, ils peuvent être trop jeune, et le dosage doit être jugé à nouveau en 24 h. Parfois, les cultures ne se déchargent pas bien, et l&#39;expérience devra être répétée. Assurez-vous effectuer le test dans les conditions de lumière propres. Descendance recombinante <p class="jove_content"Périthèces&gt; recombinant devraient constituer la majorité des périthèces long de l&#39;intersection entre les deux souches. Nous avons l&#39;habitude de traiter 10 cirrhes d&#39;un croisement et au moins 4-6 de ceux-ci devraient être recombinant. Très occasionnellement, une mutation empêche une souche de l&#39;accouplement. Si l&#39;un des parents a un phénotype de croissance aberrant, puis plus de 2 phénotypes peuvent être présents parmi les colonies sur MMTS. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig1.jpg" /> Figure 1. Les étapes du développement périthèce sur gélose de carotte. Gauche, 72 h après l&#39;application de Tween. Notez pigment rouge et périthèces très jeune visibles que quelques grains noirs sur la surface. A droite, à 144 h, périthèces matures ont formé. Notez l&#39;absence quasi-complète du mycélium superficiel dans les deux cultures. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig2.jpg" /> Test de décharge Figure 2.. La fiche orange carotte agar est orienté de façon thaspores t force déchargés de la périthèces matures sur sa surface peuvent s&#39;accumuler sur la surface de la lame de verre. 15 h temps d&#39;accumulation. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig3.jpg" /> Figure 3. Les différences de croissance entre Nit nit + et des colonies sur milieu MMTS sélective. Les colonies nit-(pointes de flèches) sont plus petits. Les + de Nit colonies (flèches) montrent une croissance robuste. Photo prise au bout de 7 jours.

<ol><li>Bowden, R. L., Leslie, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+recombination+in+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Sexual recombination in Gibberella zeae.</a> Phytopathology. 89, 182-188 (1999).</li>
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<li>Trail, F., Xu, H., Loranger, R., Gadoury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+environmental+aspects+of+ascospore+discharge+in+Gibberella+zeae+%28anamorph+Fusarium+graminearum%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologica%22%5BJournal%5D)">Physiological and environmental aspects of ascospore discharge in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum.</a> Mycologica. 94, 181-189 (2002).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

F. graminearum est particulièrement bien adapté à l&#39;étude du développement du corps fructifère en raison de la disponibilité d&#39;un génome bien annotée ( <a href="http://mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB/">mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB /</a> ; 4), et de la disponibilité d&#39;un Affymetrix- sur la base microréseau 6. Cela a facilité la capacité à identifier les gènes importants pour la libération des ascospores 7,11,3. Les méthodes présentées ici permettent au chercheur de se concentrer sur un ensemble discret de stades de développement et des fonctions pour l&#39;analyse génétique des fructifications de F. graminearum. Les méthodes sont également facilement adaptables aux champignons connexes qui peuvent être induites à fruits dans la culture, et peut être utilisé comme un standard pour le développement dans une variété d&#39;autres types de fructification des champignons. La capacité d&#39;évaluer un phénotype de tir des spores peuvent être subtils dans les espèces où les spores sont de petite taille et difficiles à voir, comme <em&gt; F. graminearum. La collection de spores sur une lame propre facilite à la fois une évaluation visuelle, et l&#39;évaluation quantitative, sous forme de spores peuvent être lavés de la lame et quantifié. Certaines espèces fongiques produisent un mucilage qui entoure leur spores et les spores ne peut pas être rincé, mais doivent être comptés au microscope car ils restent sur la diapositive. Nous avons trouvé que cela est vrai de Sclerotinia sclerotiorum.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Fusarium graminearum souche PH-1 </td><td> Fongique Genetics Stock Center, Kansas </td><td> FGSC 9075 </td></tr><tr><td> Tween 60 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1629 </td></tr><tr><td> Agar Czapek Dox </td><td> Difco, Becton Dickinson </td><td> 233810 </td></tr><tr><td> Le chlorate de potassium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 255572 </td></tr></tbody></table>

développement sexuel et la libération des ascospores dans fusarium graminearum</em

