Imagerie multimodale d'implantation de cellules souches dans le système nerveux central de souris

L’objectif global de cette procédure est d’obtenir un suivi standardisé du comportement in vivo des cellules souches transplantées dans le cerveau de la souris. Ceci est accompli en marquant d’abord les cellules stromales dérivées de la moelle osseuse, qui co-expriment l’EGFP et la luciférase avec des particules d’oxyde de fer de la taille d’un micron fluorescent. La deuxième étape consiste à injecter de manière appropriée les BMC marqués MPIO dans le tissu cérébral de la souris.

Ensuite, la survie et la localisation des greffes cellulaires sont suivies de manière non invasive à l’aide de l’imagerie par bioluminescence et de l’imagerie par résonance magnétique. La dernière étape consiste à valider les résultats de l’imagerie in vivo à l’aide d’une analyse histologique post-mortem. Ces méthodes peuvent donner un aperçu du comportement des cellules souches après une transplantation dans le cerveau de la souris, mais elles peuvent également être appliquées à d’autres systèmes tels que les organismes modèles et l’étude d’une maladie.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de manipulation des animaux sont difficiles à apprendre car les injections intraveineuses et intracérébrales sont difficiles à réaliser et comportent certains risques pour la survie des animaux. Pour commencer cette procédure, ajoutez 75 fois 10 aux six particules d’oxyde de fer de la taille d’un micron bleu glaciaire à une culture cellulaire en croissance sub-confluente. Incuberez-les pendant encore 16 heures pour permettre l’absorption des particules par endocytose, puis éliminez les particules restantes.

Laissez les cellules se développer pendant 24 heures supplémentaires pour obtenir la co-fluidité cellulaire et la distribution homogène du G-B-M-P-I-O. Ensuite, utilisez la microscopie à fluorescence pour valider visuellement l’absorption des particules en calculant le rapport entre les cellules EGFP positives et G-B-M-P-I-O positives et le nombre total de cellules EGFP positives. Ensuite, lavez deux fois avec 10 millilitres les cellules G-B-M-P-I-O, marquées BMSC luciferase EGFP.

Le PBS traite les cellules avec des tripsine EDTA et les récolte par la suite. Récompensez ensuite les cellules et mettez-les en suspension à une concentration finale de 133 fois 10 à la sixième cellules par millilitre de PBS. Enfin, gardez les cellules sur de la glace jusqu’à la transplantation.

Dans cette procédure, anesthésez la souris par injection intrapéritonéale du mélange de kétamine à 80 milligrammes par kilogramme et de xylazine à 16 milligrammes par kilogramme. Attendez cinq minutes que la souris s’endorme, puis rasez-lui la tête pour permettre des manipulations stériles. Ensuite, placez la souris dans un cadre stéréotaxique, désinfectez la peau avec de l’alcool.

Après cela, appliquez une pommade sur ses yeux pour prévenir la déshydratation. Faites une incision médiane du cuir chevelu pour exposer le crâne afin de cibler l’hippocampe. Percez un trou dans le crâne à deux millimètres en arrière et à deux millimètres en latéral à l’aide d’une fraise dentaire.

À ce stade, faites un bref vortex sur la suspension cellulaire, puis aspirez la suspension cellulaire dans la seringue. Abaissez ensuite la seringue à aiguille à une profondeur de 2,5 millimètres sous la dure-mère et laissez l’équilibre de la pression pendant une minute. Au bout d’une minute, rétractez l’aiguille à une position de deux millimètres sous la dure-mère.

Injectez ensuite trois microlitres de suspension cellulaire à l’aide d’une pompe de micro-injection automatisée à la vitesse de 0,70 microlitre par minute. Après l’injection, attendez cinq minutes supplémentaires pour éviter le reflux de la suspension cellulaire injectée. Ensuite, rétractez lentement l’aiguille.

Ensuite, désinfectez les bords de la peau, puis suturez la peau. Injecter 300 microlitres de solution de chlorure de sodium à 0,9 % par voie sous-cutanée afin d’éviter la déshydratation. À la fin, placez la souris sous une lampe chauffante pour permettre la récupération de l’anesthésie afin d’effectuer une imagerie par bioluminescence.

