Name: Un essai en phase liquide daffinité de capture utilisant des billes magnétiques pour étudier interaction protéine-protéine: Le poliovirus Exemple-Nanobodies (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Découvrez un essai de capture d'affinité en phase liquide utilisant des billes magnétiques pour étudier les interactions protéine-protéine avec le poliovirus. Cette méthode quantitative permet d'analyser les protéines sensibles aux changements conformationnels.

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Les auteurs tiennent à remercier le personnel du département de la biotechnologie pharmaceutique et biologie moléculaire et en particulier Monique De Pelsmacker pour la préparation du virus radioactifs étiquetés. Nous sommes reconnaissants à Ellen Merckx et Hadewijch Halewyck pour leurs remarques et discussions intéressantes et de Gerrit De Bleeser pour son aide dans le laboratoire. Ce travail a été soutenu financièrement par une subvention de OZR la Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), le Fonds voor Onderzoek Vlaanderen Wetenschappelijk (G.0168.10N) et l&#39;Organisation mondiale de la Santé (TSA 200 410 791). Lise Schotte est un garçon prédoctoral de la Fonds voor Onderzoek Vlaanderen Wetenschappelijk (FWO).

Le principe (A) et un aperçu de la méthode (B) sont représentés dans la figure 1. 1. Préparation de la mémoire tampon <ol><li> Préparer Reliure / tampon de lavage en dissolvant le dihydrogénophosphate de sodium (50 mM) et de chlorure de sodium (300 mM) dans de l&#39;eau et ajuster le pH à 8,0. En outre ajouter Tween 20 (0,01% (m / v) concentration finale), la méthionine (2% (m / v) concentration finale) et l&#39;albumine (0,1% (m / v) concentration finale) et ajuster le volume requis. </li></ol> 2. Préparation des billes magnétiques Préparer les billes magnétiques, selon le manuel d&#39;instruction. En bref: <ol><li> Remettre en suspension les perles magnétiques en utilisant un vortex. </li><li> Transfert, pour chaque échantillon, 10 pl des billes en suspension magnétique (40 mg / ml) dans un tube. </li><li> Recueillir les billes magnétiques en utilisant un aimant, jusqu&#39;à ce que le surnageant est clair (+ / - 30 secondes) et retirer le surnageant avec précaution. </li><li> Laver lebilles magnétiques à deux reprises: remettre en suspension les billes dans 150 pi de reliure / tampon de lavage. Migrer les billes magnétiques à un côté du tube à l&#39;aide d&#39;un aimant jusqu&#39;à ce que le surnageant est clair et retirez soigneusement le surnageant. </li><li> Utilisez 40 pl de reliure / tampon de lavage, pour chaque échantillon, pour remettre en suspension les perles (10 mg / ml). </li></ol> 3. Essai de capture par affinité Remarque: Pour mesurer la radioactivité naturelle (cosmique) (0% de la radioactivité), aucun virus radiomarqué est ajouté à un échantillon de contrôle 1. Au lieu de cela, le même volume reliure / tampon de lavage est ajouté. Note: radioactivité de 100% est définie par une 2 échantillon de contrôle à laquelle tous les composants sont ajoutés à l&#39;exception du Nanobody. Au lieu de cela, le même volume reliure / tampon de lavage est ajouté. <ol><li> Apportez 2000 cpm de 35 S étiquetés (β-rayonnement) du poliovirus Sabin souche de type 1 9, dilué avec de reliure / tampon de lavage à 80 ul dans une plaque de microtitrage à 96 puits. </li><li> Ajouter 10 &amp; mu; l de dilution Nanobodies dans les puits. </li><li> Mélanger pendant environ 10 secondes en utilisant un agitateur. </li><li> Laisser les échantillons à incuber pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Ajouter 40 ul de la suspension lavée billes magnétiques et incuber pendant 10 minutes à température ambiante, sous agitation continue. </li><li> Séparer les billes et le surnageant en utilisant un aimant et transférer le surnageant autorisés à pénétrer dans un tube. </li></ol> 4. Mesure de la radioactivité <ol><li> Transférer 50 ul du surnageant de l&#39;étape 3.6 dans une fiole de comptage. </li><li> Ajouter 3 ml de liquide de scintillation et mélanger. Mesurer la radioactivité dans un compteur à scintillation β-. </li></ol> 5. Le recyclage des Perles <ol><li> Collecter les perles utilisées magnétiques dans un tube et centrifuger à 500 xg pendant 2 minutes ou jusqu&#39;à ce que d&#39;un surnageant limpide est obtenue. </li><li> Eliminer le surnageant et remettre en suspension les perles dans 6 ml de NaOH 0,5 M. </li><li> Transférer la suspension dans Multipltubes électroniques et les incuber dans un bain à ultrasons pendant 5 minutes. </li><li> Utilisez des aimants pour recueillir les billes magnétiques et retirer le surnageant. </li><li> Ajouter 1 ml de 2% SDS-solution à chaque tube et remettre à l&#39;aide d&#39;un vortex. Faire bouillir pendant 5 minutes. </li><li> Collecter les perles et retirer le surnageant. Remettre en suspension les billes dans 1 ml d&#39;EDTA 0,2 M (pH = 7). </li><li> Incuber les tubes dans un bain à ultrasons pendant 5 minutes et une fois de plus, éliminer le surnageant. </li><li> Ajouter 1 ml d&#39;eau à chaque tube et remettre les billes. Collecter les perles et retirer le surnageant. Répétez cette étape de lavage à deux reprises. </li><li> Eliminer le surnageant et remettre en suspension les billes dans 1 ml 10 mM CoCl 2 solution. Mettre sur un agitateur pendant 10 minutes. </li><li> Eliminer le surnageant à l&#39;aide d&#39;un aimant pour recueillir les perles et remettre en suspension dans 1 ml de reliure / tampon de lavage. </li><li> Retirer le surnageant et laver les billes deux fois en utilisant 1 ml de 20% (v / v) d&#39;éthanol </li><li> Remettre en suspension les perles dans leur volume initial de 20% (v / v) etHanol à obtenir des billes régénérées en une concentration de 40 mg / ml. </li></ol> 6. Interprétation des résultats <ol><li> L&#39;échantillon de contrôle 1, dans lequel aucun virus radiomarqué a été ajouté, sera utilisé pour corriger la radioactivité de fond et de définir la valeur de radioactivité 0%. L&#39;échantillon de contrôle 2, qui ne contient pas de Nanobodies et où par conséquent tous les virus radiomarqué reste dans le surnageant, est défini comme la valeur la radioactivité de 100%. </li><li> Le pourcentage de la radioactivité dans le surnageant (= une%) est une mesure de la précipitation globale (= 100 - une%) du virus radiomarqué par le Nanobody. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs Les résultats représentatifs pour ce test de capture par affinité sont présentés dans les figures 2, 3 et 4. Dans la figure 2, l&#39;affinité de PVSS38C, une spécifique pour le poliovirus Nanobodies, est montré. L&#39;affinité de PVSS38C a été testé pendant trois antigènes différents de poliovirus: Native-antigène (N-antigène), Chauffée-antigène (H-antigène) et sous-unités 14S. N-antigène est le virus intact qui est infectieux. Lorsque le virus est chauffé (20 minutes à 56 ° C) ou fixé à une surface solide (résultats non publiés), la conformation des changements de capside, résultant en une perte (partielle) de l&#39;ARN viral et la protéine de capside VP4, et vide capsides sont formées, qui sont alors appelés H-antigènes. Sous-unités 14S sont des intermédiaires d&#39;assemblage. Ces antigènes sont reconnus par différents ensembles d&#39;anticorps après la vaccination 10 et possèdent donc des épitopes différents et des sites antigéniques. Dans la figure le pourcentage de la radioactivité dans le surnageant est représentée comme une fonction de la concentration de Nanobody. Il peut être vu que la radioactivité dans le surnageant des échantillons contenant des sous-unités 14S radiomarqués diminue avec des concentrations croissantes de la PVSS38C Nanobodies. Cela peut se traduire par une augmentation de la quantité de poliovirus 14S con sous-unitésconnecté à la PVSS38C Nanobodies et