Name: Utilisation non fixés, des tissus congelés pour étudier la distribution mucine naturel (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Découvrez une méthode d'inclusion en OCT pour préserver la distribution naturelle de la glycosylation et des mucines dans les tissus congelés non fixés. Cette technique permet une analyse précise des structures glycaniques par immunohistochimie.

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Les auteurs tiennent à remercier Nicole M. Nemeth (Université de Géorgie) et Jeanne M. Fair (LANL) pour leur aide dans la récolte des tissus de poulet et Steven A. Springer pour son aide pendant le tournage. La prise en charge de tous les oiseaux de cette étude était en conformité avec les lignes directrices des National Institutes of Health pour l&#39;utilisation des animaux de laboratoire et tous les protocoles ont été approuvés par le soin des animaux institutionnel et comités utilisation à Los Alamos National Security, LLC, opérateur du Los Alamos Laboratoire national au titre du contrat n ° DE-AC52-06NA25396 avec le Département américain de l&#39;Énergie. La prise en charge de la souris dans cette étude est en conformité avec l&#39;UCSD animale protocole approuvé. Tissus humains ont été obtenus dans le cadre du protocole de l&#39;UCSD CISR approuvé. Ce travail a été soutenu par une bourse de 118.645 Université de Californie frais Lab Programme Président (PG) et la subvention NS047101 de l&#39;Institut national des troubles neurologiques et des maladies (laboratoire de microscopie Neuroscience partagée, UC San Diego).

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Conservation des épitopes de mucus et de tissus congelés glycane est supérieure à celle des tissus qui ont été incorporées dans de la paraffine. Nous avons démontré la préservation de la couche de mucus sécrété (figures 1 et 3) et de la répartition des structures des glycanes trois (figure 3) dans les tissus congelés par rapport à des tissus inclus en paraffine. Fixateurs spécialisés, comme solution de Carnoy (éthanol à 60%, le chloroforme 30%, 10% d&#39;acide acétique) 17 ont été développés pour une conservation optimale de la couche de mucus dans les échantillons de tissus. De façon optimale, cette solution devrait être utilisé pour recueillir des échantillons de tissus qui se consacrent à des études de mucus et a été montré pour préserver l&#39;aspect lisse de 16-17 couche de mucus. La couche de mucus dans les échantillons congelés non fixées intégré dans un PTOM, semble robuste et dans certaines régions peut se détacher du tissu, mais l&#39;épaisseur de la couche globale est en accord avec celle observée dans les tissus qui ont été fixées avec une solution de Carnoy et embedded dans de la paraffine 16-17. Par exemple, la couche de mucus dans la section du côlon congelé les tissus humains est de ~ 100 um (Figure 1), ce qui est à l&#39;intérieur de la fourchette indiquée pour Carnoy&#39;s fixe échantillon côlon humain 55,4 ± 2,5 microns (plage de 7,7 à 204,8 um) 16. Il a été connu depuis des décennies que les résultats de la déshydratation d&#39;éthanol ~ retrait de 30% des échantillons biologiques 18, et que des solvants organiques tels que le xylène, Citrisolv et des lipides, des glycolipides extrait de chloroforme et, dans une certaine mesure, les protéines provenant des 13 tissus. Le traitement des tissus pour inclusion dans la paraffine comprend les étapes suivantes: fixation (10% du formol tamponné), déshydratation (concentration en éthanol augmente) et de compensation (Citrisolv ou le xylène). En reproduisant les étapes de coupes de tissus congelés non fixées, nous avons montré que des extraits de mucus Citrisolv de coupes de tissus congelés résultant de la morphologie du tissu qui est similaire à celle de tissus inclus dans la paraffine (Figure 2, panneau de droite). En revanche, la couche de mucus n&#39;a pas été modifiée par une incubation avec du formol ou de l&#39;éthanol (Figure 2, gauche et du milieu). Ceci