Anesthésie la souris avec un mélange de 3 % d’iso, de fluor et d’oxygène. Placez ensuite la souris dans l’imageur de photons. Réduisez le niveau d’anesthésie en ajustant l’isolement de fluor à 1,5 %Ensuite, injectez d Lucifer par voie intraveineuse à 150 milligrammes par kilogramme de poids corporel.

Acquérez l’image pendant cinq minutes à l’aide du logiciel de vision photo. Ensuite, effectuez le traitement de l’image à l’aide du logiciel de vision M three et quantifiez le signal observé à l’aide de régions d’intérêt fixes. Pour effectuer une imagerie par résonance magnétique, anesthésie la souris avec 3 % de fluor ISO dans un mélange d’oxygène et d’oxyde nitrique.

Placez ensuite la souris dans la retenue d’un système MR horizontal de 9,4 Tesla. Réduisez le niveau d’anesthésie en ajustant la teneur en fluor à 1 %Ensuite, appliquez une pommade sur les yeux de la souris pour prévenir la déshydratation. Après cela, utilisez une sonde rectale pour surveiller la température corporelle.

Placez ensuite un capteur sous le ventre de la souris pour surveiller la fréquence respiratoire. Maintenez la fréquence respiratoire à 110 plus ou moins 10 fois par minute et maintenez la température corporelle constante dans une plage étroite de 37 plus ou moins 0,5 degré Celsius. Placez ensuite la bobine RF de surface sur la tête de la souris.

Positionnez la souris au milieu de l’aimant. Ouvrez ensuite ParaVision 5.1 Réglez les paramètres de séquence en fonction du manuscrit qui l’accompagne. Ensuite, acquérez un ensemble de 10 images d’écho de spin coronal T deux pondérées afin d’obtenir des informations anatomiques spécifiques.

NT deux images d’écho à gradient pondéré en étoile afin d’étudier la migration des cellules souches avec une résolution en clair de 70 micromètres carrés. Dans cette étape, sacrifiez la souris et retirez le cerveau. Fixez le tissu cérébral à température ambiante dans du paraldéhyde à 4 % dans du PBS pendant deux heures.

Au bout de deux heures. Déshydratez le tissu cérébral en le plaçant dans différents gradients de saccharose à quatre degrés Celsius. Le lendemain, congelez le tissu cérébral à l’aide d’azote liquide et stockez le tissu à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce que la section soit prête.

Sectionnez le tissu cérébral en sections de 10 micromètres d’épaisseur à l’aide d’un cryostat. Ensuite, sous un microscope à fluorescence, examinez les cryosections non colorées pour la fluorescence bleue des particules G-B-M-P-I-O et la fluorescence verte des cellules exprimant l’EGFP. Ensuite, examinez les sections cryogéniques non colorées pour détecter la fluorescence sur fond vert rouge des cellules inflammatoires.

La procédure de marquage MPIO bleu glaciaire décrite permet un marquage très efficace des cellules BMSC, luciférase EGFP, qui peut facilement être validé par microscopie à fluorescence. Ensuite, lors de la greffe de cellules G-B-M-P-I-O, marquées BMSC, luciférase EGFP dans le SNC de souris, la survie du greffon cellulaire peut être surveillée par imagerie de bioluminescence in vivo basée sur l’activité de la luciférase. De plus, la localisation exacte des cellules greffées peut être surveillée par imagerie par résonance magnétique in vivo basée sur la teneur en fer du MPIO bleu glaciaire.

Enfin, l’analyse histologique montre la validation des résultats obtenus par imagerie par bioluminescence et imagerie par résonance magnétique. La survie stable a été confirmée par une expression stable d’EGFP dans le temps après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’imagerie moléculaire pour explorer les événements cellulaires et moléculaires après la greffe de cellules souches dans différents modèles animaux de maladies neurodégénératives.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer l’imagerie moléculaire, d’appliquer la bioluminescence et l’imagerie par résonance magnétique, et de valider adéquatement les résultats in vivo à l’aide de l’évaluation histologique post-mortem.