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Fusarium graminearum est devenu un système modèle pour les études en matière de développement et de la pathogénicité des champignons filamenteux. F. graminearum produit le plus facilement les organes de fructification, appelés périthèces, sur gélose de carotte. Les périthèces contiennent de nombreux types de tissus, des produits à des stades spécifiques du développement périthèce. Il s&#39;agit notamment (par ordre d&#39;apparition) la formation des initiales périthèce (qui donnent lieu à des hyphes ascogènes), la paroi extérieure, paraphyses (mycélium stérile qui occupent le centre du périthèce jusqu&#39;à ce que le asques se développent), le asques, les ascospores et les au sein de l&#39;asques 14. Le développement de chacun de ces tissus est séparé par environ 24 heures et a été la base d&#39;études de transcriptomique pendant le développement sexuel 12,8. Reportez-vous à Hallen et al. (2007) pour une description plus approfondie du développement, y compris des photographies de chaque étape. Ici, nous présentons les méthodes pour générer et à la récolte synchronement le développement de pelouses périthèces pour les études temporelles de la régulation des gènes, le développement et les processus physiologiques. Bien que ces méthodes sont écrites spécifiquement pour être utilisé avec F. graminearum, les techniques peuvent être utilisées pour une variété d&#39;autres champignons, à condition que la fructification peut être induite dans la culture et il ya une certaine synchronie au développement. Nous avons récemment adapté ce protocole d&#39;étudier le développement sexuel de F. verticillioides. Bien que les périthèces individu doit être cueillies à la main dans cette espèce, car une pelouse de développer périthèces n&#39;a pas pu être induite, le processus a bien fonctionné pour étudier le développement (Sikhakolli et Trail, non publié). La fonction la plus importante des fructifications fongiques est la dispersion des spores. Dans la plupart des espèces de Ascomycota (asque produire des champignons), les spores sont abattus à partir de l&#39;asque, en raison de la génération de la pression de turgescence au sein de l&#39;asque, la conduite d&#39;éjection de spores (et fluide epiplasmic) par l&#39;intermédiaire dupores dans la pointe asque 2,7. Nos études de la libération des ascospores forcé ont abouti à l&#39;élaboration d&#39;un &quot;test de décharge des spores&quot;, que nous utilisons pour dépister des mutations dans le processus. Nous présentons ici les détails de cet essai. F. graminearum est homothallique, et ne peut donc former des fructifications en l&#39;absence d&#39;un partenaire compatible. L&#39;avantage de ce passage à niveau est homothallisme n&#39;est pas nécessaire de générer des homozygotes progéniture pour un trait particulier, une facette qui a facilité l&#39;étude du développement sexuel chez cette espèce 14,7. Cependant, les souches hétérothalliques est généré, qui peut être utilisé pour le franchissement 5,9. Il est également possible de traverser les souches homothalliques d&#39;obtenir des mutants pour plusieurs gènes dans une souche 1. Cela se fait par un plat de Petri coinoculating avec 2 souches. Outre le point de rencontre, la majorité des périthèces sera recombinant (à condition d&#39;une mutation dans l&#39;un des souches parentales n&#39;inhibe paspollinisation croisée). Comme l&#39;âge périthèces, ils respirent la ascospores en masse au lieu de les évacuer de force. L&#39;exsudat de spores résultant (appelé cirrhus) se trouve à la pointe du périthèce et peut facilement être enlevé pour la récupération des spores individuelles. Ici, nous présentons un protocole pour faciliter l&#39;identification des périthèces recombinant et la récupération de la descendance recombinante.

Croisements sexués et l&#39;isolement de la descendance recombinante sont des outils de recherche importants pour le champignon filamenteux,<em&gt; Fusarium graminearum</em&gt;, Les techniques nécessaires de mener à bien ces processus sont présentés.

