Name: Identification et isolement des cellules ne se divisant lentement dans le glioblastome humain Utilisation carboxy fluorescéine succinimidyl ester (CFSE) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Découvrez comment identifier et isoler les cellules à division lente dans le glioblastome humain en utilisant le marqueur CFSE et la cytométrie en flux. Cette méthode permet d'étudier l'hétérogénéité tumorale et d'améliorer les stratégies thérapeutiques ciblées.

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Ce travail a été soutenu par le Centre de la Floride pour la recherche tumeurs cérébrales, l&#39;Preston A. Wells Jr. centre de thérapie tumeur au cerveau et le National Institutes of Health (1R21CA141020-01).

1. Préparation de la suspension de cellules de glioblastome unique <ol><li> Gliomasphere culture est établie et maintenue en utilisant le test de neurosphères (NSA) comme décrit précédemment 2,11,12. </li><li> Au moment approprié pour les passages gliomaspheres, le milieu contenant les sphères est enlevé, placé dans une taille stérile tube approprié culture de tissus, et centrifugé à 800 tours par minute (110 g) pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Le surnageant est éliminé et le culot est remis en suspension de sphères dans 1 ml de 0,05% de trypsine-EDTA et incubées à 37 ° C dans un bain d&#39;eau pendant 3-5 min. </li><li> Un volume égal d&#39;inhibiteur de trypsine de soja est ensuite utilisé pour arrêter l&#39;activité trypsine. </li><li> La suspension cellulaire est doucement introduit à la pipette de haut en bas pour assurer l&#39;homogénéité et la neutralisation complète de l&#39;activité de la trypsine. </li><li> La suspension cellulaire est à nouveau centrifugé à 800 tours par minute pendant 5 min. Le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans 1 ml de NeuroCultNSC milieu de base. </li><li> 10 pl de la suspension à cellule unique est mélangée avec 90μl de bleu trypan à effectuer un comptage des cellules. </li></ol> 2. La coloration avec la revue Cell Trace Carboxyfluorescein succinimidylester (CFSE) Teinture verte fluorescente <ol><li> Pour chaque 1 million de cellules à colorer, 1 ml de réactif de coloration est préparée en ajoutant 1 pi de 5 mM de cellules CFSE colorant Trace (Molecular Probes, Invitrogen) à 1 ml de milieu de base NeuroCult NSC pour obtenir une concentration finale de coloration 5 uM . </li><li> Le réactif de coloration contenant les cellules est bien mélangé jusqu&#39;à homogénéité et incubée à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Pendant l&#39;incubation, glacée NeuroCult NSC milieu de base est préparée comme la solution de trempe. </li><li> Pour arrêter le processus de coloration, les volumes environ 5-10 de solution d&#39;arrêt glacée est ajoutée aux cellules CFSE-chargés. </li><li> La solution est ensuite centrifugée à 800 rpm pendant 5 min et le surnageant est éliminé. </li><li> A eest le point, il doit apparaître une pastille de cellules au fond du tube avec une teinte vert clair de couleur, indiquant la coloration a été couronnée de succès. </li><li> Les cellules sont lavées par remise en suspension du culot dans 1-2 ml de frais NeuroCult NSC milieu de base, la centrifugation à 800 rpm pendant 5 min et élimination du surnageant. Cette procédure est répétée pour un total de trois lavages. </li><li> Après le troisième lavage, les cellules sont remises en suspension dans 1 ml de milieu de base NeuroCult NSC et une numération cellulaire est effectuée. </li><li> Les cellules CFSE colorées sont ensuite étalées dans des flacons de culture de tissus stériles à une densité appropriée [50.000 cellules / ml] et placé dans un 37 ° C / 5% de CO2 incubateur humidifié. </li></ol> 3. Vérification en cours de chargement CFSE <ol><li> Cellules ensemencées dans la culture NSA peut être contrôlé au microscope à fluorescence afin de vérifier coloration CFSE. A ce stade, toutes les cellules présentent lumineux de couleur verte (Figure 1). En variante, une goutte de la suspension de cellules à partir deCellules colorées CFSE pourrait être placée sur une lame de microscope et recouverte d&#39;une lamelle couvre-objet à visualiser les cellules au microscope fluorescent. </li><li> Étiquetage CFSE réussie est confirmée par cytométrie en flux. Pas moins de 1-5 x 10 5 cellules de chaque groupe est suffisant pour la vérification de coloration CFSE. Le CFSE chargés et déchargés cellules