Name: En utilisant des oeufs de Schistosoma mansoni En tant que In vivo Modèle de linflammation pulmonaire induite par les helminthes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Découvrez l'étude de l'inflammation pulmonaire induite par les œufs de Schistosoma mansoni chez la souris. Cette méthode permet d'analyser la réponse immunitaire Th2 et le recrutement des cellules inflammatoires in vivo.

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Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (NIH) AI091759 et la maladie de Crohn et la colite Fondation de William de l&#39;Amérique et Shelby Modell famille Bourse de recherche Fondation (à MN). Schistosome-souris infectées ont été fournis par le Centre de ressources Schistosome NIAID (NIAID contrat N01 A130026).

1. Purifiant œufs de Schistosoma mansoni <ol><li> Infect suisse-Webster souris avec des cercaires de schistosomes, qui est le stade infectieux dans le cycle de vie Schistosoma 8. Sinon, procurez-schistosome-souris infectées par le NIAID ressources schistosomiase Centre ( <a href="http://www.schisto-resource.org/" target="_blank">http://www.schisto-resource.org/~~V</a> ). Laissez la souris pour 6-7 semaines après l&#39;infection, par lequel point dans le temps, les oeufs sont présents dans le foie et peut être récupéré tel que décrit ci-dessous (voir fig. 1). </li><li> Euthanasier les souris avec le CO 2, et mouiller avec de l&#39;éthanol 70%. Placez la souris sur le dos. Utilisez le forceps émoussé et ciseaux pour couper la peau et le péritoine sous-jacent. D&#39;accise du foie, située en dessous de la cage thoracique et le diaphragme. </li><li> Émincer finement les foies et ajouter 20 ml par le foie de mélange de digestion, composée de la collagénase / dispase (0,5 mg / ml), la pénicilline (100 U / ml) et de la streptomycine (100 ug / ml) dans du PBS. Mettez mixture dans un tube Falcon de 50 ml et incuber pendant une nuit dans un shaker à 37 ° C. </li><li> Centrifuger le mélange à 400 xg / 3 min / 20 ° C. Verser délicatement l&#39;excès de liquide et le tube de remplissage avec du PBS. Centrifuger de nouveau et répéter de lavage PBS. Après centrifugation dernier, remettre en suspension le culot dans 25 mL du PBS. </li><li> Passer le culot remis en suspension à travers un standard de cuisine métallique crépine (utiliser un piston de la seringue de 50 ml pour écraser les morceaux de foie dans un récipient en verre), suivi par le passage du mélange à travers une passoire fine (utiliser une seringue de 10 ml pour pousser le mélange à travers la passoire fine dans un bécher seconde). </li><li> Mettez le mélange dans un tube tendues Falcon de 50 ml. Centrifuger à 400 xg / 5 min / 20 ° C. Verser délicatement sur surnageant sans perdre de granules. Resuspendre le culot dans 3 ml de PBS. </li><li> Overlay mélanger doucement sur ​​un Percoll 20%, 40 ml de gradient de 8 ml de Percoll et 32 ml de saccharose 0,25 M (FW = 342,3 donc 8,56 g sucrose/100 ml H 2 0). </li><li> Centrifuger 10 min / 800 xg / 20 ° C. Introduire à la pipette à pied und jetez gélatineuse couche supérieure des cellules du foie. Retirez l&#39;œuf culot en bas avec une pipette de transfert et de mettre dans un tube de 15 ml Falcon. </li><li> Laver à granulés 3X dans 10 ml de PBS / EDTA 1 mM / 1 mM EGTA paramètres de centrifugation à l&#39;aide: 3 min / 30 xg / 20 ° C. Remettre en suspension dans 500 ul de PBS. </li><li> Mélange de superposition sur un nouveau Percoll 25%, 10 ml de gradient (2,5 ml de Percoll et 7,5 mL 0,25 M de saccharose) en utilisant les paramètres de centrifugation: 10 min / 800 xg / 20 ° C. </li><li> Laver 3X dans 10 ml de PBS en utilisant les paramètres de centrifugation: 3 min / 30 xg / 20 ° C. </li><li> Dans les derniers 10 ml de lavage, retirez 100 pi à compter les œufs. Oeufs de régler rapidement, de sorte que le tube Falcon doit être bien mélangé avant de retirer