Détection de rares variantes génomiques à partir de séquençage regroupés à l'aide SPLINTER

L’objectif global de cette procédure est d’identifier des gènes au sein d’une population d’individus présentant une prépondérance de variations fonctionnelles rares. Pour ce faire, on regroupe d’abord une population d’échantillons d’ADN. La deuxième étape consiste à créer et à séquencer une bibliothèque de séquençage de nouvelle génération.

S’ensuit l’alignement des lectures sur la séquence de référence et la création d’un modèle d’erreur. La dernière étape est l’analyse computationnelle à l’aide de l’algorithme splinter. En fin de compte, l’analyse par éclats du séquençage de nouvelle génération groupé est utilisée pour montrer les gènes au sein de populations hébergeant une prépondérance de variance fonctionnelle rare, démontrant la procédure.

Aujourd’hui, ce sera Francesco Vilania, qui est un étudiant diplômé dans le laboratoire de mon mentor et de notre collaborateur, Rob Mitra, et il sera rejoint par Enrique Ramos, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les génotypes individuels uniques, est qu’elle permet de détecter très précisément des variants de séquence rares dans une population mixte de molécules d’ADN sans nécessiter d’informations préalables. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la génétique et de la génomique, telles que la façon de déterminer la fréquence de nouvelles maladies causant des variants rares dans de grandes études de cohorte.

Chaque expérience d’éclatement nécessite la présence d’un contrôle négatif et positif pour obtenir une précision optimale, préparez le mélange de réaction PCR à l’aide de PFU ultra haute fidélité. ADN polymérase. Le contrôle négatif est un produit PCR à partir de n’importe quelle séquence d’ADN connue pour être sans variation génétique, telle qu’un squelette de vecteur cloné.

Ici, un amplicon de paire de bases de 1 934 du vecteur M 13 MP 18 est utilisé. Le contrôle positif peut être n’importe quel ensemble de variantes de séquence préalablement validées présentes dans l’ensemble de la population. Si ces données ne sont pas disponibles, ce laboratoire a conçu un contrôle positif artificiel composé d’une base 331 par produit PCR à partir d’un mélange de séquences modifiées clonées dans le vecteur facile PGMT tel qu’indiqué dans ce tableau.

Ces séquences sont combinées pour imiter diverses fréquences d’allèles mineurs de véritables variantes au sein du bassin de patients. Après l’amplification par PCR des échantillons, comme indiqué dans le protocole écrit accompagnant cette vidéo, nettoyez chaque produit PCR de l’excès d’amorces à l’aide d’une purification rapide par colonne de kayak kyogen, ou de plaques filtrantes à 96 puits avec collecteur à vide pour un nettoyage à grande échelle. Une fois purifié, quantifiez chaque produit PCR à l’aide de techniques standard.

Préparez-vous à combiner tous les produits et contrôles de PCR dans un pool normalisé par nombre de molécules. La mise en commun par concentration entraînera une surreprésentation des petits amplicons par rapport aux produits plus grands. Au lieu de cela, mettez en commun un nombre normalisé de molécules par amplicons.

Choisissez des nombres arbitraires suffisamment grands pour maintenir la précision pendant le pipetage. Retirez les produits et les contrôles PCR. La ligature des produits PCR est nécessaire car la fragmentation des petits demandeurs de PCR risque de biaiser la représentation à leurs fins.

Pour cette raison, nous ligaturons les produits de PCR en grandes cons avant leur fragmentation. Préparez le mélange pour la ligature à bout émoussé en utilisant T quatre Ligase, T quatre PNK et PEG comme indiqué dans le protocole. Incuber la réaction à 22 degrés Celsius pendant 17 heures.

Poursuivre avec l’incubation à 65 degrés Celsius pendant 20 minutes et maintenir à quatre degrés Celsius. Vérifiez la ligature en chargeant 50 nanogrammes d’échantillon dans un gel arose. Une ligature réussie entraînera la présence d’une bande de poids moléculaire élevé dans la voie.