cellules témoins négatifs sont remises en suspension dans respectivement 1 x-PBS ou NeuroCult NSC milieu de base pour un volume total de 500 ul et placés dans des tubes FACS séparés. </li><li> Le cytomètre de flux est ajusté en fonction de ses instructions mode d&#39;emploi pour les paramètres associés. CFSE a une longueur d&#39;onde d&#39;excitation maximale de 492 nm et le maximum d&#39;émission de 517 nm. </li><li> Tout d&#39;abord, les cellules témoins non chargées sont exécutées et les événements acquis sont enregistrés dans dispersion vers l&#39;avant et le côté (FSC vs SSC) et des parcelles histogramme, et la population de cellules principale est fermée (figure 2A). </li><li> De même, les cellules CFSE chargés sont analysées en utilisant le même paramètres utilisé pour les cellules de contrôle (figure 2B). </li></ol> 4. Isolement de la lente séparation [CFSE soit retenue] Population cellule à l&#39;aide Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) <ol><li> Lors de la division, de l&#39;intensité CFSE est diminuée et les cellules hGBM former gliomaspheres qui sont composées de cellules présentant différents niveaux d&#39;intensité de fluorescence verte (Figure 3). Lorsque les gliomaspheres ont atteint une taille moyenne d&#39;environ 150-200 pm de diamètre (environ 5 à 10 jours après chargement CFSE en fonction de la vitesse de croissance de la lignée cellulaire), le milieu contenant les sphères est enlevé, placé dans une culture tissulaire stérile de taille appropriée tube et centrifugée à 800 rpm pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Une suspension à cellule unique est préparé de la manière décrite dans les étapes précédentes, et les cellules sont remises en suspension dans du PBS pendant un nombre de cellules afin de préparer une suspension de cellules avec une densité allant jusqu&#39;à 10 7 cellules par millilitre. </li><li> À l&#39;arrièreer remettre en suspension les cellules dans un volume approprié de PBS, l&#39;iodure de propidium (PI, Sigma, 500 pg / ml) est ajouté à une concentration de 1 ug / ml de suspension cellulaire à exclure les cellules mortes lors du tri / analysés par cytométrie en flux. </li><li> Deux 15 ml stériles tubes de culture cellulaire contenant chacun 1 ml de NeuroCult complet NSC moyen est utilisé pour collecter les cellules triées lente séparation (cellules CFSE de retenue) et les cellules rapides de division (cellules CFSE dilution). </li><li> Tout d&#39;abord, la suspension de cellules dans le groupe de cellules non chargée est exécutée à travers le cytomètre de flux. </li><li> Les cellules (événements) sont tracées sur la base de diffusion vers l&#39;avant (FSC) contre side scatter (SSC) et les paramètres de tension pour les deux paramètres sont réglés de telle sorte que la majorité des cellules sont inclus dans le complot de flux. </li><li> Pour exclure les cellules mortes ou endommagées, les cellules sont tracées en fonction de la réactivité par rapport SSC PI et la population seule cellule vivante (PI négatif) est fermée. </li><li> Ensuite, une population homogène de cellules est sélectionnée en fonction fscatter scatter orward (FSC) par rapport latéral (SSC). </li><li> La seule population homogène de cellules vivantes est ensuite tracée dans un histogramme basé sur la fréquence de cellules CFSE mis en fonction de l&#39;intensité sur une échelle logarithmique. L&#39;intensité du laser est ajustée CFSE pour placer le signal négatif entre 0 et 100. </li><li> En utilisant les mêmes paramètres et une stratégie de déclenchement similaire, les cellules CFSE étiquetés sont passés à travers le cytomètre en flux et analysées (figure 4C). </li><li> Par la suite, une population de cellules divisant lente et une population globale (cellules en division rapide) sont identifiés en fonction de leur capacité à retenir CFSE (CFSE haut-dessus de 5% et CFSE bas-fond de 85%, respectivement). </li><li> Ces différentes populations de cellules sont ensuite triées dans différents tubes stériles de 15 ml de culture de tissus contenant 1 ml de milieu complet NSC. </li><li> Les cellules triées sont ensuite centrifugées à 800 rpm pendant 5 min. </li><li> Surnageant est éliminé et le culot est remis en suspension dans une approle volume approprié de milieu (en fonction du nombre d&#39;événements isolés ou la taille de pastille) et une numération cellulaire est effectuée. </li><li> Les cellules provenant de différentes populations triées sont ensuite étalées à 50.000 cellules par millilitre dans une fiole appropriée tissus stériles culture et placé dans un 37 ° C / 5% incubateur à CO2 humidifié pendant 5-10 jours avant d&#39;être des passages en série ou utilisés pour des expériences en aval. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Après le chargement CFSE, toutes les cellules présentent une fluorescence verte intense que visualisé au microscope (Figure 1). Cette couleur verte teintée peut être vu, même à l&#39;œil nu (voir la vidéo). L&#39;analyse de ces cellules avec la cytométrie en flux montre également très intense fluorescence verte par rapport aux cellules témoins (Figure 2). Sur les cellules CFSE placage chargés de la culture de neurosphères, ces cellules prolifèrent et forment 150-200 gliomaspheres um dans 5-10 jours. Comme les cellules prolifèrent, t<html> Il colorant fluorescent est également réparti entre les cellules filles lors des divisions, conduisant à la réduction de moitié de l&#39;intensité de fluorescence avec chaque division cellulaire. Glioblastomes sont fonctionnellement hétérogènes et sont constituées de cellules en prolifération sur des échelles de temps différentes. La méthode décrite dans ce protocole permet d&#39;identifier et d&#39;isoler rapides et lents cellules qui se divisent en vertu de leur capacité de diluer ou de conserver CFSE, respectivement (figure 3, voir aussi la vidéo). Analyse par cytométrie en flux de gliomaspheres dissociées générés à partir de cellules chargées CFSE par rapport aux cellules non chargées démontre diverses propriétés de rétention CFSE (figure 4). Cellules en division rapide (en bas 85%) ou lents cellules en division (les 5% - haute CFSE) gliomapshere exposition capacité à former lorsqu&#39;elles sont cultivées dans les conditions d&#39;essai neurosphères (figure 5). gure 1 &quot;/&gt; Figure 1. Cellules tumorales dissociées immédiatement après le chargement d&#39;un colorant CFSE. Les cellules présentent lumineux de couleur verte démontrant l&#39;étiquetage succès. Grossissement, 10 x. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Confirmation chargement CFSE par cytométrie en flux. A) des cellules non chargées, B) CFSE chargé cellules et c) comparer l&#39;intensité de fluorescence dans des cellules CFSE chargés par rapport à vide. Notez qu&#39;il ya plusieurs ordres de grandeur de différence dans l&#39;intensité de fluorescence entre les cellules marquées et non marquées. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig3.jpg" alt="Figure 3" /> La figure 3. Gliomasphere Un représentant dérivée d&#39;une cellule chargée par CFSE 6 jours après l&#39;étalement. Certaines cellules présentent une coloration CFSE très lumineux. Grossissement, 63 x. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/3918/3918fig4.jpg&quot; alt = &quot;Figure 4&quot; /&gt; Figure 4. Représentant cytométrie de flux parcelles / histogrammes pour l&#39;isolement de rapides et lents cellules en division 6 jours après coloration CFSE. Une réactivité) FSC vs SSC montrer à la population cellule entière, B) SSC vs PI à exclure les cellules mortes ou endommagées, C) FSC vs SSC à la porte d&#39;une population cellulaire homogène en direct, D) Démontrer la présence de cellules CFSE de retenue 6 jours après le marquage CFSE comme en témoigne une plus grande intensité de la fluorescence par rapport au contrôle négatif. L&#39;histogramme montre également que l&#39;intensité CFSE pourri au fil du temps. E) Histogramme affichant la stratégie de déclenchement pour identifier les cellules CFSE de retenue (top 5%) et les cellules CFSE dilution (en bas de 85%). <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Gliomaspheres Représentant Figure 5. Générées à partir de <stronG&gt; A) de division rapide des cellules-bas (CFSE) et des cellules B) lente séparation (CFSE haut). Grossissement:. 10x et 20x respectivement C) représentant le nombre de cellules obtenues à partir de division rapide ou lent dérivé des cellules de culture au temps de passage. P &lt;0,05, test t. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3918/3918fig5large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Un nombre croissant d&#39;études ont démontré l&#39;importance d&#39;une lente séparation sous-compartiment des cellules dans le cancer qui contribuent à la formation de tumeurs et 2-8 la résistance au traitement. Par conséquent, il est essentiel de décrire et de standardiser les méthodes expérimentales permettant l&#39;étude de cette sous-population spécifique de cellules ou plus généralement de comparer des sous-populations avec des taux de croissance différents. Utilisation CFSE pour identifier et isoler d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Type </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC milieu de base (Human) </td><td> Moyen </td><td> Technologies des cellules souches </td><td> 05750 </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC suppléments prolifération (Human) </td><td> Supplément de milieu </td><td> Technologies des cellules souches </td><td> 05753 </td></tr><tr><td> 0,05% de trypsine-EDTA </td><td> Réactif </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td></tr><tr><td> Inhibiteur de la trypsine du soja </td><td> Réactif </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td></tr><tr><td> Pénicilline / Streptomycine </td><td> Réactif </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> T25 flacon </td><td> Culture de conservation </td><td> Nalge Nunc internationale </td><td> 136196 </td></tr><tr><td> T80 flacon </td><td> Culture de conservation </td><td> Nalge Nunc internationale </td><td> 178905 </td></tr><tr><td> Tubes de 15 ml </td><td> Culture de conservation </td><td> BD Falcon </td><td> 352096 </td></tr><tr><td> Tubes de 50 ml </td><td> Culture de conservation </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> FEM </td><td> Facteur de croissance </td><td> R &amp; D </td><td> 2028-EG </td></tr><tr><td> CFSE CellTrace cellulaire Kit prolifération </td><td> Division cellulaire fluorescent Suivi Dye </td><td> Molecular Probes, Invitrogen </td><td> C34554 </td></tr></tbody></table>

identification et isolement des cellules ne se divisant lentement dans le glioblastome humain utilisation carboxy fluorescéine succinimidyl ester (cfse)

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Hétérogénéité tumorale représente une caractéristique fondamentale soutenant la robustesse de la tumeur et présente un obstacle majeur au développement de stratégies thérapeutiques 1. Pour surmonter le problème de l&#39;hétérogénéité tumorale, il est essentiel de développer des tests et des outils permettant phénotypique, (épi) l&#39;identification génétique et fonctionnelle et la caractérisation des sous-populations tumorales qui conduisent pathologies spécifiques aux maladies et représentent des cibles cliniquement pertinentes. Il est maintenant bien établi que les tumeurs présentent distinct sous-fractions de cellules avec des fréquences différentes de la division cellulaire, et que les critères fonctionnels d&#39;être lent vélo est positivement associée à la capacité de formation de tumeurs dans plusieurs cancers, notamment ceux du cerveau, du sein, de la peau et pancréas et leucémie 2-8. Le colorant fluorescent carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) a été utilisée pour suivre la fréquence de division des cellules in vitro et in vivo dans le sang tumors et des tumeurs solides tels que le glioblastome 2,7,8. La cellule-perméant non fluorescent pro-drogue de CFSE est converti par les estérases intracellulaires en un composé fluorescent, qui est retenu à l&#39;intérieur des cellules par liaison covalente à des protéines par réaction de son radical succinimidyle avec des groupes amine intracellulaires pour former des liaisons amide stables 9. Le colorant fluorescent est également réparti entre les cellules filles lors des divisions, conduisant à la réduction de moitié de l&#39;intensité de fluorescence avec chaque division cellulaire. Cela permet le suivi de la fréquence du cycle cellulaire jusqu&#39;à huit à dix tours de la division 10. Capacité de rétention CFSE a été utilisé avec des cellules tumorales du cerveau pour identifier et isoler une sous-population vélo lente (top 5% colorant retenue cellules) a démontré d&#39;être enrichie en activité des cellules souches du cancer 2. Ce protocole décrit la technique de coloration des cellules avec CFSE et l&#39;isolement des populations individuelles au sein d&#39;une culture de l&#39;homme glioblastome (GBM) dérivés de cellules possédant des taux de division différents en utilisant 2 cytométrie en flux. La technique a permis d&#39;identifier et d&#39;isoler une tumeur au cerveau lent vélo population de cellules en raison de leur capacité à retenir l&#39;étiquetage CFSE.