l&#39;échantillon. Diluer l&#39;échantillon de 100 ul avec 900 ul de PBS. 100 uL du mélange doit être compté sous forme de gouttelettes sur une lame de microscope en utilisant un microscope à dissection (dilution 1:10). Wide-bore des pointes de pipette doit être utilisée. </li><li> Remettre en suspension les oeufs à 50.000 œufs / ml dans PBS. Les œufs peuvent être stockés pendant plusieurs mois à -80 ° C et décongelés une fois ou TWICe pour une utilisation. Avant utilisation, vérifier sous un microscope pour s&#39;assurer que les œufs sont toujours intacts (voir Fig. 1). </li></ol> 2. Sensibilisation par voie intrapéritonéale avec S. Oeufs mansoni: Jour 0 <ol><li> Préparez les œufs à 5000 oeufs/100 ul de PBS dans un tube de 5 ml snapcap. Pour l&#39;injection, d&#39;estimer les œufs de 50% de plus que nécessaire. </li><li> Chargez une aiguille de calibre 23 et un 3/4inch seringue de 1 ml avec 100 uL de suspension d&#39;oeufs par souris. Oeufs de régler, l&#39;aiguille charge alors avec des œufs immédiatement avant utilisation. </li><li> Seringue rock d&#39;avant en arrière pour mélanger les oeufs avant chaque injection, et d&#39;injecter par voie intrapéritonéale 100 pi de suspension par la souris. </li></ol> 3. Rétro-orbitaire Défi intraveineuse avec S. Oeufs mansoni: Jour 14 <ol><li> Préparer les œufs comme ci-dessus à 5.000 oeufs/100 ul. </li><li> Anesthésier souris dans la chambre spécialisée à l&#39;isoflurane (4%), ou par voie intrapéritonéale avec la xylazine (10 mg / kg) et la kétamine (120 mg / kg). Profondeur de anesthesia est déterminé par le pincement de la patte et en veillant pas de réponse physique. </li><li> Après chargement de la seringue de 1 ml et 23 aiguille de la jauge 3/4inch avec des œufs, d&#39;utiliser des pinces pour plier l&#39;aiguille à un angle de 90 ° avec le biseau vers le bas dans l&#39;angle. Assurez-vous qu&#39;aucun des bulles sont présentes. </li><li> Placer la souris sur un côté. Rentrer la peau de sorte œil saillie, et injecter 100 ml dans les vaisseaux derrière le globe oculaire à un angle de 45 ° sur le nez. </li><li> Retirer l&#39;aiguille et appliquer une légère pression pour contrôler le saignement. </li></ol> Toutes ces procédures doivent être effectuées avec soin, et la souris doivent être surveillés jusqu&#39;à ce qu&#39;ils récupèrent de l&#39;anesthésie. Ces protocoles ont été approuvés par l&#39;Université de Pennsylvanie soins des animaux et le Comité institutionnel d&#39;utilisation (IACUC). 4. Récolte expérimentale: Jour 22 <ol><li> Euthanasier les souris avec du CO 2. </li><li> La souris par voie humide avec de l&#39;éthanol 70%, et le lieu sur le dos. </li><li> Utilisation de mousse forceps, saisir l&#39;abdomen de la souris et faire une petite incision dans la peau. Retirez soigneusement la peau avec des ciseaux et d&#39;exposer la cage thoracique et du péritoine. </li><li> Couper le péritoine. Coupez l&#39;aorte abdominale pour récupérer le sang avec une pipette Pasteur. Conservez-le sur la glace. </li><li> Déplacez le foie vers le bas pour exposer le diaphragme. Utilisez des ciseaux fins de couper le diaphragme. Découpez soigneusement ouvert la cage thoracique afin d&#39;exposer le tissu pulmonaire. </li><li> Récupérer les ganglions lymphatiques qui drainent parathymic du poumon avec des pinces fines. Ceux-ci sont caché sous la cage thoracique, de chaque côté du thymus 9. Magasin sur la glace dans 1mL milieux stériles (DMEM supplémenté avec 10% inactivé par la chaleur sérum de veau foetal, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / mL de streptomycine, 2 mM de L-glutamine, 50 uM de 2-mercaptoéthanol, tous disponibles chez Invitrogen). </li><li> Pour récupérer la BAL, et gonfler les poumons pour l&#39;analyse histologique, l&#39;intubation trachéale doit être effectuée. Exposer la trachée en déplaçant les glandes salivaires sur le côté, et Placing