Préparez-vous à la fragmentation de l’ADN grâce à une stratégie de sonication aléatoire en diluant l’échantillon 10 pour un dans le tampon Qiagen PB pour le rendre moins visqueux. Ensuite, fragmentez le grand cône des produits PCR à l’aide d’une bio-rupture de nœud de diagnostic de 24 échantillons, d’un sonicate à haute puissance pendant 25 minutes avec 40 secondes de marche et 20 secondes d’arrêt par minute. Vérifiez les résultats de la fragmentation de l’ADN sur un agrogel et procédez au séquençage illumineux comme décrit dans le texte.

Pour commencer le séquençage, lisez alignement. Convertissez le séquençage brut, lisez les fichiers au format scarf ou compressez-les. La compression est facultative.

Il permet de gagner du temps et de l’espace pour les étapes d’analyse ultérieures sans perdre d’informations pertinentes. À l’aide de l’outil d’alignement inclus, alignez les lectures brutes sur la séquence de référence annotée plus rapide. Les régions ciblées comprennent les réactions PCR ainsi que les contrôles positifs et négatifs.

Le format d’entrée doit être au format scarf ou compressé. Ensuite, effectuez le balisage des fichiers comme décrit dans le texte. Chaque exécution génère un profil unique d’erreur de séquençage à caractériser pour une demande précise de variant appelant des erreurs de modèle pour chaque exécution.

Un contrôle interne connu pour être déployé de variation de séquence est inclus dans chaque bibliothèque d’échantillons de pool à partir du fichier balisé aligné. Générez un fichier de modèle d’erreur à l’aide de l’outil inclus avec la séquence de référence de contrôle négatif, toute la séquence de contrôle négatif peut être utilisée ou bien seulement un sous-ensemble lorsqu’il est spécifié par ses cinq extrémités premières et trois premières extrémités. Des lectures uniques et des pseudo-comptages doivent toujours être appliqués.

L’outil génère trois fichiers nommés comme paramètre de nom de fichier de sortie se terminant par zéro, un ou deux. Ces fichiers correspondent respectivement à un modèle d’erreur zéro de premier ordre et de second ordre pour l’appel de variant avec splinter. Le modèle d’erreur du second ordre doit toujours être utilisé pour la visualisation du profil de taux d’erreur d’exécution.

Le script Pearl utilisé pour tracer le graphique du modèle d’erreur peut être utilisé pour générer un graphique d’erreur PDF sur le fichier de modèle d’erreur d’ordre zéro. Le fichier de tracé révélera les tendances d’erreur spécifiques à l’exécution et peut être utilisé pour déduire le nombre maximum de bases de lecture pour l’analyse. La section suivante montrera comment exécuter splinter sur le fichier aligné à l’aide du modèle d’erreur pour détecter les variantes de séquence rares.

La première étape de l’analyse consiste à exécuter splinter sur le fichier aligné à l’aide de la séquence de référence et du modèle d’erreur. Les bases à lecture unique peuvent être exclues de l’analyse si elles s’avèrent défectueuses. Le seuil de la valeur P dicte la rigueur de l’analyse des appels de variants.

Un seuil minimum de moins 1,301 est un bon début. L’option de taille de pool optimise la discrimination du signal de l’algorithme par rapport au bruit en éliminant la variance potentielle avec des fréquences d’allèles mineures inférieures à celles d’un seul allèle dans le pool réel. L’option de taille du pool doit être définie sur la valeur la plus proche qui est supérieure au nombre réel d’allèles analysés dans l’expérience.

La variance appelée à des fréquences inférieures sera ignorée comme du bruit. Après avoir saisi tous les paramètres et les noms de fichiers, exécutez splinter. Ce fichier renvoie tous les résultats statistiquement significatifs dans l’échantillon avec une description de la position du type de variant

Valeur p par brin d’ADN, fréquence du variant et couverture totale par brin d’ADN. Le flacon de liste est utilisé par splinter pour normaliser la couverture de l’échantillon. Le premier champ indique l’amplicon d’intérêt, tandis que le second champ indique la position dans laquelle la mutation est présente.

N indique que le reste de la séquence ne contient aucune mutation. Une normalisation, l’analyse du contrôle positif est essentielle pour maximiser la sensibilité et la spécificité pour un cycle particulier. C’est important car il est fort probable que le seuil initial de moins 1,301 ne suffira pas à éliminer tous les faux positifs.