Ce protocole vidéo montre l&#39;application de la teinture fluorescente carboxyfluorescéine succinimidylester (CFSE) pour l&#39;identification et la séparation des différentes sous-populations de cellules de glioblastome humain basé sur la fréquence de la division cellulaire.

Identification et isolement des cellules ne se divisant lentement dans le glioblastome humain Utilisation carboxy fluorescéine succinimidyl ester (CFSE)

L'hétérogénéité tumorale représente une caractéristique fondamentale soutenant la robustesse des tumeurs et constitue un obstacle central au développement de thérapies...

Ce protocole vidéo illustre l'identification et l'isolement de cellules à division lente dans le glioblastome humain à l'aide du carboxy fluorescéine diacétate succinimidyle, CFSE. Les cellules tumorales du glioblastome sont d'abord cultivées selon le test en neurosphère. Ensuite, les neurosphères obtenues sont dissociées en cellules individuelles et marquées au CFSE.Les cellules chargées au CFSE sont replaquées. En culture de neurosphères, les sphères obtenues sont dissociées en cellules individuelles puis analysées par cytométrie en flux. Les cellules à division lente et rapide sont identifiées et triées en fonction de l'intensité de fluorescence, qui varie selon le nombre de divisions cellulaires.L'hétérogénéité fréquentielle est une caractéristique essentielle du cancer. Cette hétérogénéité soutient la robustesse tumorale et constitue un obstacle majeur au développement de traitements pleinement efficaces. Il est donc essentiel de développer des outils et des tests permettant d'étudier et de comprendre cette hétérogénéité définie sur les plans génétique, phénotypique et fonctionnel.Dans ce protocole vidéo, nous décrivons une méthode établie utilisant les flues et I-C-F-S-C. Cette technique permet l'identification et la séparation par cytométrie en flux de sous-populations individuelles au sein d'une culture de cellules dérivées de glioblastome humain possédant différentes caractéristiques fonctionnelles. Nous avons utilisé cette technique pour isoler et caractériser une population tumorale de cellules présentant un taux de division lent, une propriété fonctionnelle qui s'est révélée associée à l'initiation tumorale dans les gliomes. La culture de sphéroïdes tumorales est établie et maintenue à l'aide du test de neurosphère, décrit dans une vidéo distincte à l'adresse affichée à l'écran.Lorsque les sphères de gliome atteignent une taille de 150 à 200 microns de diamètre, le milieu contenant les sphères est retiré et placé dans un tube stérile de culture tissulaire de taille appropriée, puis centrifugé à 800 tr/min ou 110 G pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, le surnageant est éliminé et le culot de sphères est resuspendu dans un millilitre de trypsine-EDTA préchauffée et incubé à 37 degrés dans un bain-marie pendant trois à cinq minutes. Un volume équivalent d'inhibiteur de trypsine est alors ajouté en pipetant doucement plusieurs fois vers le haut et vers le bas afin de dissocier les sphères.La suspension cellulaire est à nouveau centrifugée. Le surnageant est éliminé et les cellules sont reprises dans un millilitre de milieu basal pour cellules souches neuronales. Dix microlitres de la suspension cellulaire unique sont bien mélangés avec 90 microlitres de bleu de tripan, et un dénombrement cellulaire est effectué pour chaque million de cellules à colorer.Un millilitre de réactif de marquage est préparé en ajoutant un microlitre de colorant CFSE à cinq millimolaire à un millilitre de milieu basal pour cellules souches neurales, afin d'obtenir une concentration finale de marquage de cinq micromolaire. Le mélange est ensuite homogénéisé soigneusement. Le nombre souhaité de cellules est alors transféré dans un tube séparé, centrifugé, et le surnageant est éliminé.La solution de coloration au CFSE est ensuite ajoutée au culot et mélangée délicatement jusqu'à homogénéité, puis incubée à température ambiante pendant 10 minutes afin de stopper le processus de coloration. Cinq à dix volumes de milieu basal froid pour cellules souches neuronales sont ajoutés aux cellules chargées au CFSE et mélangés soigneusement. La suspension cellulaire est ensuite centrifugée et le surnageant est éliminé.