indirectement à des billes magnétiques. Le titre de capture (= la concentration de Nanobodies nécessaire pour capturer 50% du virus radiomarqué) peuvent être représentés graphiquement calculé comme 0,099 nM. Pas d&#39;affinité de PVSS38C pour la N-antigénique et H-antigénique du poliovirus de forme est observée. A partir de ces données, il est interprété que PVSS38C est en interaction avec un épitope qui est exclusivement présent sur la sous-unité 14S et non pas sur les deux autres formes antigéniques de poliovirus. Pour démontrer que la perte de la radioactivité dans le surnageant est uniquement due à l&#39;affinité spécifique de la Nanobodies l&#39;égard de ses antigènes, le même dosage a été réalisé avec Nb1, un Nanobodies généré contre le régulateur transcriptionnel de lrpB sulfataricus Sulfolobus et connu pour avoir aucune interaction avec n&#39;importe quel antigène du poliovirus. Le résultat de ce test est représenté sur la figure 3. Tous les virus radiomarqué reste dans les surnageants montrant qu&#39;il n&#39;ya pas de réactivité desNb1 contre les trois formes antigéniques de poliovirus. La reproductibilité des résultats a été testée en répétant l&#39;expérience pour un total de huit fois pour une donnée Nanobodies (c.-à-PVSP29F) à des jours différents et par des personnes différentes. Les résultats sont présentés dans la figure 4. La valeur moyenne de la radioactivité dans le surnageant de pourcentage a été calculé pour chaque concentration Nanobodies et est représenté en correspondance avec son écart-type. <img alt="Figure 1." src="/files/ftp_upload/3937/3937fig1.jpg" /> Figure 1. Un aperçu du principe (A) et le procédé (B) du dosage. A. étiquette His nanocorps qui reconnaissent spécifiquement un antigène du poliovirus certaine sera en mesure d&#39;interagir avec les billes de cobalt-magnétiques revêtues et précipiter le virus de marqué radioactivement. Nanocorps B. Son-étiquette sont ajoutés à un poliovirus marqué radioactivement et incubé. Cobalt billes magnétiques revêtues sontajouté et la séparation magnétique de l&#39;antigène lié / non lié est effectué. La radioactivité du surnageant est mesurée et la quantité d&#39;antigène capturé peut être dérivée. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3937/3937fig2.jpg" /> Figure 2. Magnétique de capture par affinité perles d&#39;antigènes différents de poliovirus par Nanobodies PVSS38C. Le pourcentage de la radioactivité dans le surnageant est représentée comme une fonction de la concentration de PVSS38C. Pour 14S une relation dose-réponse peut être trouvée, montrant l&#39;interaction de PVSS38C avec un épitope exclusivement présent sur 14S. Aucune interaction significative avec la N-, ni H-antigène peut être détecté, même si un risque négligeable non spécifique de capture à des concentrations très élevées est remarqué. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3937/3937fig3.jpg" /> Figure 3. Magnétiques de capture par affinité billes d&#39;antigènes différents poliovirus par Nanobody Nb1 </strong&gt;. Le pourcentage de la radioactivité dans le surnageant est représentée comme une fonction de la concentration de Nb1. Nb1 est connu pour avoir aucune interaction avec tout poliovirus-antigène ou sous-unité. Puisque 100% de la radioactivité se trouve dans le surnageant, aucun virus n&#39;a été non spécifiquement liée à Nb1. La perte de la radioactivité dans la figure 2 est donc seulement en raison de l&#39;affinité spécifique de la Nanobodies l&#39;égard de ses antigènes. <img alt="Figure 4." src="/files/ftp_upload/3937/3937fig4.jpg" /> Figure 4. Reproductibilité du dosage. La valeur moyenne de la radioactivité pourcentage dans le surnageant est représentée comme une fonction de la concentration de Nanobody. L&#39;expérience a été répétée huit fois à des jours différents et par des personnes différentes. L&#39;écart-type est représenté par des barres verticales.

