Un essai en phase liquide d'affinité de capture utilisant des billes magnétiques pour étudier interaction protéine-protéine: Le poliovirus Exemple-Nanobodies

Ce protocole utilise l’interaction entre le poliovirus et le poliovirus, en reconnaissant les nanocorps pour démontrer un simple test quantitatif de capture d’affinité en phase liquide. Principalement, les billes magnétiques recouvertes de cobalt sont utilisées pour tirer vers le bas les protéines marquées ainsi que toutes les protéines radiomarquées en interaction. Tout d’abord, mélangez les protéines marquées et étiquetées et incubez à température ambiante.

Ajoutez ensuite des billes magnétiques qui reconnaissent l’étiquette, séparez la fraction liée de la protéine marquée de la fraction non liée à l’aide d’aimants. Mesurez ensuite le signal de la protéine marquée trouvée dans la fraction non liée et déterminez la quantité de protéine marquée trouvée dans la fraction non liée. Les résultats de ce test d’affinité en phase liquide sont extrêmement utiles lorsque des protéines sensibles à la conversion de confirmation sont testées.

Ce test de capture par affinité en phase liquide peut fournir des informations sur l’interaction entre le poliovirus, en reconnaissant les nano boies et différents antigènes du poliovirus. La méthode peut également être appliquée à d’autres interactions protéiques à condition qu’une protéine puisse être marquée et que l’autre puisse être détectée. Nous avons d’abord eu l’identifiant de cette méthode lorsque nous nous sommes intéressés à étudier l’interaction entre le poliovirus, en reconnaissant les nanocorps et différents antigènes du poliovirus.

Étant donné que le poliovirus est sensible à la conversion de confirmation, lorsqu’il est fixé à une surface solide, l’utilisation de l’e LSA est limitée. Un système basé sur la phase liquide est donc à privilégier. La microprotéine est un exemple d’un tel système basé sur la phase liquide souvent utilisé dans la recherche sur le poliovirus.

Un test d’immunoprécipitation. Même si ce test a prouvé son applicabilité, il nécessite la structure cristallisée d’un anticorps conventionnel, qui est absent dans les nanocorps. Ces nanocorps, qui sont des anticorps à domaine unique intéressants et très stables, peuvent être facilement modifiés avec un texte différent.

Le plus utilisé. L’empilement montre une affinité pour les ions bivalents, tels que le nickel et le cobalt, qui à leur tour peuvent être facilement enrobés de billes magnétiques. Nous avons donc développé le test de capture d’affinité quantitative simple basé sur des billes magnétiques recouvertes de cobalt.

Reese consiste à utiliser le stock de billes magnétiques par vortex et à transférer 10 microlitres pour chaque échantillon dans un tube à granuler les billes à l’aide d’un aimant. Retirez le supinate transparent pour laver les billes. Ajouter 150 microlitres de tampon de liaison.

Récoltez les billes à l’aide d’un aimant et retirez le supinate après un deuxième lavage. Remettre les billes en suspension dans 40 microlitres de tampon de liaison pour chaque échantillon à contrôler. Pour le contexte du premier échantillon, préparez un puits sans virus radiomarqué, mais un volume égal de tampon de liaison pour le contrôle.

Deuxième échantillon de 100 % d’activité radio. Ajoutez tous les composants dans un puits, sauf remplacez le nano-corps par un tampon de liaison. Ajoutez maintenant 2000 comptes par minute de sept souches de poliovirus de type un marquées S 35 dans un volume total de 80 microlitres de tampon de liaison à tous les échantillons.

Acceptez le contrôle. Échantillonnez un. Ajoutez 10 microlitres de dilution de nano-corps à chaque échantillon.

Bien mélanger pendant 10 secondes sur un shaker et incuber pendant une heure à température ambiante. Ensuite, ajoutez 40 microlitres de suspension de billes magnétiques lavées et incubez pendant 10 minutes à température ambiante sous agitation continue, granulez les billes avec un aimant et transférez le SUP natant éliminé dans un tube pour mesurer la radioactivité de chaque échantillon, transférez 50 microlitres de supinate dans un flacon de comptage. Ajoutez trois millilitres de liquide à scintillation et lisez sur cet isolant.

Tirez contre les billes magnétiques utilisées dans un tube à l’aide d’eau et centrifugez 500 fois G pendant deux minutes. Jetez le supinate et remettez les billes en suspension dans six millilitres d’hydroxyde de sodium à 0,5 molaire. Ensuite, aliquote la suspension dans plusieurs tubes et incubation dans un bain à ultrasons pendant cinq minutes.

Après avoir granulé les billes avec un aimant et retiré le supinate, ajoutez un millilitre de solution SDS à 2 % dans chaque tube, puis mélangez par vortex et feuille pendant cinq minutes. Maintenant, récoltez les perles. Ajoutez un millilitre d’EDTA pH sept de 0,2 molaire dans chaque tube et incubez les tubes dans un bain à ultrasons pendant cinq minutes.

Ensuite, récupérez les billes, lavez-les avec un millilitre d’eau trois fois suivi d’un millilitre de solution de chlorure de cobalt de 10 millimolaires. Placez les tubes sur un shaker pendant 10 minutes. Procédez à la récolte des perles sur un aimant et suspendez-les dans un millilitre de tampon de liaison.

Lavez deux fois dans un millilitre d’éthanol à 20 %, puis remettez les billes en suspension dans leur volume d’origine à 20 % d’éthanol pour obtenir des billes régénérées à une concentration de 40 milligrammes par millilitre. Corrigez la radioactivité de fond en réglant le contrôle. Le premier échantillon est la valeur de 0 % de radioactivité et le deuxième échantillon de contrôle la valeur de 100 % de radioactivité.

Maintenant, pour chaque échantillon, calculez le pourcentage de radioactivité dans l’état comme mesure de la précipitation globale du virus radiomarqué par le nanocorps. Cette expérience évalue l’affinité du PVSS 38 C et de l’anticorps spécifique du poliovirus à l’aide de trois antigènes différents du poliovirus, de l’antigène natif, de l’antigène chauffé et des sous-unités 14 s. Il est intéressant de noter que la radioactivité dans l’État des échantillons contenant des sous-unités 14 s radiomarquées diminue avec l’augmentation des concentrations du nanocorps PVSS 38 C.Cela indique une augmentation de la quantité de sous-unités 14 s du poliovirus connectées au nano corps P pvs, S 38 C, et indirectement aux billes magnétiques.

Étant donné qu’aucune affinité de pvs S 38 C pour la forme antigénique N et la forme antigénique H du poliovirus n’est observée, le nanocorps semble spécifique de la sous-unité 14 s du poliovirus. L’affinité du nanocorps envers ses antigènes, mesurée par cette méthode, est spécifique au nanocorps non apparenté. NB : un ne montre aucune réactivité contre les trois formes antigéniques du poliovirus.

Ce système produit une reproductibilité élevée, comme l’indique cette courbe dose-réponse générée par différents chercheurs à différents jours. Une fois maîtrisé cette phase liquide fiable, le test de capture par affinité peut être correctement effectué dans les deux heures de recyclage des battements inclus. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser ce test de capture d’affinité en phase liquide basé sur les battements magnétiques lors de l’étude de l’interaction entre différentes protéines, en particulier lorsque les systèmes basés sur la phase solide ne peuvent pas être utilisés.