Identification et isolement des cellules ne se divisant lentement dans le glioblastome humain Utilisation carboxy fluorescéine succinimidyl ester (CFSE)

Ce protocole vidéo illustre l'identification et l'isolement de cellules à division lente dans le glioblastome humain à l'aide du carboxy fluorescéine diacétate succinimidyle, CFSE. Les cellules tumorales du glioblastome sont d'abord cultivées selon le test en neurosphère. Ensuite, les neurosphères obtenues sont dissociées en cellules individuelles et marquées au CFSE.

Les cellules chargées au CFSE sont replaquées. En culture de neurosphères, les sphères obtenues sont dissociées en cellules individuelles puis analysées par cytométrie en flux. Les cellules à division lente et rapide sont identifiées et triées en fonction de l'intensité de fluorescence, qui varie selon le nombre de divisions cellulaires.

L'hétérogénéité fréquentielle est une caractéristique essentielle du cancer. Cette hétérogénéité soutient la robustesse tumorale et constitue un obstacle majeur au développement de traitements pleinement efficaces. Il est donc essentiel de développer des outils et des tests permettant d'étudier et de comprendre cette hétérogénéité définie sur les plans génétique, phénotypique et fonctionnel.

Dans ce protocole vidéo, nous décrivons une méthode établie utilisant les flues et I-C-F-S-C. Cette technique permet l'identification et la séparation par cytométrie en flux de sous-populations individuelles au sein d'une culture de cellules dérivées de glioblastome humain possédant différentes caractéristiques fonctionnelles. Nous avons utilisé cette technique pour isoler et caractériser une population tumorale de cellules présentant un taux de division lent, une propriété fonctionnelle qui s'est révélée associée à l'initiation tumorale dans les gliomes. La culture de sphéroïdes tumorales est établie et maintenue à l'aide du test de neurosphère, décrit dans une vidéo distincte à l'adresse affichée à l'écran.

Lorsque les sphères de gliome atteignent une taille de 150 à 200 microns de diamètre, le milieu contenant les sphères est retiré et placé dans un tube stérile de culture tissulaire de taille appropriée, puis centrifugé à 800 tr/min ou 110 G pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, le surnageant est éliminé et le culot de sphères est resuspendu dans un millilitre de trypsine-EDTA préchauffée et incubé à 37 degrés dans un bain-marie pendant trois à cinq minutes. Un volume équivalent d'inhibiteur de trypsine est alors ajouté en pipetant doucement plusieurs fois vers le haut et vers le bas afin de dissocier les sphères.

La suspension cellulaire est à nouveau centrifugée. Le surnageant est éliminé et les cellules sont reprises dans un millilitre de milieu basal pour cellules souches neuronales. Dix microlitres de la suspension cellulaire unique sont bien mélangés avec 90 microlitres de bleu de tripan, et un dénombrement cellulaire est effectué pour chaque million de cellules à colorer.

Un millilitre de réactif de marquage est préparé en ajoutant un microlitre de colorant CFSE à cinq millimolaire à un millilitre de milieu basal pour cellules souches neurales, afin d'obtenir une concentration finale de marquage de cinq micromolaire. Le mélange est ensuite homogénéisé soigneusement. Le nombre souhaité de cellules est alors transféré dans un tube séparé, centrifugé, et le surnageant est éliminé.

La solution de coloration au CFSE est ensuite ajoutée au culot et mélangée délicatement jusqu'à homogénéité, puis incubée à température ambiante pendant 10 minutes afin de stopper le processus de coloration. Cinq à dix volumes de milieu basal froid pour cellules souches neuronales sont ajoutés aux cellules chargées au CFSE et mélangés soigneusement. La suspension cellulaire est ensuite centrifugée et le surnageant est éliminé.

À ce stade, une pellicule de cellules devrait apparaître au fond du tube avec une teinte verte indiquant que la coloration a réussi. Pour éliminer l'excès de colorant CFSE, deux à trois lavages sont effectués par resuspension du culot dans un millilitre de milieu basal pour cellules souches neuronales, centrifugation et décantation du surnageant.

Après le troisième lavage, les cellules sont reprises dans un ml de milieu basal pour cellules souches neurales, et un dénombrement cellulaire est effectué comme décrit précédemment afin de semer les cellules. Le milieu complet pour cellules souches neurales est supplémenté avec du EGF à une concentration finale de 20 nanogrammes par ml. Ensuite, les cellules provenant des groupes chargés et non chargés au CFSE sont ajoutées à leurs tubes respectifs pour atteindre une concentration finale de 50 000 cellules par ml.

Ensuite, les suspensions cellulaires sont soigneusement mélangées et ensemencées dans des flacons stériles pour culture tissulaire. Les flacons sont alors étiquetés. Les cellules peuvent être observées au microscope à fluorescence afin de vérifier la coloration par le CFSE, puis placées dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant cinq à dix jours.