suggère que l&#39;étape de compensation de la procédure de paraffine plongement standard, ce qui nécessite une incubation prolongée dans Citrisolv / xylène, entraîne l&#39;effondrement de la couche de mucus. La fixation au formol ne pas endommager la couche de mucus et surgelés sections de tissus qui ont été fixés à la formaline peut être facilement colorés avec les lectines et les anticorps dirigés contre les glycanes, des glycolipides et des protéines (figures 2, 3 et 6). Ces effets peuvent être négligeables pour l&#39;étude des protéines membranaires et des tissus pathologie, mais ils sont dévastateurs pour les structures fortement hydratées telles que la couche de mucus sécrété. Des études histologiques Cependant de mucines sont encore menées principalement avec des échantillons inclus en paraffine, dont la préservation couche de mucus est sous-optimale. Dans des analyses approfondies de composition de la couche de mucus telles que l&#39;identité précise de soicreted ou glycoprotéine liée à la membrane combinaisons MUC exiger des anticorps spécifiques et la spectrométrie de masse pour l&#39;identification de l&#39;épine dorsale de protéine. Préservation de la couche de mucus n&#39;est que la première exigence pour de telles études. De nombreux laboratoires ont des échantillons de tissus congelés dans l&#39;OCT qui ont été recueillies dans le passé pour des projets différents, ces tissus peuvent être facilement utilisées pour étudier les mucines, des glycolipides et de distribution glycane éliminant la nécessité de recueillir des tissus dans fixateurs spéciaux qui sont conçus uniquement pour la préservation du mucus. Tissus congelés subir une transformation minimale et par conséquent la répartition naturelle des glycanes, qui sont hydratés dans la nature, est conservée. Ceci est particulièrement important dans le domaine des interactions hôte-microbienne. Connaissance de la répartition et de l&#39;abondance naturaliste de mucines sécrétées et les structures des glycanes de nombreux décorer ces molécules &quot;barrière&quot; sera un élément clé dans la compréhension de défense de l&#39;hôte, de l&#39;exploitation et de pathogènes microbiensest.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif et le matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> 2-méthyl butane </td><td> Fisher Scientific </td><td> 03551-4 </td></tr><tr><td> Kit AEC substrat de la peroxydase </td><td> Vector Labs </td><td> SK-4200 </td></tr><tr><td> Bleu Alcian </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3157 </td></tr><tr><td> Anti-CA 19-9 anticorps monoclonal </td><td> Calbiochem </td><td> CA1003 </td></tr><tr><td> Anti-MUC5AC anticorps monoclonal </td><td> Millipore </td><td> MAB2011 </td></tr><tr><td> Avidine-biotine blocage kit </td><td> Vector Labs </td><td> SP-2001 </td></tr><tr><td> Biotinylé d&#39;âne anti-anticorps de souris </td><td> Immunoresearch Jackson </td><td> 90863 </td></tr><tr><td> SNA biotinylée </td><td> Vector Labs </td><td> B-1305 </td></tr><tr><td> Albumine de sérum bovinmin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td></tr><tr><td> La chitine-hydrolysat </td><td> Vector Labs </td><td> SP-0090 </td></tr><tr><td> Cryostat-microtome </td><td> Leica Microsystems </td><td> Leica CM 1800 </td></tr><tr><td> Hématoxyline </td><td> Surgipath médicale Ind </td><td> 3801570 </td></tr><tr><td> Peroxyde d&#39;hydrogène à 30% </td><td> Fisher Scientific </td><td> H325-100 </td></tr><tr><td> Jacaline-FITC </td><td> Vector Labs </td><td> FL-1151 </td></tr><tr><td> Mayer hématoxyline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MHS32 </td></tr><tr><td> Melibiose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5500 </td></tr><tr><td> Nuclear Fast Red </td><td> Vector Labs </td><td> H-3403 </td></tr><tr><td> Composé OCT </td><td> VWR International </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> Streptavidine conjuguée à la peroxydase </td><td> Immunoresearch Jackson </td><td> 94638 </td></tr><tr><td> Réactif de Schiff </td><td> Sciences de la microscopie électronique </td><td> 26052 </td></tr><tr><td> sWGA-Rhodamine </td><td> Vector Labs </td><td> RL1022S </td></tr><tr><td> Anticorps monoclonal TKH2 </td><td> ATCC </td><td> HB-9654 </td></tr><tr><td> VectaMount milieu de montage aqueux </td><td> Vector Labs </td><td> H-5501 </td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 8310-4 </td></tr><tr><td> Peel-A-Way moules </td><td> Polysciences Inc </td><td> 18646A-1 </td></tr></tbody></table>