<ol><li>Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+antiviral+activity+of+single+domain+antibody+fragments+against+poliovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus.</a> Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).</li>
<li>Meloen, R. H., Briaire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+cross-reacting+antigens+on+the+intact+foot-and-mouth+disease+virus+and+its+12S+subunits+with+antisera+against+the+structural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins.</a> J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).</li>
<li>Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+quantitative+protein+A+micro-immunoprecipitation+method%3A+assay+of+antibodies+to+the+N+and+H+antigens+of+poliovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus.</a> J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).</li>
<li>Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+competition+immunoprecipitation+assay+of+unlabeled+poliovirus+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens.</a> J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).</li>
<li>Kessler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+antigens+from+cells+with+a+staphylococcal+protein+A-antibody+adsorbent%3A+parameters+of+the+interaction+of+antibody-antigen+complexes+with+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A.</a> J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).</li>
<li>Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. ajyana, Bendahman, E., N,, Hamers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li>
<li>Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+identification+of+single+domain+antibody+fragments+from+camel+heavy-chain+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies.</a> FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).</li>
<li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+domain+camel+antibodies%3A+current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single domain camel antibodies: current status.</a> Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).</li>
<li>Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+evolution+in+poliovirus+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Virol%22%5BJournal%5D)">Epitope evolution in poliovirus maturation.</a> Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).</li>
<li>Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybridoma+antibodies+to+poliovirus+N+and+H+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Virol%22%5BJournal%5D)">Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen.</a> Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).</li>
<li>Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+quantitative+affinity+capturing+assay+of+poliovirus+antigens+and+subviral+particles+by+single-domain+antibodies+using+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads.</a> J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).</li>
<li>Wild, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWild%2C+D+%22The+Immunoassay+Handbook%22">The Immunoassay Handbook</a>. , Third edition, Elsevier. (2005).</li>
<li>Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+labeling+of+human+rhinovirus+capsid+and+analysis+by+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis.</a> Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).</li>
<li>Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolar+endocytosis+of+simian+virus+40+reveals+a+new+two-step+vesicular-transport+pathway+to+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER.</a> Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Dans le protocole, la radioactivité de l&#39;antigène interagissant avec le Nanobodies est définie comme la perte du virus radiomarqué à partir du surnageant. Par conséquent, la quantité de radioactivité précipitée (= 100 - en%) (lié à des billes magnétiques) peut être estimée de façon indirecte par la radioactivité dans le surnageant (= a%). D&#39;autre part, il est également possible de mesurer la radioactivité de la fraction précipitée de l&#39;antigène lié de manière directe par l&#39;élution des immunocomplexes des...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Nom du réactif</strong</td&gt;<td<strong&gt; Société</strong</td&gt;<td<strongNuméro de catalogue&gt;</strong</td&gt;<td<strong&gt; Commentaires</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dynabeads His-Tag Isolement et Pulldown</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 101.03D</td&gt;<td&gt; Les billes magnétiques</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; &#39;HiSafe&#39; Optiphase 2</td&gt;<td&gt; Perkin Elmer</td&gt;<td&gt; 1200 - 436</td&gt;<tdFluide de scintillation&gt;</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