pinces fines sous la trachée. L&#39;aide de ciseaux fins, découpez un trou dans le milieu de la trachée, et insérer le tube dans les poumons. Fixer la tuyauterie en attachant avec un fil chirurgical. </li><li> Fixez PBS-remplie seringue de 1 ml à la tubulure et gonfler les poumons avec 1 ml de PBS. Soigneusement récupérer lavage BAL avec une seringue. Conservez-le sur la glace. </li><li> Fixez paraformaldéhyde à 4% (PFA) dans du PBS-remplie seringue de 1 ml à la tubulure et gonfler les poumons. </li><li> Retirez le tube, et serrer le fil chirurgical pour éviter les fuites de la PFA. </li><li> Soigneusement disséquer les tissus pulmonaires et les placer dans un tube Falcon de 50 ml avec 5 ml de 4% PFA. </li></ol> 5. Préparation des tissus récupérés <ol><li> Sérum: Après le stockage sur de la glace pendant 30 min à 2 h pour le sang à coaguler, le sérum est récupéré à partir du sang par centrifugation (13000 xg / 10 min / 4 ° C). Le sérum est conservé à -20 ° C et peut être utilisé pour les tests ELISA des cytokines ou S. mansoni œuf spécifique de l&#39;antigène isotype IgG ELISA <sup&gt; 6, 10. </li><li> Les nœuds lymphatiques: des suspensions cellulaires simples sont préparés et nombre de cellules utilisées pour évaluer l&#39;ampleur de la réponse immunitaire. Pour examiner la polarisation des cellules Th2, les cellules sont stimulées avec re-S. antigène oeuf mansoni pendant 72 heures. Coloration des cytokines Intracellar peuvent être examinés par cytométrie de flux, et les surnageants peut être récupéré et stocké à -20 ° C pour le test ELISA de cytokines Th2 (IL-4, IL-5, IL-13) 6. </li><li> BAL: Les cellules sont granulés (400 ug / 5 min / 4 ° C). Le liquide de LBA est récupéré et stocké à -20 ° C pour l&#39;analyse des cytokines Th2 par ELISA. BAL chiffres cellules sont utilisées comme une lecture pour l&#39;inflammation des voies aériennes. Préparations de cytocentrifugeuse 10,000-100,000 cellules (500 tours par minute / 5 min / 4 ° C), suivie d&#39;une coloration Diffquik permettra énumération de infiltration inflammatoire 4, 6. Alternativement, les cellules BAL peut être examinée par 6 cytométrie en flux. </li><li> Le tissu pulmonaire: tissu pulmonaire sont stockagenuit ed à 4 ° C. Tissus fixe est inclus en paraffine, sectionnés et montées sur des lames pour l&#39;analyse histologique et immunofluorescence. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Ce protocole décrit toutes les étapes nécessaires pour (i) la purification de Schistosoma mansoni oeufs pour utilisation in vivo (Fig. 1), (ii) sensibiliser et de contester la souris avec ces œufs et (iii) récupérer les organes d&#39;examen de la réponse inflammatoire des poumons. Ce modèle in vivo entraîne une réponse reproductible du poumon puissant Th2 inflammatoire. Ceci est illustré par une inflammation des voies respiratoires et éosinophilie tels que révélés par les numérations cellulaires BAL et préparations cytocentrifugeuse (Fig. 2). H &amp; sections du poumon E-tachés peuvent être examinées pour les oeufs induite par des granulomes (Fig. 3a), et la coloration par immunofluorescence de sections du poumon permet de visualiser les macrophages activés alternativement et Th2 induite par les cytokines telles que les gènes Résisd&#39;étain-comme molécule (RELM) α (Fig. 3b). La réponse spécifique de l&#39;antigène CD4 cytokine Th2 est examiné par ELISA pour l&#39;IL-5, IL-4 et IL-13 de l&#39;antigène-stimulées parathymic cellules des ganglions lymphatiques (fig. 4). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig1.jpg" /> Figure 1 Schistosoma mansoni modèle d&#39;injection pour oeufs images représentatives de foies granulomateuses, caractéristiques de haute S.mansoni-oeufs charges et d&#39;œufs S.mansoni sont présentés -.. Taille moyenne (L) 120 um par (W) 50 um. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig2.jpg" /> Figure 2. S. mansoni œuf d&#39;injection entraîne une inflammation des voies respiratoires. A. Le nombre de cellules BAL (x10 5) de naïfs (N) ou S. mansoni (Sm) oeuf-souris injectées. * P &lt;0,05. La préparation des cellules B. cytocentrifugeuse BAL. Mac, MACROPHAGES; Eos, EOSINOPHILES; LYMPHATIQUE, lymphocytes. Bar, 10 um. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig3.jpg" /> Figure 3. Visualisation des granulomes pulmonaires et les macrophages activés alternativement autour de l&#39;œuf S.mansoni. A. Granulome pulmonaire qui entoure l&#39;œuf Sm (flèche noire) a été visualisé dans les sections H &amp; E-pulmonaires colorées. B. Immunofluorescence coloration pour RELMα (vert), le récepteur du mannose (rouge) et DAPI (bleu) révèle encore des macrophages activés (flèche blanche) dans le granulome entourant le autofluorescente Sm oeuf (flèche noire). Bar, 50 um. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig4.jpg" /> Figure 4. S.mansoni oeuf spécifique de l&#39;antigène réponse des cytokines Th2. Vidange parathymic cellules ganglionnaires de souris naïves (N) ou Sm-oeuf injecté ont été stimulées avec Sm &lt;/ Em antigène oeuf&gt; pendant 72 heures, suivie par la méthode ELISA de surnageants de l&#39;IL-4, IL-5 et IL-13. Échelle, ng / mL. * P &lt;0,05.

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<li>Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrotic+disease+and+the+T%28H%291%2FT%28H%292+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm.</a> Nat. Rev. Immunol. 4, 583-594 (2004).</li>
<li>Cheever, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+hepatic+fibrosis+and+granuloma+size+among+mouse+strains+infected+with+Schistosoma+mansoni%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Variation of hepatic fibrosis and granuloma size among mouse strains infected with Schistosoma mansoni.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 37, 85-97 (1987).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Ici, un modèle utilisant de Schistosoma mansoni oeufs à induire une inflammation du poumon de type 2 est décrite. Les traits caractéristiques de ce modèle incluent le puissant réponse immunitaire de type Th2, inflammation des voies respiratoires et la formation de granulomes pulmonaires. Étant donné que ces paramètres dépendent des réponses des lymphocytes CD4 Th2 11, il s&#39;agit d&#39;un modèle utile pour étudier les effets des suppressions de protéines spécifiques ou de la lignée spécifique sur l...

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Taille / Description </td><td> Entreprise </td><td> Catalogue # </td></tr><tr><td> Collagénase / dispase </td><td> 500 mg </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11 097 113 001 </td></tr><tr><td> Diff Quik Hema 3 Stain </td><td> Emballer </td><td> Fisher Scientific Co. LLC </td><td> 122-911 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Liquide </td><td> Gibco </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> Falcon de 50 ml </td><td> Emballer </td><td> Faucon </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> Intramedic PE tubes </td><td> 0,58 mm </td><td> Becton Dickinson and Co. </td><td> 427410 </td></tr><tr><td> L&#39;isoflurane </td><td> 250 ml </td><td> De la santé animale abbé </td><td> 52600405 </td></tr><tr><td> La kétamine </td><td> 100 mg / ml </td><td> Fort Dodge, la santé animale </td&gt; <td> N / A </td></tr><tr><td> Anticorps anti-récepteur du mannose </td><td> La biotine </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA2235B </td></tr><tr><td> Metallic Crépine </td><td> Passoire de cuisine standard </td><td> Cible </td><td> Laurentiis </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde </td><td> 16% </td><td> Electron Microsc. Sciences </td><td> 15710 </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> 100x </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> 1 Litre </td><td> GE