utilisation non fixés, des tissus congelés pour étudier la distribution mucine naturel

Using Unfixed, Frozen Tissues to Study Natural Mucin Distribution

Mucines sont complexes et fortement glycosylée O-liés glycoprotéines, qui contiennent plus de 70% en poids de glucides 1-3. Mucines sécrétées, produite par les cellules caliciformes et de la muqueuse gastrique, l&#39;échafaud pour fournir une couche de mucus micromètres d&#39;épaisseur qui tapisse l&#39;épithélium de l&#39;intestin et des voies respiratoires 3,4. En plus des mucines, les couches de mucus également contenir des peptides antimicrobiens, des cytokines, des immunoglobulines et 5-9. La couche de mucus est une partie importante de l&#39;immunité innée de l&#39;hôte, et constitue la première ligne de défense contre les micro-organismes envahisseurs 8,10-12. En tant que tel, le mucus est soumis à de nombreuses interactions avec les microbes, les deux agents pathogènes et de symbiotes, et les mucines sécrétées former une interface importante pour ces interactions. L&#39;étude de ces interactions biologiques implique généralement des méthodes histologiques pour la collecte des tissus et de la coloration. Les deux méthodes les plus couramment utilisés pour la collecte des tissus histologiques et préservanttion dans la clinique et dans les laboratoires de recherche sont: la fixation au formol suivie par inclusion dans la paraffine et la congélation des tissus, puis en intégrant en cryo-protecteurs médias. Échantillons de tissus inclus en paraffine produire des sections avec des qualités optimales pour la visualisation histologique, y compris la clarté et la morphologie bien définie. Cependant, au cours du processus de paraffine intégration d&#39;un certain nombre d&#39;épitopes s&#39;altérer et dans le but d&#39;étudier ces épitopes, des coupes de tissus doivent être traitées ultérieurement de l&#39;une des nombreuses méthodes de démasquage 13. Mucines sécrétées et les lipides sont extraits à partir du tissu au cours de l&#39;étape de compensation de la paraffine enrobage, ce qui nécessite de prolonger l&#39;incubation avec des solvants organiques (xylène ou Citrisolv). Par conséquent, cette approche est sous-optimal pour les études portant sur ​​la nature et la répartition des mucines et de mucus in vivo. En revanche, le gel des tissus à la température de coupe optimale (PTOM) intégrant un supportvides déshydratation et la compensation de l&#39;échantillon, et maintient l&#39;hydratation de l&#39;échantillon. Cela permet une meilleure préservation de la couche de mucus hydraté, et permet ainsi l&#39;étude des nombreux rôles de mucines en biologie épithéliale. Comme cette méthode nécessite un minimum de traitement du tissu, le tissu est conservé dans un état plus naturel. Par conséquent gelés sections tissus ne nécessitent aucun traitement supplémentaire avant la coloration et peut être facilement analysée par des méthodes immunohistochimiques. Nous démontrons la préservation de micromètres d&#39;épaisseur couche de mucus sécrété dans les échantillons congelés du côlon. Cette couche est considérablement réduite lorsque les mêmes tissus sont inclus dans la paraffine. Nous démontrons également immunofluorescence des épitopes présentés sur des glycanes des mucines en utilisant des lectines végétales. L&#39;avantage de cette approche est qu&#39;elle ne nécessite pas l&#39;utilisation de fixateurs spéciaux et permet à partir de tissus congelés qui peuvent déjà être conservés dans le laboratoire.