un essai en phase liquide d&#39;affinité de capture utilisant des billes magnétiques pour étudier interaction protéine-protéine: le poliovirus exemple-nanobodies

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

Dans cet article, un simple, quantitative, de dosage liquide phase de capture par affinité est présenté. Pourvu que d&#39;une protéine peut être marqué et une autre protéine marquée, cette méthode peut être mis en œuvre pour l&#39;enquête sur les interactions entre protéines. Il est basé sur une main sur la reconnaissance de la protéine marquée par des billes magnétiques revêtues de cobalt et d&#39;autre part sur l&#39;interaction entre la protéine marqué et une seconde protéine spécifique qui est marquée. Tout d&#39;abord, les protéines marquées et étiquetées sont mélangés et incubés à température ambiante. Les billes magnétiques, qui reconnaissent la balise, sont ajoutées et la fraction liée de la protéine marquée est séparée de la fraction non liée en utilisant des aimants. La quantité de protéine marqué qui est capturée peut être déterminée de manière indirecte par mesure du signal de la protéine marquée est resté dans la fraction non liée. Le dosage de liquide décrit la phase d&#39;affinité est extrêmement utile lorsque les protéines de conversion de conformation sont sensibles culAyed. Le développement et l&#39;application de l&#39;essai est démontrée pour l&#39;interaction entre les poliovirus et du poliovirus en reconnaissant nanocorps 1. Depuis poliovirus est sensible à la conversion conformationnelle 2 lorsqu&#39;il est attaché à une surface solide (résultats non publiés), l&#39;utilisation de la méthode ELISA est limitée et d&#39;un système en phase liquide à base doit donc être préféré. Un exemple d&#39;un système en phase liquide à base souvent utilisé dans les polioresearch 3,4 est la protéine micro-immunoprécipitation Un test de 5. Même si ce test a prouvé son applicabilité, il faut un Fc-structure, qui est absente dans les nanocorps 6,7. Toutefois, comme une autre occasion, ces intéressants et stables anticorps à domaine unique 8 peut être facilement conçu avec des étiquettes différentes. Le couramment utilisé (His) 6-étiquette indique l&#39;affinité pour les ions bivalents tels que le nickel ou le cobalt, qui à leur tour peuvent être facilement appliqué sur des billes magnétiques. Nous avons donc développé cette quantitative simpledosage de capture par affinité sur la base de cobalt revêtues billes magnétiques. Poliovirus a été marqué au 35 S pour permettre une interaction sans entrave avec les nanocorps et de faire une détection quantitative possible. La méthode est facile à réaliser et ne peut être établie avec un faible coût, qui est encore étayée par la possibilité de régénérer efficacement les billes magnétiques.

Dans cet article, un simple, quantitative, de dosage liquide phase de capture par affinité est présenté. C&#39;est une technique fiable, basé sur l&#39;interaction entre les billes magnétiques et les protéines marquées (par exemple nanocorps) d&#39;une part et l&#39;affinité entre la protéine marqué et une seconde, protéine marquée (poliovirus, par exemple) sur l&#39;autre.

Un essai en phase liquide d&#39;affinité de capture utilisant des billes magnétiques pour étudier interaction protéine-protéine: Le poliovirus Exemple-Nanobodies

Dans cet article, un essai de capture d'affinité en phase liquide, simple et quantitatif, est présenté. À condition qu'une protéine puisse être marquée et qu'une autre protéine...