À ce stade, une pellicule de cellules devrait apparaître au fond du tube avec une teinte verte indiquant que la coloration a réussi. Pour éliminer l'excès de colorant CFSE, deux à trois lavages sont effectués par resuspension du culot dans un millilitre de milieu basal pour cellules souches neuronales, centrifugation et décantation du surnageant.Après le troisième lavage, les cellules sont reprises dans un ml de milieu basal pour cellules souches neurales, et un dénombrement cellulaire est effectué comme décrit précédemment afin de semer les cellules. Le milieu complet pour cellules souches neurales est supplémenté avec du EGF à une concentration finale de 20 nanogrammes par ml. Ensuite, les cellules provenant des groupes chargés et non chargés au CFSE sont ajoutées à leurs tubes respectifs pour atteindre une concentration finale de 50 000 cellules par ml.Ensuite, les suspensions cellulaires sont soigneusement mélangées et ensemencées dans des flacons stériles pour culture tissulaire. Les flacons sont alors étiquetés. Les cellules peuvent être observées au microscope à fluorescence afin de vérifier la coloration par le CFSE, puis placées dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant cinq à dix jours.Pour vérifier la coloration au CFSE par cytométrie en flux, 500 000 cellules provenant des groupes témoins négatifs chargés et non chargés au CFSE sont transférées dans des tubes FACS distincts. Le cytomètre en flux est réglé conformément aux instructions du manuel utilisateur relatives aux paramètres. Tout d'abord, les cellules du témoin non chargé sont analysées et les évènements sont enregistrés selon les propriétés de diffusion avant et latérale, puis sur un histogramme représentant la fréquence cellulaire en fonction de l'intensité du CFSE, la population principale de cellules est sélectionnée afin de vérifier le niveau d'intensité de fluorescence du CFSE.Ensuite, les cellules chargées de CFSE sont analysées en utilisant les mêmes paramètres que ceux utilisés pour les cellules témoins, comme il est évident. Les cellules positives au CFSE présentent une intensité de fluorescence supérieure de plusieurs ordres de grandeur à celle des cellules témoins. Lorsque les sphéroïdes de gliome ont atteint une taille moyenne d’environ 150 à 200 microns de diamètre.Les sphères sont repiquées et une suspension monocellulaire est préparée à partir des deux groupes, chargés et non chargés de CFSE, comme décrit précédemment. Ensuite, les cellules sont remises en suspension dans un volume approprié de PBS stérile à une fois, et un décompte cellulaire est effectué afin d'exclure les cellules mortes ou endommagées. Lors du tri par cytométrie en flux, de l'iodure de propidium est ajouté à une concentration d'un microlitre par ml de suspension cellulaire afin de récupérer les cellules se divisant lentement et celles se divisant rapidement.Lors du tri, deux tubes stériles de culture tissulaire de 15 ml sont préparés, chacun contenant 1 ml de milieu complet pour cellules souches neurales. Ensuite, les cellules sont placées sur de la glace pendant leur transfert vers le laboratoire de cytométrie en flux. Tout d'abord, la suspension cellulaire du groupe de cellules non marquées est analysée par cytométrie en flux.Les événements sont tracés en fonction de la diffusion directe par rapport à la diffusion latérale afin d'exclure les cellules mortes ou endommagées. Les cellules sont tracées en