Healthcare Biosciences </td><td> 17 0891 01 </td></tr><tr><td> Anticorps RELMα </td><td> 50 pg </td><td> Peprotech </td><td> 500-P214 </td></tr><tr><td> Fil chirurgical </td><td> 2,0 USP 100 yds </td><td> Spécialités chirurgicales Corp </td><td> SP118 </td></tr><tr><td> Aiguille de la seringue </td><td> 23g, 3/4 pouce </td><td> BD Vacutainer Lab. Med. </td><td>305143 </td></tr><tr><td> Normes pour les essais aux Etats-Unis Sieve </td><td> 150 um, 0,0059 &quot; </td><td> WS Tyler, Inc </td><td> ASTME-11, Spec. N ° 100 </td></tr><tr><td> La xylazine </td><td> 20 mg / ml </td><td> Majordome </td><td> N / A </td></tr></tbody></table>

en utilisant des oeufs de<em&gt; schistosoma mansoni</em&gt; en tant que<em&gt; in vivo</em&gt; modèle de l&#39;inflammation pulmonaire induite par les helminthes

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosomes sont schistosomes qui infectent environ 200 millions de personnes dans le monde 1. Dans l&#39;infection chronique à Schistosoma, l&#39;une pathologie grave, y compris la fibrose du foie et de la splénomégalie, est causée par la réponse immunitaire à des œufs de parasites plutôt que le parasite lui-même 2. Œufs de parasites induisent une réponse Th2 caractérisée par la production d&#39;IL-4, IL-5 et IL-13, l&#39;activation alternative des macrophages et le recrutement des éosinophiles. Ici, nous décrivons l&#39;injection d&#39;œufs de Schistosoma mansoni en tant que modèle pour examiner les réponses spécifiques du parasite cytokines Th2 dans les poumons et les ganglions lymphatiques drainant, la formation de granulomes pulmonaires entourant l&#39;oeuf et l&#39;inflammation des voies respiratoires. Après une sensibilisation par voie intrapéritonéale et intraveineuse défi, S. oeufs mansoni sont transportés à travers le poumon des artères pulmonaires où ils sont piégés dans le parenchyme du poumonpar les granulomes composés de lymphocytes, les éosinophiles et les macrophages activés alternativement 3-6. Associé à la formation de granulomes, de l&#39;inflammation dans les espaces broncho-alvéolaires, l&#39;expansion des ganglions lymphatiques drainant et l&#39;activation des cellules CD4 T peut être observée. Ici, nous détaillons le protocole pour isoler Schistosoma mansoni oeufs à partir de foies infectés (modifié à partir de 7), la sensibilisation et difficile souris, et la récupération des organes (lavage broncho-alvéolaire (LBA), du poumon et les ganglions lymphatiques drainant) pour l&#39;analyse. Nous incluons également histologique des données représentatives et immunologiques et des suggestions pour l&#39;analyse immunologique supplémentaire. Dans l&#39;ensemble, cette méthode fournit un modèle in vivo pour étudier les réponses immunologiques induites par les helminthes dans le poumon, qui est largement applicable à l&#39;étude des maladies inflammatoires, y compris Th2 infestation par les helminthes, les maladies fibrotiques, l&#39;inflammation allergique et l&#39;asthme. Avantages de ce modèle pour l&#39;étude de type 2 l&#39;inflammation dans les poumons comprennent la reproductibilité d&#39;une puissante réponse inflammatoire Th2 dans les poumons et les ganglions lymphatiques drainant, la facilité de l&#39;évaluation de l&#39;inflammation par l&#39;examen histologique des granulomes entourant l&#39;œuf, et le potentiel de stockage à long terme du parasite oeufs.

Schistosoma mansoni oeufs sont des stimulateurs efficaces du type T auxiliaire 2 (Th2) la réponse immunitaire, caractéristique d&#39;une infection parasitaire, l&#39;asthme et l&#39;inflammation allergique. Ce protocole utilise S. mansoni œuf d&#39;injection afin de générer un taux de CD4 Th2 induite par les cytokines réponse inflammatoire dans les poumons, caractérisée par la formation de granulomes pulmonaires autour de l&#39;oeuf, l&#39;éosinophilie et l&#39;activation des macrophages alternative.

