Essais biologiques électroantennographique comme outil de dépistage pour les substances volatiles de la plante hôte

L'objectif général de cette procédure est de cribler rapidement un grand nombre de composés volatils de plantes hôtes afin d'évaluer leur activité biologique potentielle. Cela est réalisé en premier lieu par la collecte et l'analyse par GCMS des composés volatils de la plante hôte d'intérêt. Ensuite, les composants chimiques sont identifiés et vérifiés.

La troisième étape consiste à analyser individuellement les composants en répliques suffisantes pour leur bioactivité par analyse électrographique. L'étape finale consiste à formuler et évaluer des mélanges de composants actifs. En définitive, les résultats peuvent fournir une série tronquée de composants ou un mélange de composants prêts à être étudiés plus en détail dans des expériences comportementales avec l'insecte ciblé.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les études comportementales longues, est que le criblage rapide par analyse électrographique réduit considérablement le nombre de composés devant être sélectionnés pour d'autres études démontrant une procédure. M. Wage est-il technicien dans mon laboratoire ? Une fois les composés volatils pertinents identifiés par chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse, il est possible de réaliser une analyse électroantennographique, ou EAG, de chaque composé volatil disponible en premier lieu.

Cependant, les composés volatils disponibles doivent être préparés. Préparez une solution de chaque composé volatil dans le pentane à une concentration de cinq milligrammes par millilitre, dans un récipient pouvant être hermétiquement fermé et stocké à quatre degrés Celsius. Ensuite, préparez les pipettes de stimulation.

Étiquetez 10 pipettes Pasteur par composé volatil et enveloppez leurs embouts avec un petit morceau de parafilm. Dix pipettes suffisent pour délivrer le composé volatil à chaque sexe dans un écran préliminaire avec un faible nombre de réplicats. Disposez maintenant le jeu restant de cinq pipettes dans un support et insérez un disque de bioessai dans l'extrémité ouverte de chaque pipette.

Repliez délicatement un disque à l’aide de pinces et insérez-le partiellement dans l’extrémité large de la pipette de manière à laisser deux à trois millimètres du disque exposés. À l’aide d’une pipette ou d’une seringue, déposez 10 microlitres de solution volatile sur chaque disque. Il est extrêmement important de calculer, formuler et préparer correctement les solutions afin d’obtenir des réplicats cohérents.

Laisser passer deux minutes, puis enfoncer complètement les disques dans leurs pipettes. Une fois chargées, sceller immédiatement chaque pipette avec du parafilm. Répéter cette préparation des pipettes pour le nombre de réplicats souhaité.

En utilisant le même protocole, préparez un contrôle négatif contenant uniquement des pentanes ainsi que des contrôles positifs, dans ce cas l'acétophénone et l'hormone sexuelle. Procédez maintenant à la préparation des antennes d'insectes.

Dans cette expérience, un préamplificateur transmet le signal provenant d'une électrode en fourche à l'instrument d'acquisition EAG. Le logiciel fourni avec l'instrument EAG doit être configuré correctement dans le logiciel. Configurez les paramètres en réglant d'abord la fréquence d'échantillonnage sur 106,7.

Définissez le commutateur de rectification sur « know » et réglez le filtre sur zéro à 42 hertz dans l'onglet filtre. Activez le filtre EAG et réglez la fréquence de coupure basse à 0,1 hertz. Ensuite, enregistrez les paramètres dans un fichier de configuration pour une utilisation ultérieure.

Utiliser le programme est alors aussi simple que d'ouvrir un nouveau fichier de projet, de l'enregistrer sous un nom spécifique et de procéder à l'enregistrement. L'icône de triangle rouge démarre le processus d'enregistrement et reste active pendant une durée prédéterminée pour chaque souffle individuel. Lorsque tous les souffles ont été effectués pour les antennes, l'icône noire en forme de croix arrête l'enregistrement afin de faciliter une lecture précise des réponses EAG.

Une petite règle peut être fixée avec du ruban adhésif sur l'écran de l'ordinateur au niveau de la ligne de base du signal. La réponse est enregistrée en millimètres, puis convertie ultérieurement en amplitude en microvolts. Si nécessaire, les enregistrements peuvent être rejoués pour une évaluation plus approfondie.

Dans cet exemple, des oranges navales âgées de trois à quatre jours ainsi que des mâles et des femelles de papillons sont utilisés. Toutefois, ce protocole peut être adapté à d'autres insectes. Transférez chaque insecte dans un petit récipient en plastique avec de la litière.

Le jour de l'analyse, juste avant le test biologique, insérez l'insecte par l'orifice large d'une pointe de pipette, dont l'orifice inférieur est légèrement assez grand pour laisser passer sa tête. Ensuite, à l'aide d'une pointe de pipette plus petite, poussez délicatement l'insecte vers l'orifice réduit jusqu'à ce que sa tête soit exposée sous un stéréomicroscope. Veillez à ce que les antennes soient maintenues en place à l'intérieur du tube de maintien et que la base des antennes soit exposée afin de permettre leur excision.

