Détection de rares variantes génomiques à partir de séquençage regroupés à l'aide SPLINTER

L'objectif général de cette procédure est d'identifier des gènes au sein d'une population d'individus présentant une prédominance de variations fonctionnelles rares. Cela est réalisé en regroupant d'abord une population d'échantillons d'ADN. La deuxième étape consiste à créer et à séquencer une bibliothèque de séquençage de nouvelle génération.

Cela est suivi par l'alignement des lectures sur la séquence de référence et la création d'un modèle d'erreur. La dernière étape consiste en une analyse informatique à l'aide de l'algorithme splinter. En fin de compte, l'analyse splinter du séquençage parallèle en tandem est utilisée pour identifier les gènes au sein des populations présentant une prédominance de variations fonctionnelles rares, illustrant ainsi la procédure.

Aujourd'hui, Francesco Vilania, étudiant diplômé dans le laboratoire de mon mentor et collaborateur, Rob Mitra, sera accompagné par Enrique Ramos, un étudiant diplômé de mon propre laboratoire. L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les génotypes individuels uniques, est qu'elle permet de détecter très précisément des variants rares de séquence au sein d'une population mixte de molécules d'ADN, sans nécessiter d'informations préalables. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la génétique et de la génomique, notamment comment déterminer la fréquence de variants rares responsables de maladies nouvelles dans des études sur de grands cohortes.

Chaque expérience de microfragment nécessite la présence d'un témoin négatif et d'un témoin positif afin d'obtenir une précision optimale ; préparez le mélange de réaction PCR en utilisant la polymérase ADN PFU ultra haute fidélité. Le témoin négatif correspond à un produit PCR provenant d'une séquence d'ADN connue pour ne présenter aucune variation génétique, comme un squelette de vecteur cloné.

Ici, un amplicon de 1 934 paires de bases provenant du vecteur M13 MP18 est utilisé. Le témoin positif peut être constitué de n'importe quel ensemble de variants de séquence préalablement validés présents dans l'ensemble de la population. Si ces données ne sont pas disponibles, ce laboratoire a conçu un témoin positif artificiel composé d'un produit PCR de 331 paires de bases à partir d'un mélange de séquences conçues, clonées dans le vecteur PGMT easy, comme indiqué dans ce tableau.

Ces séquences sont combinées afin de simuler différentes fréquences d'allèles mineurs des variants réels au sein de la cohorte de patients. Après amplification PCR des échantillons, comme indiqué dans le protocole écrit accompagnant cette vidéo, purifiez chaque produit PCR des amorces en excès à l'aide de colonnes de purification rapides Kyogen Kayak ou de plaques filtrantes 96 puits associées à un système de vide pour une purification à grande échelle. Une fois purifiés, quantifiez chaque produit PCR en utilisant des techniques standards.

Préparez-vous à combiner tous les produits de PCR et les contrôles dans un pool normalisé par nombre de molécules. Le regroupement par concentration entraînerait une surreprésentation des amplicons courts par rapport aux produits plus longs. Au lieu de cela, regroupez un nombre normalisé de molécules par amplicon.

Choisissez des nombres arbitraires suffisamment élevés pour maintenir la précision lors du pipetage. Récupérez les produits de PCR et les témoins. La ligature des produits de PCR est nécessaire, car la fragmentation de petits amplicons de PCR risque de biaiser la représentation vers leurs extrémités.

Pour cette raison, nous ligaturons les produits PCR d'élution dans un grand con avant leur fragmentation. Préparez le mélange pour la ligature à extrémités contondantes en utilisant la ligase T4, la T4 PNK et le PEG comme indiqué dans le protocole. Incubez la réaction à 22 degrés Celsius pendant 17 heures.

Procéder ensuite à une incubation à 65 degrés Celsius pendant 20 minutes, puis maintenir à quatre degrés Celsius. Vérifier la ligation en chargeant 50 nanogrammes d'échantillon sur un gel d'agarose. Une ligation réussie se traduira par la présence d'une bande de poids moléculaire élevé dans la piste.

