Purification et visualisation de lipopolysaccharide de bactéries à Gram négatif par Hot-phénol aqueux d'extraction

L'objectif général de cette procédure est d'extraire le LPS des bactéries à Gram négatif. Pour ce faire, on commence par cultiver une culture bactérienne de cinq millilitres en milieu approprié pendant la nuit, puis on ajuste la densité optique de la culture à 600 nanomètres à 0,5. Ensuite, les bactéries sont centrifugées par microcentrifugation pour former un culot, et les cellules sont remises en suspension dans un tampon tris contenant du SDS et du beam ou du capto éthanol.

Ensuite, les lysats cellulaires sont portés à ébullition puis traités avec une protéase et une nucléase. Enfin, deux extractions séquentielles sont réalisées à l'aide de phénol aqueux chaud et d'éther. La phase aqueuse bleue est soigneusement séparée, éliminée et conservée. En définitive, les résultats obtenus permettent de déterminer la quantité ainsi que la présence ou l'absence de LPS et de souches bactériennes, ainsi que le mode de longueur des chaînes d'antigène O, grâce à une séparation par électrophorèse SDS-PAGE et à des analyses western blot avec des anticorps spécifiques des LPS ou par coloration directe des polysaccharides dans le gel.

L'avantage de cette technique par rapport au traitement par protéase de Hitchcock et Brown réside dans le fait qu'elle permet d'obtenir des échantillons de LPS purs, mieux résolus par électrophorèse SDS-PAGE et immunotransfert. Cette méthode peut fournir des informations sur la synthèse et la régulation du lipopolysaccharide in vivo dans pratiquement toutes les bactéries à Gram négatif, y compris Escherichia coli et Salmonella, ainsi que dans des agents pathogènes utilisés en défense biologique ou émergents tels que Ehrlichia et Acetobacter, respectivement. Pour la culture bactérienne, préparer une culture sur une nuit de bactéries à Gram négatif dans cinq millilitres de bouillon LB supplémenté en antibiotiques.

Si nécessaire, faire croître la culture toute la nuit dans un incubateur agité à 200 tr/min et à 37 degrés Celsius. Utiliser du LB pour diluer la culture d’un facteur 10, puis mesurer la densité optique à 600 nanomètres en fonction du résultat obtenu. Préparer une suspension de 1,5 millilitre de bactéries avec une densité optique finale à 600 nanomètres de 0,5.

Centrifuger les bactéries dans une microcentrifugeuse à 10 600 ×g pendant 10 minutes. Ensuite, retirer et jeter le surnageant. Pour extraire le LPS, préparer les solutions suivantes : un tampon XSDS, du 4 % BME (bêta-mercaptoéthanol) ou du 4 % SDS, et du 20 % glycérol dans du Tris-HCl 0,1 M pH 6,8 contenant une pincée de bleu de bromophénol, ainsi que des solutions à 10 milligrammes par millilitre d'ADNase, d'ARNase et de protéinase K dans de l'eau distillée stérile pour la resuspension.

Les bactéries en culot dans 200 microlitres de tampon XSDS doivent être complètement resuspendues par aspiration et expulsion répétées à l’aide d’une pipette. Faire bouillir lentement les bactéries en suspension dans un bain-marie pendant 15 minutes. Laisser ensuite la solution refroidir à température ambiante pendant 15 minutes.

Étape facultative : ajouter cinq microlitres de chacune des solutions d'ADN 1 et d'ARN et incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ajouter 10 microlitres de la solution de protéinase K et incuber les échantillons à 59 degrés Celsius pendant trois heures. Ajouter ensuite à côté de chaque échantillon 200 microlitres de phénol saturé au tampon tris glacé.

Fermez hermétiquement les bouchons et vortexez chaque tube pendant cinq à dix secondes. Incubez les échantillons à 65 degrés Celsius pendant 15 minutes. Pendant le vortexage, refroidissez-les occasionnellement à température ambiante.

Ensuite, sous une hotte, ajoutez un millilitre d'éther éthylique à température ambiante à chaque échantillon et vortexez pendant cinq à dix secondes. Centrifugez les échantillons à 20 600 ×g pendant 10 minutes, puis retirez-les délicatement de la centrifugeuse. Prélevez la couche inférieure bleue de chaque échantillon en évitant la couche supérieure claire.

Ajouter 200 microlitres supplémentaires de tris glacé, de phénol saturé, et répéter l'extraction dans chaque tube. Ajouter 200 microlitres de tampon 2 XSDS. Séparer cinq à 15 microlitres de chaque échantillon de LPS sur des gels d'acrylamide SDS à 8 à 15 %.

On observe ici un gel SDS-PAGE à 12 % de samples de LPS préparés à partir de différentes souches de *Burkholderia dolosa*, isolées d'échantillons de crachats de patients atteints de mucoviscidose. Les différents profils de bandes reflètent le nombre variable d'unités répétitives de l'antigène O liées aux oligosaccharides centraux. Un nombre similaire d'unités répétitives est visible dans les échantillons un et six.

N'oubliez pas que manipuler le phénol dathyle éther peut présenter des risques ; des précautions telles que le port d'équipements de protection individuelle, comme une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de protection, doivent être prises, et ces expériences doivent être réalisées sous hotte chimique lors de la mise en œuvre de ce protocole. Il est important d'effectuer rapidement les extractions afin de ne pas perdre les échantillons pendant le traitement. Après ce protocole, un immunoblotting Western ou d'autres méthodes permettant de visualiser le lipopolysaccharide par coloration argentique STR ou par d'autres techniques doivent être utilisés afin de visualiser les relations entre les souches.