Placez ensuite le support de fourchette, avec un fin film de gel d'électrode, à proximité immédiate de l'antenne ; à l'aide de ciseaux microchirurgicaux, dégagez délicatement les antennes, puis excisez-les toutes les deux et déclenchez un chronomètre pour enregistrer la durée entre cet événement et les stimuli suivants. À l’aide d’un outil métallique terminé par un fil et doté d’un léger dépôt de gel à son extrémité, prenez une antenne et placez-la sur la fourchette. Veillez à ce que la base de l’antenne soit positionnée sur l’électrode de masse non rouge (électrode indifférente) de la fourchette.

Faites de même pour la deuxième antenne. Placez la base de l'antenne du même côté de la fourchette, à deux ou trois millimètres d'intervalle, en positionnant l'antenne. Taillez les extrémités des antennes selon les besoins.

Appliquez l'électrode sur le gel à l'aide d'un pinceau et veillez à ce que sa base et sa pointe soient immergées dans le gel électrode afin qu'il n'y ait aucune bulle d'air dans le gel. Évitez de recouvrir la partie centrale de l'antenne avec le gel afin de maximiser la surface de l'antenne exposée au jet de composés volatils. Une fois que la préparation est correctement gélifiée, reliez la fourchette à l'amplificateur préalable du sonde.

Appliquez maintenant un flux d'air humidifié sur le prélèvement afin de maintenir la viabilité d'une préparation antennaire. Dix minutes après l'excision, procédez à l'application du premier stimulus. L'ordre des opérations pour stimuler une préparation commence et se termine par un contrôle positif, entre lesquels on applique une séquence aléatoire de composés sans composés identiques consécutifs, ainsi qu'au moins un contrôle négatif ; le nombre de composés appliqués à une antenne varie selon l'espèce.

Une préparation de papillon de la teigne de l'orange peut rester active pendant plus de 30 minutes, permettant d'analyser facilement jusqu'à 10 composés volatils avec un faible nombre de réplicats. Le même principe d'administration de l'échantillon s'applique aux écrans ultérieurs de mélanges de composés qui se sont révélés induire des réponses lors de l'écran préliminaire. La première pipette de stimuli doit être préparée 30 secondes avant l'application du jet : déboucher la pipette et la positionner dans le support afin qu'elle dirige le flux d'air à deux à trois millimètres des antennes, dix minutes après la section des antennes.

Délivrez la première bouffée de stimulus en une à deux secondes à 300 millilitres par minute. Remplacez ensuite rapidement la pipette afin que, une minute après le premier stimulus, le second soit délivré. Une bonne reproductibilité entre les échantillons permettra de minimiser la variabilité des quantités de composés volatils effectivement administrées.

Après l'administration de la dernière bouffée de contrôle positif, retirez l'antenne et nettoyez la fourchette. À l’aide d’un chiffon saturé en éthanol, laissez-la sécher complètement avant une utilisation ultérieure. Pour augmenter le débit des tests, un assistant doit préparer la prochaine antenne avec des fourchettes propres 10 minutes avant la fin des préparations précédentes.

Séquence de test, plus d'une fourchette est nécessaire pour cette méthode. Après chaque expérience, euthanasier les papillons testés dans un environnement à base de glace sèche et disséquer les papillons femelles pour vérifier leur statut d'accouplement. On suppose que les mâles cohabitants se sont accouplés avec l'antenne du ver du navet orange. Les préparations ont été stimulées par des impulsions de deux secondes et des enregistrements de dix secondes ont été effectués sur une fenêtre de dix secondes à l'échelle de cinq millivolts.

Une déflexion négative était la réponse typique. Toutefois, les valeurs absolues ont été enregistrées. Toutes les préparations femelles présentant une réponse faible au témoin positif ont été écartées.

La réponse moyenne des préparations restantes était de 2 600 microvolts. De même, la réponse moyenne des mâles au témoin du pH sexuel était généralement de 3 000 microvolts. Ainsi, les anani présentant une réponse insuffisante ont été écartés ; les données provenant d’antennes ayant montré une réponse dégradée au cours de l’essai ont également été rejetées.

La dégradation était constatée si la réponse d'Anton au souffle du contrôle positif final était inférieure à 75 % du premier souffle du contrôle pré-con, ou inférieure au deuxième souffle du contrôle pré-con pour les autres séries expérimentales. Les valeurs de réponse ont été analysées en prenant les mesures brutes de chaque série et en soustrayant la réponse du contrôle négatif de cette série à chaque valeur de la même série. Ensuite, tous les contrôles positifs de chaque série ont été moyennés et ajustés à 1000 microvolts, en notant le ratio de correction à 1000 microvolts pour chaque série.

Les valeurs obtenues pour les composés testés ont ensuite été multipliées par le ratio de correction du témoin positif. Enfin, la réponse corrigée moyenne de chaque composé testé, calculée sur l'ensemble des essais, a été comparée afin d'évaluer le potentiel de chaque composé pour des investigations ultérieures. N'oubliez pas que manipuler des produits chimiques peut être extrêmement dangereux et que des précautions appropriées doivent toujours être prises.