Préparez la fragmentation de l'ADN selon une stratégie de sonication aléatoire en diluant l'échantillon d'un facteur 10 dans le tampon Qiagen PB afin de le rendre moins visqueux. Ensuite, fragmentez le grand cône de produits de PCR à l'aide d'un bio-rupteur à nœud diagonal pour 24 échantillons, en soniquant à haute puissance pendant 25 minutes selon un cycle de 40 secondes activé et 20 secondes désactivé par minute. Vérifiez les résultats de la fragmentation de l'ADN sur un gel d'agarose et poursuivez avec le séquençage illumina comme décrit dans le texte.

Pour commencer le séquençage, effectuez l'alignement des lectures. Convertissez soit les fichiers bruts de séquençage au format scarf, soit compressez-les. La compression est facultative.

Il permet de gagner du temps et de l'espace lors des étapes d'analyse ultérieures sans perdre d'information pertinente. À l'aide de l'outil d'alignement inclus, alignez les lectures brutes sur la séquence de référence annotée plus rapide. Concernant les régions ciblées, incluez les réactions de PCR ainsi que les contrôles positifs et négatifs.

Le format d'entrée doit être au format scarf ou compressé. Ensuite, effectuez l'annotation des fichiers comme décrit dans le texte. Chaque exécution génère un profil unique d'erreur de séquençage, qui doit être caractérisé afin d'assurer un appel précis des variants et de modéliser les erreurs pour chaque exécution.

Un témoin interne dont on sait qu'il présente des variations de séquence est inclus dans chaque bibliothèque d'échantillons en pool. À partir du fichier étiqueté aligné, générez un fichier de modèle d'erreur à l'aide de l'outil fourni et de la séquence de référence du témoin négatif ; toutes les séquences du témoin négatif peuvent être utilisées, ou, de manière alternative, uniquement un sous-ensemble spécifié par ses extrémités 5' et 3'. Les lectures uniques et les pseudo-comptes doivent toujours être appliqués.

L'outil générera trois fichiers nommés d'après le paramètre du nom de fichier de sortie, avec un suffixe zéro, un ou deux. Ces fichiers correspondent respectivement à un modèle d'erreur d'ordre zéro, d'ordre un et d'ordre deux pour l'appel de variants avec splinter. Le modèle d'erreur d'ordre deux doit toujours être utilisé pour la visualisation du profil du taux d'erreur du run.

Le script Pearl utilisé pour tracer le graphique du modèle d'erreur peut être employé pour générer un tracé d'erreur PDF à partir du fichier de modèle d'erreur d'ordre zéro. Le fichier de tracé révélera les tendances d'erreur spécifiques à l'expérience et peut être utilisé pour déduire le nombre maximal de bases lues pour l'analyse. La section suivante démontrera comment exécuter splinter sur le fichier aligné en utilisant le modèle d'erreur pour détecter des variants de séquence rares.

La première étape de l'analyse consiste à exécuter splinter sur le fichier aligné en utilisant la séquence de référence et le modèle d'erreur. Les bases issues de lectures individuelles peuvent être exclues de l'analyse si elles s'avèrent défectueuses. Le seuil de valeur P détermine la rigueur de l'analyse de détection des variants.

Une valeur seuil minimale de -1,301 constitue un bon point de départ. L'option de taille de pool optimise la discrimination signal/bruit de l'algorithme en éliminant les variations potentielles liées à des fréquences alléliques mineures inférieures à celle d'un seul allèle dans le pool réel. L'option de taille de pool doit être réglée sur la valeur la plus proche supérieure au nombre réel d'allèles analysés dans l'expérience.

La variance détectée à des fréquences plus basses sera ignorée comme du bruit. Après avoir saisi tous les paramètres et les noms de fichiers, exécutez splinter. Ce fichier renvoie tous les résultats significatifs sur le plan statistique à travers l'échantillon, accompagnés d'une description de la position et du type de variante.

Valeur P par fréquence du brin d'ADN du variant et couverture totale par brin d'ADN. La fiole de liste est utilisée par splinter pour normaliser la couverture à travers l'échantillon. Le premier champ indique l'amplicon d'intérêt, tandis que le deuxième champ indique la position à laquelle la mutation est présente.