En utilisant des oeufs de<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; En tant que<em&gt; In vivo</em&gt; Modèle de l&#39;inflammation pulmonaire induite par les helminthes

Les parasites Schistosoma sont des trématodes sanguicoles qui infectent environ 200 millions de personnes dans le monde 1. Dans le cas d'une infection chronique par Schistosoma, la forme sévère...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'étudier l'inflammation pulmonaire et les réponses des cellules immunitaires. Cela est réalisé en purifiant des œufs d'helminthes à partir de foies infectés par shta. Dans un deuxième temps, des souris sont immunisées puis exposées à des œufs purifiés, ce qui induit une réponse inflammatoire pulmonaire marquée.Ensuite, les poumons et les organes lymphoïdes drainants sont isolés chez les souris afin d'évaluer l'ampleur de la réponse inflammatoire provoquée par l'helmet. Les résultats obtenus révèlent une inflammation pulmonaire induite par l'helmet, marquée par le recrutement de cellules inflammatoires dans le poumon et l'observation de lésions pulmonaires induites par les œufs. Généralement, les personnes novices dans cette technique éprouveront quelques difficultés, car une grande précision est requise lors de la dissection des poumons et des ganglions lymphatiques, ainsi que lors de l'injection des œufs.Cependant, la maîtrise de cette technique est gratifiante car elle permet de visualiser une réponse pulmonaire inflammatoire intense aux œufs de helmuth. La démonstration de la technique est assurée par Karen et Will, techniciens au laboratoire Nyer et Greenberg. Placer une souris euthanasiée, infectée par Schistosoma circ, sur le dos, pratiquer une incision dans la peau afin d'exposer le péritoine, exciser le foie, situé sous la cage thoracique et le diaphragme, hacher finement les foies et ajouter 20 millilitres par foie de mélange de digestion, composé de collagénase, de dys, de base, de pénicilline et de streptomycine dans du PBS. Placer ce mélange dans un tube Falcon de 50 millilitres et incuber toute la nuit dans un agitateur à 37 degrés Celsius.Le lendemain, centrifuger le mélange. Verser le liquide excédentaire et remplir le tube avec du PBS, puis centrifuger à nouveau et répéter le lavage au PBS après la dernière centrifugation.Resuspendre le culot dans 25 millilitres de PBS. Ensuite, filtrer le culot resuspendu à l’aide d’un tamis métallique, suivi d’un passage à travers un tamis. Placer ce mélange filtré dans un tube Falcon de 50 millilitres et centrifuger.Versez le surnageant et resuspendez. Suspendez le culot dans trois millilitres de PBS. Recouvrez délicatement le mélange d'un gradient de 40 millilitres composé de huit millilitres par cuvette et de 32 millilitres de saccharose 0,25 molaire, puis centrifugez pendant 10 minutes à 800 ×g à 20 °C.Ensuite, éliminez la couche supérieure des cellules hépatiques à l’aide d’une pipette de transfert. Retirez le culot d’œufs au fond et placez-le dans un tube conique de 50 millilitres. Lavez le culot trois fois dans 10 millilitres de PBS contenant un EDTA et un EGTA, puis centrifugez.Resuspendre le culot dans 500 microlitres de PBS. Déposer ce mélange sur un nouveau gradient de 10 millilitres contenant 2,5 millilitres de par cellule et 7,5 millilitres de saccharose 0,25 molaire, puis centrifuger. Laver le culot trois fois dans 10 millilitres.PBS et centrifuger. S'assurer que le tube Falcon est bien mélangé et prélever 50 microlitres du dernier lavage. Pour compter les œufs, diluer les 50 microlitres.Mélanger avec 450 microlitres de PBS et ajouter 100 microlitres de ce mélange sur une lame en verre placée sur le plateau d’un microscope stéréoscopique afin de compter les gouttelettes. Resuspendre les œufs à raison de 50 000 œufs par millilitre dans du PBS. Les œufs peuvent être conservés plusieurs mois à moins 80 degrés Celsius et décongelés une ou deux fois pour utilisation. Avant utilisation, examiner les œufs au microscope pour s’assurer qu’ils sont encore intacts, dans un tube de 5 millilitres à bouchon vissé.Préparez les œufs à raison de 5 000 œufs par 100 microlitres de PBS pour l'injection. Estimez 50 % d'œufs en plus par rapport à la quantité nécessaire. Chargez une aiguille de calibre 23, de cinq huitièmes de pouce, et une seringue d'un millilitre avec 100 microlitres de suspension d'œufs par souris.Agiter la seringue en arrière et en avant pour mélanger les œufs avant chaque injection, puis injecter 100 microlitres de suspension par souris par voie intrapéritonéale Ely 14 jours après la sensibilisation. Préparer les œufs comme précédemment à raison de 5 000 œufs par 100 