Développement sexuel et la libération des ascospores dans Fusarium graminearum</em

*Fusarium graminearum* est devenu un système modèle pour les études sur le développement et la pathogénicité des champignons filamenteux. *F. graminearum* produit plus facilement...

L'objectif général de cette procédure est d'apprendre à générer et à manipuler le développement de parathésies et à provoquer la libération de spores APO en culture. Cela est réalisé en premier lieu en induisant une culture en croissance active afin d'initier le développement sexuel. La deuxième étape consiste à tester la libération active des spores, puis des parathésies recombinantes sont générées.La dernière étape consiste à évaluer la descendance pour détecter des phénotypes indiquant si une recombinaison s'est produite ou non. En fin de compte, les résultats peuvent être utilisés pour rechercher des mutants impliqués dans le développement sexuel ou pour générer plusieurs mutations au sein d'une même souche. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes sont difficiles à décrire et, bien qu'elles soient simples, elles doivent être réalisées avec précision afin d'obtenir une libération optimale des spores et une production constante de parathésie.Commencez par effectuer une inoculation centrale d'un cône de carotte dans une boîte de Pétri de six centimètres de diamètre avec une souche fertile de f gramine. Incubez les boîtes inoculées sous une lumière fluorescente standard et vive, à température ambiante.Laisser les champignons pousser pendant trois à cinq jours, jusqu'à ce que le mycélium atteigne le bord extérieur de la boîte. Dans la hotte, gratter délicatement la surface de la culture avec le cure-dent stérile afin de prélever les mycéliums aériens.Ensuite, appliquez un millilitre de tensioactif sur la vis sans fin et frottez la surface à l’aide de l’extrémité courbée ou renflée d’une tige en verre stérile. Sans appliquer de perfil. Replacez les plaques sous les lumières.Après 24 heures, la surface des plaques doit présenter un aspect brillant. Si des mycéliums réapparaissent, raclez la surface, appliquez à nouveau la solution de Tween 60 et exposez-les à la lumière pendant encore 24 heures. Observez maintenant le développement de la parathésie pendant une semaine.Les parathésies jeunes sont visibles sous forme de grains noirs à la surface de l'auger. Par rapport aux parathésies matures, il devrait y avoir presque pas de mycélium superficiel.À J7, des spores matures s'accumulent sur le couvercle de la boîte, et à J9, les spores sont si denses qu'elles sont visibles sans grossissement. Pour récolter le stade intermédiaire, les parathésies raclent doucement la surface de la vis sans fin avec un scalpel et transfèrent les parathésies dans un tube cryo. Le tube peut ensuite être congelé instantanément pour l'extraction d'ARN six jours après l'application du tensioactif.Découpez un cercle d'un centimètre de diamètre dans le carotteur à l’aide d’un couteau, d’un foret ou d’un scalpel. Divisez le cercle en deux moitiés et montez-les sur une lame de microscope en orientant les morceaux de manière à ce que la surface contenant les fructifications soit perpendiculaire à la surface de la lame, et que les spores soient projetées le long de la lame. À ce stade, si un inhibiteur de spores acro est souhaité, appliquez-le à l’arrière du bloc du carotteur.Cette technique peut être utilisée pour cribler des produits chimiques en vue d'identifier des inhibiteurs de décharge, ainsi que pour analyser des mutants génétiques présentant une perte de capacité à éjecter des spores ; nous avons mené ces deux types d'analyses avec succès. Incubez désormais la lame toute la nuit dans une chambre simple, illuminée, maintenue à température ambiante et humidifiée. Au fur et à mesure que les corps fructifères éclatent, les spores s'accumulent sur la lame et seront visibles le matin.Les spores accumulées peuvent désormais être rincées de la lame et recueillies dans une boîte propre, puis quantifiées. Commencez par mettre en place un croisement génétique entre deux souches de f gramine arum en les inoculant sur des côtés opposés d'une boîte de Pétri contenant de la carotte en copeaux. Comme décrit précédemment, faites croître les champignons jusqu'à