Ce protocole exploite l'interaction entre le poliovirus et les nanocorps reconnaissant le poliovirus afin de démontrer un essai simple de capture d'affinité en phase liquide et quantitative. Des billes magnétiques revêtues de cobalt sont principalement utilisées pour précipiter les protéines marquées ainsi que toute protéine radioactive interagissant avec elles. Tout d'abord, mélangez les protéines marquées et étiquetées, puis incubez à température ambiante.Ensuite, ajoutez des billes magnétiques qui reconnaissent la marque, séparez la fraction liée de la protéine marquée de la fraction non liée à l'aide d'aimants. Puis mesurez le signal de la protéine marquée présente dans la fraction non liée et déterminez la quantité de protéine marquée retrouvée dans la fraction non liée. Les résultats de ce test d'affinité en phase liquide sont extrêmement utiles lorsqu'on analyse des protéines sensibles à la conversion conformationnelle.Ce dosage d'interaction par capture d'affinité en phase liquide peut fournir des informations sur l'interaction entre le poliovirus, les nano-anticorps reconnaissant le poliovirus et différents antigènes du poliovirus. La méthode peut également être appliquée à d'autres interactions protéine-protéine, à condition qu'une des protéines puisse être marquée et l'autre détectée. Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous nous sommes intéressés à l'étude de l'interaction entre le poliovirus, les nano-anticorps reconnaissant le poliovirus et différents antigènes du poliovirus.Étant donné que le poliovirus est sensible à la conversion conformationnelle lorsqu'il est fixé sur une surface solide, l'utilisation de l'ELSA est limitée. Un système en phase liquide devrait donc être privilégié. Un exemple de système en phase liquide fréquemment utilisé dans la recherche sur le poliovirus est le microprotéine.Un test d'immunoprécipitation. Bien que ce test ait démontré son applicabilité, il nécessite la structure cristallisée d'un anticorps conventionnel, structure absente chez les nanocorps. Ces nanocorps, qui sont des anticorps monodomaines intéressants et très stables, peuvent être facilement modifiés par différents textes.Le système His-tag très utilisé présente une affinité pour les ions bivalents, tels que le nickel et le cobalt, lesquels peuvent à leur tour être facilement fixés sur des billes magnétiques. Nous avons donc mis au point un dosage simple d'affinité quantitative basé sur des billes magnétiques revêtues de cobalt.Vortexez le stock de billes magnétiques et transférez 10 microlitres pour chaque échantillon dans un tube. Faites précipiter les billes à l’aide d’un aimant. Éliminez le surnageant clair pour laver les billes. Ajoutez 150 microlitres de tampon de liaison.Récupérez les billes à l’aide d’un aimant et éliminez le surnageant après un deuxième lavage. Resuspendez les billes dans 40 microlitres de tampon de liaison pour chaque échantillon à contrôler. Pour le fond dans l’échantillon un, préparez un puits sans virus radiomarqué, mais avec un volume égal de tampon de liaison comme témoin.Échantillon deux d'une activité radioactive à 100 %. Ajouter tous les composants dans un puits, sauf remplacer le nanocorps par du tampon de liaison. Ajouter ensuite 2000 désintégrations par minute du poliovirus marqué au soufre 35, souche sept, type un, dans un volume total de 80 microlitres de tampon de liaison à tous les échantillons.Accepter le témoin. Échantillon un. Ajouter 10 microlitres de dilution de nanocorps à chaque échantillon.Mélanger soigneusement pendant 10 secondes sur un agitateur et incuber une heure à température ambiante. Ensuite, ajouter 40 microlitres de la suspension de billes magnétiques lavées et incuber 10 minutes à température ambiante sous agitation continue, rassembler les billes à l’aide d’un aimant et transférer le surnageant clarifié dans un tube afin de mesurer la radioactivité de chaque échantillon ; transférer 50 microlitres du surnageant dans un flacon de comptage. Ajouter trois millilitres de mélange de liquide de scintillation et lire sur ce compteur.À l'aide d'eau, effectuez une contre-extraction des billes magnétiques utilisées dans un tube et centrifugez à 500 ×g pendant deux minutes. Éliminez le surnageant et resuspendez les billes dans six millilitres d'hydroxyde de sodium 0,5 molaire. Ensuite, aliquotez la suspension dans plusieurs tubes et incubez dans un bain ultrasonique pendant cinq minutes.Après avoir mis en pellet les billes à l’aide d’un aimant et avoir retiré le surnageant, ajouter un millilitre de solution de SDS à 2 % dans chaque tube, puis mélanger par vortex et recouvrir de papier aluminium pendant cinq minutes. Récupérer maintenant les billes. Ajouter un millilitre de EDTA 0,2 M, pH 7, dans chaque tube, et incuber les tubes dans un bain ultrasonique pendant cinq minutes.Ensuite, récupérez les billes, lavez-les avec un millilitre d'eau trois fois, puis avec un millilitre de solution de chlorure de cobalt à 10 millimolaire. Placez les tubes sur un agitateur pendant 10 minutes. Poursuivez en récupérant les billes sur un aimant et resuspendez-les dans un millilitre de tampon de liaison.Laver deux fois dans un millilitre d’éthanol 20 %, puis resuspendre finalement les billes dans leur volume initial d’éthanol 20 % afin d’obtenir les billes régénérées à une concentration de 40 milligrammes par millilitre. Corriger la radioactivité de fond en définissant les témoins : échantillonner un comme valeur de 0 % de radioactivité et le témoin deux comme valeur de 100 % de radioactivité.Maintenant, pour chaque échantillon, calculez le pourcentage de radioactivité dans le culot comme mesure de la précipitation globale du virus marqué au niveau du radio-isotope par le nanocorps. Cette expérience évalue l'affinité du nanocorps PVSS 38 C et d'un anticorps spécifique du poliovirus en utilisant trois antigènes différents du poliovirus : l'antigène natif, l'antigène chauffé et les sous-unités de 14 s. Fait intéressant, la radioactivité dans le culot des échantillons contenant les sous-unités de 14 s marquées au niveau du radio-isotope diminue avec l'augmentation des concentrations du nanocorps PVSS 38 C. Cela indique une augmentation de la quantité de sous-unités de 14 s du poliovirus liées au nanocorps PVSS 38 C, et indirectement aux billes magnétiques.Étant donné qu'aucune affinité de pvs S 38 C pour la forme antigénique N et la forme antigénique H du poliovirus n'est observée, le nanocorps semble spécifique de la sous-unité 14 s du poliovirus. L'affinité du nanocorps envers ses antigènes, mesurée par cette méthode, est spécifique, contrairement au nanocorps non apparenté. NB un ne montre aucune réactivité contre les trois formes antigéniques du poliovirus.Ce système offre une forte reproductibilité, comme indiqué par cette courbe de réponse à la dose générée par différents investigateurs à des jours différents. Une fois maîtrisé, cet essai fiable de capture par affinité en phase liquide peut être correctement réalisé en moins de deux heures, y compris le recyclage des billes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser cet essai de capture par affinité en phase liquide basé sur des billes magnétiques pour étudier l'interaction entre différentes protéines, notamment lorsque des systèmes basés sur une phase solide ne peuvent pas être utilisés.

