Purification et visualisation de lipopolysaccharide de bactéries à Gram négatif par Hot-phénol aqueux d'extraction

L’objectif global de cette procédure est d’extraire le LPS des bactéries à Gram négatif. Ceci est accompli en cultivant d’abord une culture de cinq millilitres de bactéries pendant la nuit dans un milieu approprié et en ajustant la culture à une densité optique à 600 nanomètres de 0,5. Ensuite, la bactérie est granulée par micro-centrifugation et les cellules sont remises en suspension dans un tampon tris contenant du SDS et de l’éthanol à faisceau ou capto.

Ensuite, les lysats cellulaires sont bouillis et traités avec de la protéase et de la nucléase. Enfin, deux extractions séquentielles sont effectuées avec du phénol aqueux chaud et de l’éther dylique pour éliminer et retenir soigneusement la couche bleue aqueuse. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent la quantité ainsi que la présence ou l’absence de LPS et de souches de bactéries, ainsi que la modalité de longueur de la chaîne de l’antigène O par séparation par page SDS et analyses sanguines occidentales avec des anticorps spécifiques LPS ou coloration directe des polysaccharides dans le gel.

L’avantage de cette technique par rapport au traitement par protéase d’Hitchcock et Brown est qu’elle permet d’obtenir des échantillons LPS purs qui peuvent être mieux résolus par SDS page et western blot. Cette méthode peut fournir un aperçu de la synthèse et de la régulation du lipopolysaccharide dans VIR dans pratiquement toutes les bactéries à Gram négatif, y compris E coli et la salmonelle, ainsi que la biodéfense et les agents pathogènes émergents tels que Ella et Acetobacter respectivement. Pour l’extraction du LPS, mettez en place une culture nocturne de bactéries à Gram négatif dans cinq millilitres de LB complétés par des antibiotiques.

Si nécessaire, cultivez la culture pendant la nuit dans un incubateur à secouer à 200 tr/min et 37 degrés Celsius. Utilisez LB pour diluer la culture de un à 10, puis mesurez la densité optique à 600 nanomètres en fonction du résultat. Préparez une suspension de 1,5 millilitre de la bactérie avec une densité optique finale à 600 nanomètres de 0,5.

Granulez les bactéries dans une micro-centrifugeuse à 10, 600 fois G pendant 10 minutes. Retirez et jetez ensuite le surnageant. Pour extraire le LPS, préparez les solutions suivantes, un tampon XSDS, 4 % d’éthanol betta me capto ou BME 4 % SDS, et 20 % de glycérol dans 0,1 molaire tris HCL pH 6,8 avec une pincée de bleu de bromo phénol et 10 milligrammes par millilitre de solutions d’ADN un ARN et de protéinase K dans de l’eau distillée stérile remise en suspension.

Les bactéries granulées dans 200 microlitres d’un tampon XSDS garantissent que la pastille est complètement remise en suspension en pipetant la solution de haut en bas. Faites bouillir lentement les bactéries en suspension dans un bain-marie pendant 15 minutes. Laissez ensuite la solution refroidir à température ambiante pendant 15 minutes.

En option, ajoutez cinq microlitres de chacune des solutions d’ADN et d’ARN et incubez les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ajoutez 10 microlitres de la solution de protéase K et incubez les échantillons à 59 degrés Celsius pendant trois heures. À côté de chaque échantillon, ajoutez 200 microlitres de tris glacé, phénol saturé.

Fermez bien les bouchons et agitez chaque tube pendant cinq à 10 secondes. Incuber les échantillons à 65 degrés Celsius pendant 15 minutes. En vortexant, refroidissez-les de temps en temps à température ambiante.

Ensuite, sous une hotte, ajoutez un millilitre d’éther éthylique à température ambiante à chaque échantillon et agitez pendant cinq à 10 secondes. Centrifugez les échantillons à 20, 600 fois G pendant 10 minutes et retirez-les soigneusement de la centrifugeuse. Extrayez la couche bleue inférieure de chaque échantillon, en évitant la couche supérieure transparente.

Ajoutez 200 microlitres supplémentaires de tris glacé, du phénol saturé, et répétez l’extraction dans chaque tube. Ajouter 200 microlitres de deux tampons XSDS. Séparez cinq à 15 microlitres de chaque échantillon de LPS sur des gels de polyacrylamide de 8 à 15 % SDS.

Voici un gel de 12 % d’échantillons de LPS préparés à partir de différentes souches de patients atteints de mucoviscidose. Les différents modèles de bandes reflètent les différents nombres d’antigènes O, des unités répétitives attachées aux oligosaccharides du noyau. Un nombre similaire d’unités répétitives peut être observé dans les échantillons un et six.

N’oubliez pas que travailler avec du phénol dathyl ether peut être dangereux dans des précautions telles que le port d’un équipement de protection individuelle tel qu’une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de protection, et ces expériences doivent être effectuées dans une hotte pendant que vous tentez cette procédure. Il est important d’effectuer les extractions rapidement afin de ne pas perdre les échantillons pendant le traitement. À la suite de cette procédure, il faut procéder à un immuno-transfert Western ou à des méthodes permettant de visualiser le lipopolysaccharide par STR d’argent ou par d’autres méthodes afin de visualiser la parenté entre les souches.