ce que les hyphes aient recouvert entièrement la surface.Prélève les parties aériennes et applique le T entre 60 solution. Dans ce cas, marque la plaque là où les hyphes se rejoignent. Replace les cultures sous lumière et incube-les pendant environ sept jours, jusqu'à ce que les parathèses se soient développées et que les Siri commencent à se former à partir des parathèses le long de l'intersection entre les cultures.Cette technique peut être utilisée pour combiner plusieurs mutations en une seule souche. Il est également à noter que les deux types knit plus et knit minus peuvent être sélectionnés, ce qui en fait un marqueur de sélection très utile. Sous le microscope stéréoscopique, placer en vue la parathésie située au niveau de l'intersection des deux cultures.Ensuite, repérez l'œil sénaire. Trempez ensuite une aiguille à insecte stérilisée dans de l'eau stérile et touchez avec l'aiguille une goutte séreuse formée à la frontière entre les cultures. Les SRI doivent adhérer à l'humidité de l'aiguille.Ensuite, rincez la pointe de l'aiguille dans 200 microlitres d'eau stérile contenus dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Passez l'aiguille à la flamme, humidifiez-la à nouveau, puis prélève un autre sru. Prélevez entre trois et cinq Siri et transférez-les chacun dans un tube distinct.Agitez maintenant brièvement par vortex. Pour chaque tube contenant des spores en suspension, répartissez 60 microlitres de suspension de spores sur une boîte de Petri de neuf millimètres.Avec le milieu MMTS, incuber les plaques à température ambiante avec ou sans lumière, et conserver la suspension de spores restante à quatre degrés Celsius pendant jusqu'à une semaine. Après trois à cinq jours, de très petites colonies apparaissent sur la plaque. Un phénotype peut être évalué au microscope.Les colonies négatives en tricot présenteront un hyphy plus clairsemé que les colonies positives en tricot. Jetez les boîtes ne présentant qu'un seul des phénotypes. Les colonies provenant de la recombinaison parathésique montrent les deux phénotypes en proportions approximativement égales.Gardez ces plaques. Parfois, d'autres phénotypes apparaissent en raison de la ségrégation d'autres facteurs, tels que des colonies, qui sont intermédiaires entre les colonies positives et négatives au test du tricot, pour des raisons de conservation. Transférez les colonies des plaques recombinantes sur une plaque V eight ou sur une plaque de carotte auger afin de poursuivre l'étude en examinant d'autres phénotypes. Ensemencez les colonies sur une plaque Chap X dock's auger et sur des plaques contenant du PDA additionné de chlorate. Des parathésies ont été cultivées jusqu'à former une pelouse ressemblant à du velours noir, sans mycélium ni spores.24 heures après l'application de tween, la surface de la tarière présentait un léger éclat. Si des mycéliums étaient réapparus, il se peut que la plaque n'ait pas été grattée suffisamment pour induire le développement de la parathésie. Plusieurs blocs de tarière portant des corps fructifères provenant d'une souche sauvage ont été mis en place afin de faire tirer leurs spores sur des lames de verre pour observation.Une illumination adéquate a été préparée. Les parathésies trop jeunes ou trop âgées ne se mettaient souvent pas à feu. Lorsqu'elles étaient trop âgées, de nombreux hyphes apparaissaient à la surface de la culture, lui conférant une teinte blanchâtre.Quand ils sont trop jeunes, les corps fructifères ne se déclenchent pas, et l'expérience est répétée. Vingt-quatre heures plus tard, lorsque 10 Siri sont collectés à partir d'un croisement, au moins six sont généralement recombinants, comme évalué par un mélange de phénotypes tricot négatif et tricot positif. Très occasionnellement, une mutation empêche une souche de se reproduire.Si l'un des parents présentait un phénotype de croissance apparent, alors plus de deux phénotypes étaient présents parmi les colonies sur le milieu MMTS. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de commencer avec une culture bien entretenue et non transférée de manière séquentielle au fil du temps. Commencez toujours avec une culture obtenue à partir d'un stock stable conservé au congélateur.

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