N indique que le reste de la séquence ne contient aucune mutation. Une normalisation étant nécessaire, l'analyse du témoin positif est essentielle pour maximiser la sensibilité et la spécificité d'un essai particulier. Ceci est important car très probablement, le seuil initial de -1,301 ne sera pas suffisant pour éliminer tous les faux positifs.

Chaque analyse de fente affichera la valeur P réelle pour chaque variante détectée, ce qui ne pouvait pas être prédit a priori. Toutefois, l'analyse complète peut être répétée en utilisant la valeur P la moins stricte affichée dans le résultat initial pour les positions de bases positives connues. Cela permettra de conserver tous les vrais positifs tout en excluant la majorité, voire la totalité, des faux positifs, qui présentent généralement des valeurs P nettement moins significatives par rapport aux vrais positifs.

Pour automatiser ce processus, on peut utiliser le script de test de seuil. Le script de test de seuil nécessite un fichier de sortie de Splinter et une liste de résultats positifs sous la forme d'un fichier séparé par des tabulations, similaire à celui utilisé pour la normalisation. Le résultat produit sera une liste de seuils qui convergent progressivement vers le seuil optimal.

La dernière ligne représente le seuil le plus optimal pour l'analyse et peut donc être utilisée pour l'analyse des données. Le résultat optimal consiste à atteindre une sensibilité et une spécificité égales à un. Toutefois, si cet objectif n'est pas atteint, l'analyse des fragments peut être optimisée en modifiant le nombre de bases lues incorporées.

La coupure finale peut être appliquée aux données à l'aide du script cutoff cut, qui filtrera le fichier de sortie de splinter en éliminant les résultats situés en dessous du seuil optimal. Cette étape générera le fichier de sortie final de splinter, qui contiendra les snips et les indels présents dans l'échantillon. Veuillez noter que le format de sortie pour les insertions est légèrement différent de celui des substitutions ou des délétions.

La précision en fonction de la couverture pour un allèle unique dans un échantillon groupé est visualisée dans ce type de graphique. La précision est estimée par la surface sous la courbe, abrégée en SSSC, d'une courbe ROC (caractéristique de fonctionnement du récepteur) et varie d'une précision aléatoire de 0,5 à une précision parfaite de 1,0. Dans cet exemple, la SSSC est tracée en fonction de la couverture par allèle pour la détection d'allèles mutants uniques dans des groupes de 200 à 501 000 allèles.

Ici, une UC est tracée en fonction du total des insertions, des délétions et des substitutions. Ce graphique d'erreur montre la probabilité d'incorporer une base erronée à une position donnée. Le profil d'erreur révèle des taux d'erreur faibles avec une tendance croissante vers l'extrémité trois prime de la lecture de séquençage.

Des nucléotides de référence notablement différents présentent des probabilités d'erreur différentes. Ce graphique montre la précision de Splinter dans l'estimation de la fréquence allélique pour les positions ayant une couverture supérieure à 25 fois par allèle. Une comparaison entre les fréquences alléliques d'ADN en pool estimées par Splinter et les décomptes alléliques mesurés par des études d'association génomique complète ou résultats de GWAS.

Dans un cas de très forte corrélation, une population de 974 individus a été prélevée et ciblée sur plus de 20 kilobases pour le séquençage. Splinter a été utilisé pour la détection de variants rares. Conformément au protocole standard, chaque individu avait fait l'objet d'un génotypage préalable par concordance gwas entre le génotypage des variants marqués et ceux nouvellement identifiés.

Les appels effectués sur l'échantillon groupé étaient excellents. Trois variants, dont deux étaient rares dans la population, ont été identifiés comme étant de novo à partir des résultats du séquençage et ont été validés par pyroséquençage individuel ; les fréquences alléliques mineures ou la concordance mathématique entre le pyroséquençage et le séquençage groupé étaient excellentes. Une fois que vous avez terminé de rechercher vos variants rares dans votre échantillon groupé, beaucoup de personnes souhaitent connaître les conséquences fonctionnelles des variants que vous avez identifiés.

Ainsi, l'annotation de votre variance devient la prochaine étape du processus après un développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du séquençage de l'ADN pour étudier des variants rares d'une manière rapide et rentable afin de caractériser des variants rares dans de grandes études de population. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de détecter des variants de séquence rares dans un échantillon d'ADN groupé en utilisant splinter.