Non fixées échantillons de tissus congelés incorporés dans un milieu de température optimale de coupe (OCT) peut être utilisé pour étudier la distribution de glycosylation naturelle et du mucus sécrété. Dans cette approche de traitement de tissus est minime et la présentation naturelle des glycolipides, des mucines et glycane-épitopes est préservée. Les coupes de tissus peuvent être analysées par immunohistochimie en utilisant la détection par fluorescence ou chromogène.

Utilisation non fixés, des tissus congelés pour étudier la distribution mucine naturel

Les mucines sont des glycoprotéines complexes et fortement glycosylées à liaison O, contenant plus de 70 % de glucides en poids1-3. Les mucines sécrétées, produites par ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de préserver la distribution naturelle de la glycosylation du mucus sécrété dans les échantillons de tissus. Cela est réalisé en incorporant d'abord les tissus dans un milieu de congélation à température optimale, ou OCT, afin de minimiser la préparation des tissus, puis de permettre la détection des structures glycaniques, de la mucine et du mucus. Les sections sont incubées avec des lectines, des anticorps et des colorations histochimiques.La liaison des lectines peut être confirmée par inhibition compétitive ou par clivage enzymatique des épitopes glycaniques afin de valider la spécificité de la liaison. En fin de compte, la conservation du mucus et des échantillons de tissus congelés peut être comparée à celle du mucus dans des échantillons inclus en paraffine par analyse chimique mystique. Les principaux avantages de l'utilisation de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'inclusion des tissus dans la paraffine et la fixation avec une solution de carnoys, résident dans le fait que cette méthode n'exige pas l'utilisation de fixatifs spécialisés et permet d'utiliser des tissus congelés déjà présents en laboratoire.Pour commencer, laissez tiédir le tissu congelé instantanément jusqu'à moins 20 degrés Celsius en le plaçant dans une chambre de microtome cryogénique. Pendant ce temps, préparez un bain de congélation en ajoutant du méthylbutane dans une boîte en polystyrène peu profonde, puis ajoutez de la glace sèche dans la boîte. Ensuite, ajoutez juste assez de OCT pour recouvrir le fond d'un moule de congélation jetable, puis placez-y le tissu.Veillez à ce que le tissu repose au fond du moule dans l'orientation souhaitée. Recouvrez le tissu d'encore plus de composé OCT, puis placez le moule dans le bain de congélation. Le composé OCT deviendra blanc au fur et à mesure que le tissu gèle. Une fois congelé, retirez délicatement le moule du bloc congelé et placez le bloc dans un sac congélation étiqueté.Conserver les blocs congelés à moins 80 degrés Celsius jusqu'à leur utilisation, avant la sectionnement du tissu. Placer les blocs congelés d'intérêt dans la chambre du microtome cryogénique pendant environ 30 minutes afin qu'ils atteignent moins 20 degrés Celsius. Lorsque les blocs sont à température, couper une section d'épaisseur comprise entre trois et cinq micromètres, puis déposer une lame en verre chargée positivement par-dessus la section.Le tissu adhérera à la lame après un séchage à l'air de 30 à 60 minutes. Fixer les lames avec une solution tamponnée à 10 % pendant 30 minutes à température ambiante, puis laver les lames trois fois dans du PB PBS par 10 trempages rapides dans 250 millilitres de tampon pour colorer les tissus avec de l'aum. Colorer d'abord en bleu, rincer les lames à l'eau, puis incuber dans de l'acide acétique à 3 % pendant trois minutes.Incubez ensuite les tissus avec la solution bleue AUM. Après 30 minutes, lavez les lames à l'eau courante du robinet pendant 10 minutes, puis rincez-les à l'eau désionisée. Contre-tendez les noyaux avec le rouge rapide nucléaire pendant cinq minutes, puis lavez les lames trois fois à l'eau désionisée. Procédez maintenant au déshydratation et à la clarification des lames en les incubant pendant une minute dans de l'éthanol à 