Chaque analyse Splinter montrera la valeur P réelle pour chaque variante appelée, qui n’a pas pu être prédite comme prioritaire. Cependant, l’ensemble de l’analyse peut être répété en utilisant la valeur P la moins stricte affichée sur la sortie initiale pour les positions de base positives réelles connues. Cela servira à conserver tous les vrais positifs tout en excluant la plupart, sinon la totalité, des faux positifs, qui ont généralement des valeurs P beaucoup moins significatives que les vrais positifs.

Pour automatiser ce processus, le script de test de coupure peut être utilisé. Le script de test de coupure nécessite un fichier de sortie splinter et une liste d’accès de contrôle positif sous la forme d’un fichier délimité par des tabulations comme celui utilisé pour la normalisation. Le résultat sera une liste de seuils qui atteignent progressivement le seuil optimal.

La dernière ligne représente la coupure la plus optimale pour le cycle et peut donc être utilisée pour l’analyse des données. Le résultat optimal est d’atteindre la sensibilité et la spécificité de l’un. Cependant, si elle n’est pas atteinte, l’analyse des éclats peut être optimisée en modifiant le nombre de bases de lecture incorporées.

La coupure finale peut être appliquée aux données à l’aide du script de coupure, qui filtrera le fichier de sortie Splinter contre les occurrences inférieures à la coupure optimale. Cette étape générera le fichier de sortie splinter final, qui contiendra les snips et les indels présents dans l’échantillon. Veuillez noter que le résultat des insertions est légèrement différent de celui des substitutions ou des suppressions.

La précision en fonction de la couverture d’un seul allèle dans un échantillon groupé est visualisée dans ce type de graphique. La précision est estimée comme l’aire sous la courbe abrégée d’un UC d’une courbe d’opérateur de récepteur et varie d’une précision aléatoire de 0,5 à une précision parfaite de 1,0. Dans cet exemple, une UC est tracée en fonction de la couverture par allèle pour la détection d’allèles mutants uniques dans des pools de 200 501 000 allèles.

Ici, une UC est tracée en fonction du total pour les insertions, les suppressions et les substitutions. Ce graphique d’erreur montre la probabilité d’incorporer une base erronée à une position donnée. Le profil d’erreur montre de faibles taux d’erreur avec une tendance croissante vers les trois extrémités premières de la lecture du séquençage.

Notamment, différents nucléotides de référence présentent des probabilités d’erreur différentes. Ce graphique révèle la précision de l’éclat dans l’estimation de la fréquence de l’allèle pour les positions qui avaient une couverture supérieure à 25 fois par allèle. Une comparaison entre les fréquences d’allèles d’ADN regroupées estimées par éclats et le nombre d’allèles mesurés par des études d’association à l’échelle du génome ou les résultats GWAS.

Dans une corrélation très élevée, une population de 974 individus a été prélevée et ciblée sur plus de 20 kilobases pour le séquençage. Splinter a été utilisé pour la détection de variants rares. Suivant le protocole standard, chaque individu a eu un génotypage préalablement effectué par concordance gwas entre le génotypage des variants marqués et des nouveaux variants.

Les personnes appelées dans l’échantillon groupé étaient excellentes. Trois variantes, dont deux étaient rares dans la population, ont été appelées denovo à partir des résultats de séquençage, et ont été validées par pyroséquençage individuel, les fréquences d’allèles mineurs ou la concordance mathématique entre le pyroséquençage et le séquençage tiré était excellente. Une fois que vous avez fini de trouver votre variance rare dans votre échantillon groupé, de nombreuses personnes veulent savoir quelles sont les conséquences fonctionnelles de la variance que vous avez identifiée.

Ainsi, l’annotation de votre variance devient l’étape suivante du processus après un développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du séquençage de l’ADN pour étudier des variants rares de manière rapide et rentable afin de caractériser des variants rares dans des études de population à grande échelle. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de détecter des variantes de séquence rares dans un pool, un échantillon d’ADN à l’aide d’éclats.