Pour vérifier la coloration au CFSE par cytométrie en flux, 500 000 cellules provenant des groupes témoins négatifs chargés et non chargés au CFSE sont transférées dans des tubes FACS distincts. Le cytomètre en flux est réglé conformément aux instructions du manuel utilisateur relatives aux paramètres. Tout d'abord, les cellules du témoin non chargé sont analysées et les évènements sont enregistrés selon les propriétés de diffusion avant et latérale, puis sur un histogramme représentant la fréquence cellulaire en fonction de l'intensité du CFSE, la population principale de cellules est sélectionnée afin de vérifier le niveau d'intensité de fluorescence du CFSE.

Ensuite, les cellules chargées de CFSE sont analysées en utilisant les mêmes paramètres que ceux utilisés pour les cellules témoins, comme il est évident. Les cellules positives au CFSE présentent une intensité de fluorescence supérieure de plusieurs ordres de grandeur à celle des cellules témoins. Lorsque les sphéroïdes de gliome ont atteint une taille moyenne d’environ 150 à 200 microns de diamètre.

Les sphères sont repiquées et une suspension monocellulaire est préparée à partir des deux groupes, chargés et non chargés de CFSE, comme décrit précédemment. Ensuite, les cellules sont remises en suspension dans un volume approprié de PBS stérile à une fois, et un décompte cellulaire est effectué afin d'exclure les cellules mortes ou endommagées. Lors du tri par cytométrie en flux, de l'iodure de propidium est ajouté à une concentration d'un microlitre par ml de suspension cellulaire afin de récupérer les cellules se divisant lentement et celles se divisant rapidement.

Lors du tri, deux tubes stériles de culture tissulaire de 15 ml sont préparés, chacun contenant 1 ml de milieu complet pour cellules souches neurales. Ensuite, les cellules sont placées sur de la glace pendant leur transfert vers le laboratoire de cytométrie en flux. Tout d'abord, la suspension cellulaire du groupe de cellules non marquées est analysée par cytométrie en flux.

Les événements sont tracés en fonction de la diffusion directe par rapport à la diffusion latérale afin d'exclure les cellules mortes ou endommagées. Les cellules sont tracées en fonction de la diffusion latérale par rapport à la réactivité au PI, et une population unique de cellules vivantes est sélectionnée comme population un. Ensuite, une population cellulaire homogène issue de la population un est choisie en fonction des propriétés de diffusion directe et latérale, puis sélectionnée comme population deux. La population deux est ensuite représentée sous forme d'histogramme en fonction de la fréquence cellulaire par rapport à l'intensité de la CFSE, échelle logarithmique, en utilisant les mêmes paramètres et stratégie de sélection.

Les cellules marquées au CFSE sont analysées par cytométrie en flux. Ensuite, les 85 % inférieurs des cellules sont sélectionnés comme cellules à division rapide et les 5 % supérieurs sont sélectionnés comme cellules à division lente. Ces différentes populations cellulaires d'intérêt sont choisies et triées dans des tubes stériles de culture tissulaire de 15 ml contenant un ml de milieu complet pour cellules souches neuronales.

Le débit de tri doit être ajusté de manière à ne pas dépasser 2 500 événements par seconde. Après avoir terminé le tri, les cellules sont centrifugées, le surnageant est éliminé et le culot est repris dans un volume adéquat de milieu, puis un dénombrement cellulaire est effectué. Ensuite, les cellules provenant des différentes populations triées sont mises en culture à une densité de 50 000 cellules par ml.

Dans un milieu complet pour cellules souches neuronales, supplémenté avec 20 nanogrammes par mL d'EGF, les cellules sont ensuite incubées pendant cinq à 10 jours afin de former des sphéroïdes. Ceci est un exemple de cellules. Peu de temps après le marquage avec le colorant CFSE, toutes les cellules présentent une fluorescence verte intense, telle qu'observée au microscope à fluorescence.

Il s'agit d'une image d'une sphère de gliome représentative, issue de cellules chargées avec A-C-F-S-E, six jours après leur ensemencement. Remarquez que certaines cellules présentent encore une coloration CFSE très intense. Ceci est un exemple d'histogramme de cytométrie en flux montrant que l'intensité du CFSE diminue au fil du temps.

Le bleu représente les cellules fraîchement chargées avec le CFSE, montrant une intensité de fluorescence. Celle-ci est supérieure de plusieurs ordres de grandeur à celle des cellules non chargées, représentées en rouge. Le vert représente l'intensité de fluorescence ayant décru sur une période de six jours après le chargement avec le CFSE, en raison de la division cellulaire.

Il s'agit de sphères représentatives cultivées sept jours après l'isolement de populations cellulaires à division rapide et lente. Les fréquences de formation de sphères ne diffèrent pas entre les deux groupes, mais les cellules qui conservent le CFSC se divisent plus lentement et forment des sphères plus petites par rapport aux cellules qui diluent le CFSC. L'utilisation du CFSC pour identifier et isoler des sous-populations cellulaires en fonction du taux de division cellulaire constitue un point de départ pour des expériences ultérieures et des caractérisations supplémentaires.

Ce protocole fournit un exemple d'identification des cellules à division lente dans une culture dérivée de gliome humain, mais il peut également être appliqué à d'autres types de cellules tumorales ou à des systèmes non cancéreux. Merci d'avoir regardé et nous espérons que ce protocole vous sera utile pour vos recherches.