95 %, suivie de trois changements rapides dans de l'éthanol à 100 %, puis de trois changements dans du citrus resolve pendant deux minutes chacun.Enfin, monter une lame couvre-objet sur la préparation avec un milieu de montage tel que le cyto seal 60 pour colorer les tissus selon la méthode de la schiffisation par acide périodique. Rincer d'abord les lames à l'eau, puis les incuber avec de l'acide périodique fraîchement préparé à 1 % pendant cinq minutes. Laver ensuite les lames trois fois à l'eau distillée.Plonger les lames une fois dans de l’eau Milli Q, puis colorer les tissus avec le réactif de Schiff. Après 15 minutes, laver les lames à l’eau courante du robinet pendant 10 minutes supplémentaires, puis les plonger une fois dans de l’eau DI. Contrecolorer les noyaux avec de la métharine pendant 30 secondes, puis laver les lames trois fois dans de l’eau DI.Incuber enfin les lames pendant 30 secondes. Dans le réactif de bleuissement Scot's tap water, rincer trois fois supplémentaires dans de l'eau désionisée, puis déshydrater les tissus comme indiqué précédemment pour la coloration au bleu de calcium. Monter les lames avec un coverslip pour la détection en fluorescence des épitopes glycaniques à l'aide de lectines.Commencez par bloquer la lame avec de l'albumine de sérum bovin (BSA) dans du PBS pendant 10 à 30 minutes. Ensuite, bloquez la biotine endogène en incubant la lame pendant 15 minutes avec de l'avadon, suivie d'un lavage au PBS, puis d'une incubation de 15 minutes avec 0,01 % de biotine après un autre lavage au PBS. Placez la lame dans une boîte de coloration, déposez une mixture fraîchement préparée des lectines souhaitées sur chacune des sections de tissu, puis recouvrez délicatement le mélange de lectines avec du parfum.Incubez maintenant la lame à l’obscurité après une heure. Retirez délicatement le parfum et lavez la lame trois fois avec du PBS. Ensuite, recouvrez la lame de streptavidine conjuguée SCI cinq et incubez à nouveau à l’obscurité pendant 30 minutes, puis lavez les lames trois fois avec du PBS et contrecolorez les noyaux avec du DAPI.Enfin, montez la lame avec un coverslip en utilisant un milieu aqueux tel que le milieu de montage vector pour le contrôle de l'enzyme sase. Commencez par ajouter de l'eau au fond d'une boîte à pointes vide afin de former une chambre humide. Placez les lames du contrôle négatif face vers le haut sur le plateau supérieur de la boîte à pointes.Appliquez en couche 150 à 200 microlitres d'une solution US sur les sections de tissu, puis recouvrez chaque lame d'une lamelle en évitant la formation de bulles d'air. Fermez le couvercle de la boîte et incubez-la à 37 degrés Celsius pendant deux heures et demie. Lavez les lames trois fois en PBS à température ambiante pour éliminer les acides slic libres.Incubez ensuite les lames avec la SNA pendant une heure à température ambiante pour l'inhibition compétitive. Répartissez par aliquots 200 microlitres du mélange de lectine dans deux vials einor. Ajoutez ensuite 200 millimolaire de l'inhibiteur Jacqueline, Meli bios, dans l'un des vials, et ajoutez l'inhibiteur SWGA, l'hydrolysat de chitine, à une dilution de un sur 10 dans l'autre vial.Ensuite, incuber les lames avec les mélanges contenant l'inhibiteur pendant une heure à température ambiante. Sur cette première figure histologique, des sections de tissus de colon de souris ou de poulet conservés dans du OCT ou inclus en paraffine ont été colorées par l'acide périodique de Schiff en rose ou par le bleu de calcium en bleu. Une comparaison entre des échantillons de tissus inclus en paraffine et des tissus congelés inclus dans le milieu cryoprotecteur OCT a révélé des différences marquées dans la préservation et la qualité de la coloration des glycoprotéines mucineuses dans les tissus congelés.En plus de la mucine dans les cellules caliciformes, le mucus sécrété était également visible, comme indiqué par les flèches sur les tissus inclus en paraffine. La coloration du mucus était limitée aux cellules caliciformes. Sur cette