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Pour tester l'interaction d'une protéine avec ses cibles lipidiques nous avons utilisé MACS et l'annexine V conjuguée à des billes magnétiques et les vésicules lipidiques synthétisées à partir des lipides cible et l'annexine V-contraignante phosphatidylsérine. Protéines liées à l'lipidiques cibles sont co-purifiés et analysés après élution à partir des perles.

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Une particule récemment développé une agglutination roman (PA) de dosage utilisant molécule réceptrice du virus a permis une identification rapide et facile de poliovirus (PV). Dans cet article, nous allons montrer la procédure pour le dosage de PA pour l'identification PV.

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Tandem Affinity Purification est une approche robuste pour l'identification de partenaires de liaison aux protéines. Comme preuve de concept, cette méthodologie a été appliquée à la eIF4E facteur d'initiation de traduction bien caractérisé à la co-précipité les facteurs cellulaires de l'hôte impliqués dans l'initiation de la traduction. Cette méthode est facilement adaptable à n'importe quelle protéine cellulaire ou virale.

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Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration d’un test d’immunoprécipitation, appelé test de capture VLP, pour isoler des particules pseudo-virales présentant un antigène, ou VLP, à partir d’un échantillon. L’antigène se lie à des anticorps spécifiques liés à des billes magnétiques, formant un complexe antigène-anticorps immobilisé qui est ensuite séparé et stocké pour une analyse plus approfondie.

Le test de capture de particules pseudo-virales : une méthode pour isoler les VLP affichant l’antigène d’un échantillon à l’aide de billes magnétiques conjuguées d’anticorps neutralisants

Nous décrivons ici les protocoles pour perturber les cellules de mammifères par fraisage à l'état solide à une température cryogénique, produire un extrait de cellule à partir de la poudre cellulaire résultante, et isoler des complexes de protéines d'intérêt par capture par affinité sur anticorps couplé micrométriques billes paramagnétiques.

Protein Complex Affinity Capture à partir de cellules de mammifères Cryomilled

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Débit Virometry pour l&#39;analyse antigénique Spectra de virions et extracellulaires Vésicules

Les interactions protéine-protéine peuvent se produire à la fois dans le noyau et le cytoplasme d’une cellule. Pour étudier ces interactions, la co-immunoprécipitation traditionnelle et le test moderne de ligature de proximité sont appliqués. Dans cette étude, nous comparons ces deux méthodes pour visualiser la distribution des interactions NF90-RBM3 dans le noyau et le cytoplasme.

Visualisation des interaction protéine-protéine en nucléaire et cytoplasmique Fractions par Co-immunoprécipitation et<em&gt; In Situ</em&gt; Proximité Ligation Assay

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Découvrez un essai de capture d'affinité en phase liquide utilisant des billes magnétiques pour étudier les interactions protéine-protéine avec le poliovirus. Cette méthode quantitative permet d'analyser les protéines sensibles aux changements conformationnels.

Un essai en phase liquide daffinité de capture utilisant des billes magnétiques pour étudier interaction protéine-protéine: Le poliovirus Exemple-Nanobodies (Vidéo) | JoVE Journal

Un essai en phase liquide d'affinité de capture utilisant des billes magnétiques pour étudier interaction protéine-protéine: Le poliovirus Exemple-Nanobodies

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