fonction de la diffusion latérale par rapport à la réactivité au PI, et une population unique de cellules vivantes est sélectionnée comme population un. Ensuite, une population cellulaire homogène issue de la population un est choisie en fonction des propriétés de diffusion directe et latérale, puis sélectionnée comme population deux. La population deux est ensuite représentée sous forme d'histogramme en fonction de la fréquence cellulaire par rapport à l'intensité de la CFSE, échelle logarithmique, en utilisant les mêmes paramètres et stratégie de sélection.Les cellules marquées au CFSE sont analysées par cytométrie en flux. Ensuite, les 85 % inférieurs des cellules sont sélectionnés comme cellules à division rapide et les 5 % supérieurs sont sélectionnés comme cellules à division lente. Ces différentes populations cellulaires d'intérêt sont choisies et triées dans des tubes stériles de culture tissulaire de 15 ml contenant un ml de milieu complet pour cellules souches neuronales.Le débit de tri doit être ajusté de manière à ne pas dépasser 2 500 événements par seconde. Après avoir terminé le tri, les cellules sont centrifugées, le surnageant est éliminé et le culot est repris dans un volume adéquat de milieu, puis un dénombrement cellulaire est effectué. Ensuite, les cellules provenant des différentes populations triées sont mises en culture à une densité de 50 000 cellules par ml.Dans un milieu complet pour cellules souches neuronales, supplémenté avec 20 nanogrammes par mL d'EGF, les cellules sont ensuite incubées pendant cinq à 10 jours afin de former des sphéroïdes. Ceci est un exemple de cellules. Peu de temps après le marquage avec le colorant CFSE, toutes les cellules présentent une fluorescence verte intense, telle qu'observée au microscope à fluorescence.Il s'agit d'une image d'une sphère de gliome représentative, issue de cellules chargées avec A-C-F-S-E, six jours après leur ensemencement. Remarquez que certaines cellules présentent encore une coloration CFSE très intense. Ceci est un exemple d'histogramme de cytométrie en flux montrant que l'intensité du CFSE diminue au fil du temps.Le bleu représente les cellules fraîchement chargées avec le CFSE, montrant une intensité de fluorescence. Celle-ci est supérieure de plusieurs ordres de grandeur à celle des cellules non chargées, représentées en rouge. Le vert représente l'intensité de fluorescence ayant décru sur une période de six jours après le chargement avec le CFSE, en raison de la division cellulaire.Il s'agit de sphères représentatives cultivées sept jours après l'isolement de populations cellulaires à division rapide et lente. Les fréquences de formation de sphères ne diffèrent pas entre les deux groupes, mais les cellules qui conservent le CFSC se divisent plus lentement et forment des sphères plus petites par rapport aux cellules qui diluent le CFSC. L'utilisation du CFSC pour identifier et isoler des sous-populations cellulaires en fonction du taux de division cellulaire constitue un point de départ pour des expériences ultérieures et des caractérisations supplémentaires.Ce protocole fournit un exemple d'identification des cellules à division lente dans une culture dérivée de gliome humain, mais il peut également être appliqué à d'autres types de cellules tumorales ou à des systèmes non cancéreux. Merci d'avoir regardé et nous espérons que ce protocole vous sera utile pour vos recherches.

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Identification et isolement des cellules ne se divisant lentement dans le glioblastome humain Utilisation carboxy fluorescéine succinimidyl ester (CFSE) (Vidéo) | JoVE Journal

Identification et isolement des cellules ne se divisant lentement dans le glioblastome humain Utilisation carboxy fluorescéine succinimidyl ester (CFSE)

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