figure, on peut observer la perte importante de mucine ainsi que des tissus incubés dans une solution d'agrumes.Des sections sériées d'échantillons congelés d'iléon de poulet ont été fixées dans du formol tamponné à 10 % et maintenues hydratées, puis déshydratées dans l'éthanol par incubation successive dans de l'éthanol à 70 %, 90 % et 100 % pendant 20 minutes chacun, ou déshydratées dans l'éthanol puis clarifiées avec du citrus all pendant une heure. La déshydratation à l'éthanol seule et la déshydratation à l'éthanol suivie de la clarification au citrus all ont amélioré la morphologie tissulaire. Une déshydratation supplémentaire à l'éthanol seule n'a eu aucun effet significatif sur la coloration bleue.En revanche, avec le traitement au citrate, la coloration bleue a été réduite et limitée aux cellules en coupe, selon un motif similaire à celui observé pour les tissus inclus en paraffine dans la figure précédente. Les encadrés indiquent les zones agrandies dans les sections tissulaires colorées au bleu d’alun. Dans cette série d’images suivante, on observe des spécimens d’iléon de poulet congelés dans du OCT ou inclus en paraffin, puis marqués avec Jacqueline en bleu, SWG en vert et SNA en rouge, sur des tissus congelés.La liaison de Jacqueline aux glycanes Olink révélait des structures semblant s'écouler des cellules en goblet vers la lumière, comme indiqué par les flèches dans la coupe tissulaire congelée OCT. En revanche, la liaison de Jacqueline aux tissus inclus en paraffine était limitée aux cellules en goblet et à la bordure en brosse des villosités, comme indiqué par ces flèches. La coloration SWGA du bêta un quatre GL co-localise partiellement avec la liaison de la lectine Jacqueline, tant dans les tissus congelés que dans les tissus inclus en paraffine, comme indiqué par les flèches.En revanche, la lectine SNA en rouge, indiquée par les têtes de flèches, se lie intracellulairement aux acides sialiques liés par une liaison alpha deux six et ne co-localise pas avec Jacqueline, qui apparaît en bleu et est indiquée par les flèches en pointillés sur cette figure. Les épitopes d'acide sialique ont été éliminés à partir de spécimens d'iléon de poulet par digestion de la coupe de tissu avec une a-US ou ont été laissés non clivés par incubation dans un tampon acétate de sodium, comme indiqué ici. Le traitement par a-US a supprimé la coloration avec la SNA biotinylée observée dans le tissu non traité, confirmant ainsi la spécificité de liaison de la SNA aux acides sialiques.La spécificité des lectines peut également être confirmée en ajoutant un inhibiteur compétitif tel que le mely bios pour la coloration par Jacqueline ou l'hydrolysat de chitine pour la coloration par SWGA. Des échantillons d'iléon de poulet ont de nouveau été incubés avec un mélange de Jacqueline et de SWGA. Cette fois-ci, l'incubation a également été réalisée en présence d'inhibiteurs spécifiques des lectines, le mely bios ou l'hydrolysat de chitine. La coloration par Jacqueline a été inhibée par le mely bios, mais pas par l'hydrolysat de chitine. Inversement, la coloration par SWGA a été inhibée par l'hydrolysat de chitine, mais pas par le mely bios.Cette série finale d'images montre que des échantillons de tissus congelés instantanément, couramment obtenus en clinique et dans les laboratoires de recherche, peuvent être inclus dans du OCT et utilisés pour étudier les glycanes présents sur les mucines, les glycoprotéines, les glycolipides et les glycanes eux-mêmes. Ces biopsies de cancer colorectal provenant de tissus de carcinome villositaire et de carcinome muqueux ont été congelées instantanément dans de l'azote liquide, incluses dans du OCT, puis correctement marquées pour divers épitopes de mucines et de glycanes indiqués. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure de comprendre clairement comment inclure des tissus dans du OCT et comment analyser la glycosylation du mucus et des tissus à l'aide de méthodes immuno-chimiques.

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