microlitres, puis charger une seringue d’un millilitre et une aiguille de calibre 23 avec les œufs. Utiliser une pince pour courber l’aiguille à un angle de 90 degrés et s’assurer qu’aucune bulle n’est présente.Anesthésiez la souris et placez-la sur le côté. Injectez 100 microlitres de suspension dans les vaisseaux situés derrière l’œil selon un angle de 45 degrés par rapport au nez. Huit jours après le défi intraveineux, euthanasiez la souris et pratiquez une petite incision dans la peau de l’abdomen.Ouvrir la péritoine et localiser l'aorte abdominale. Sectionner l'aorte afin de prélever le sang à l'aide d'une pipette de Pasteur et conserver celui-ci sur de la glace. Déplacer le foie vers le bas pour exposer le diaphragme.Utilisez des ciseaux fins pour couper le diaphragme et procédez avec précaution. Ouvrez la cage thoracique afin d'exposer le tissu pulmonaire. Les ganglions lymphatiques parathymiques se situent sous la cage thoracique, au-dessus des poumons et de chaque côté du thymus.Retirer les ganglions lymphatiques avec une pince fine et les conserver sur de la glace dans un millilitre de milieu stérile. Pour commencer la procédure d'intubation, déplacer les glandes salivaires sur le côté afin d'exposer la trachée. Placer une pince fine sous la trachée et utiliser des ciseaux fins.Coupez un trou au milieu de la trachée et insérez un tube dans les poumons. Fixez le tube en le ligaturant avec du fil chirurgical. Attachez maintenant une seringue d'un millilitre remplie de PBS au tube et gonflez les poumons avec un millilitre de PBS.Retirez soigneusement le lavage de LBA à l’aide de la seringue et conservez-le sur de la glace. Ensuite, fixez une seringue d’un millilitre remplie de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS au tube et insufflez les poumons. Puis retirez le tube et serrez le fil chirurgical pour éviter toute fuite de PFA.Enfin, disséquez soigneusement le tissu pulmonaire et placez-le dans un tube Falcon de 50 millilitres contenant cinq millilitres de PFA à 4 % dans du PBS. Après une incubation de 0,5 à deux heures sur de la glace, centrifugez le sang recueilli pour séparer la couche sérique ; le sérum peut être utilisé pour des dosages ELISA des isotopes d’IgG spécifiques à l’antigène d’œuf de S. mansoni. Les ganglions lymphatiques mésentériques excisés peuvent être restimulés par l’antigène d’œuf de S. mansoni afin d’analyser les cytokines TH2 spécifiques de l’antigène. Après centrifugation et mise en pellet des cellules, récupérez le liquide de lavage broncho-alvéolaire (LBA) pour l’analyse des cytokines TH2 par ELISA. Les cellules du LBA sont récupérées pour la préparation cytocentrifugée.Tissu pulmonaire fixé pendant la nuit pour l'analyse histologique et la lyse en immunofluorescence. Les images présentées ici montrent des foies granulomateux, caractéristiques d'une forte charge en œufs d'esman. Des œufs d'esman sont également illustrés. Cette figure représente une inflammation des voies respiratoires induite par l'injection d'œufs d'essman sooni.Le graphique de gauche montre que le nombre de cellules dans le LBA est beaucoup plus élevé chez les souris injectées avec des œufs de S. mansoni par rapport aux souris naïves. Les images de gauche sont des préparations représentatives de cytocentrifugation de cellules de LBA, au sein desquelles l'infiltrat inflammatoire composé de macrophages, d'éosinophiles et de lymphocytes peut être clairement visualisé.Un granulome pulmonaire entourant l'œuf d'esson est visible sur une coupe pulmonaire colorée à l'H&E. Cette image montre une coloration immunofluorescente pour le domaine alpha, en vert. Le récepteur mano, en rouge, et le colorant DPI, en bleu, révèlent des macrophages activés de manière alternative, indiqués par la flèche blanche.La réponse des cytokines de type TH2 spécifiques de l'antigène d'œuf de S. mansoni dans les ganglions lymphatiques mésentériques de souris naïves et de souris injectées avec S. mansoni est présentée ici. Les cellules des ganglions lymphatiques de chaque groupe ont été stimulées avec l'antigène d'œuf de S. mansoni pendant 72 heures. Ensuite, un dosage Elisa du surnageant a été réalisé pour les IL-4, IL-5 et IL-13.Les concentrations des trois cytokines inflammatoires étaient beaucoup plus élevées chez les souris injectées avec de l'esman après son développement. Cette technique offre un moyen simple aux chercheurs spécialisés en allergie et en infection à helmints d'étudier les cellules immunitaires recrutées en réponse à une infection par des helmints parasitaires et à l'allergie, dans un organisme modèle murin.

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