Name: Suppression des fibroblastes rapide de haute densité embryonnaires humaines cultures de cellules souches (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-28T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Découvrez une méthode d'aspiration rapide pour isoler des colonies de cellules souches embryonnaires humaines de cultures à haute densité avec fibroblastes embryonnaires de souris. Cette technique préserve l'intégrité et la pluripotence des colonies.

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Ce travail a été financé par une nouvelle Faculty Award II du California Institute of Regenerative Medicine (RN2-00921-1), et un prix financée par les NIH National de la Recherche (F32-HL104924)

1. Préparation des mangeoires embryonnaires de souris <ol><li> La FAE utilisé dans la co-culture des CSEh doivent être préalablement traités par irradiation ou mitomycine-C pour inhiber les cellules en cours de division de. </li><li> Deux heures avant le semis, MEF, manteau chaque plasma de 60 mm boîte de culture traitée avec 2 ml de 0,05% de gélatine. </li><li> Décongeler une fiole de traité MEF et la plaque à ~ 20.000 cellules / cm 2. </li><li> Permettre aux cellules d&#39;adhérer nuit. </li></ol> 2. Co-ensemencement CSEh sur les MEF <ol><li> De nouvelles colonies peut être initiée à partir de cultures cryoconservés ou repiquage des cultures actuelles sur de nouveaux MEF boîtes revêtues, comme ci-dessous. </li><li> Laver la plaque contenant les colonies de CSEh grandes pour être repiquées 1 fois avec 3 ml de PBS 1x réchauffé. </li><li> Ajouter 3 ml de collagénase IV / solution de PBS (1 mg / ml) et incuber pendant 5-10 min à 37 ° C. (Remarque: Les cellules ne deviennent distincts ou ballon comme on le voit par la trypsine). </li><li> Bien que les cellules sont encore encollagénase, l&#39;utilisation d&#39;un bord d&#39;un embout de pipette 5 ml, de créer un motif de grille sur les colonies, les casser en petits amas cellulaires. </li><li> Utiliser l&#39;extrémité de la pointe de pipette (tenue de façon perpendiculaire à la plaque de culture) pour racler le fond de la plaque de culture, déloger toutes les cellules de la surface. </li><li> Recueillir les cellules dans un tube Falcon et de spin au (1000 rpm) pendant 5 min. </li><li> Après centrifugation, aspirer le milieu, laissant le culot cellulaire dans le tube Falcon. </li><li> Aspirer le milieu MEF MEF de l&#39;plaquée la veille. </li><li> Re-plaque les cellules à un ratio de 1:3 de la plaque d&#39;origine, et se nourrissent avec 3 ml de milieu de CSEh </li></ol> 3. Appauvrissant la FAE de la co-culture Remarque: l&#39;homme cultures ESC doit être à haute densité, généralement entre 10 et 14 jours de culture. <ol><li> Placez l&#39;extrémité d&#39;une pipette d&#39;aspiration sur le bord de la plaque et permettre l&#39;aspiration pour tirer doucement le bord de la feuille MEF. </li><li> ReMove les médias du plat et laissez la pointe d&#39;attraper la feuille de cellules et déplacer lentement la pointe d&#39;une manière arquée au-dessus de la plaque. Remarque: La feuille peut obstruer à la pointe de la pipette, mais ce n&#39;est pas problématique, car elle ne doit pas empêcher l&#39;utilisateur de tirer manuellement la feuille de la surface de la plaque de culture. Si les cellules sont collées à la fin de l&#39;aspirateur, on peut utiliser la partie supérieure de la boîte de culture à rompre la feuille de cellules pour l&#39;aspiration terminée. </li><li> Remplacer immédiatement moyenne CSEh, et mettre la plaque arrière dans l&#39;incubateur. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Le résultat final de la procédure de suppression MEF produit de petites colonies de CSEh non perturbées (figure 1D) pouvant subir une expansion significative en très grandes colonies (figure 2), tout en maintenant l&#39;expression des décideurs pluripotence SSEA-4, oct ¾, et Tra 1-81 (Figure 3). Figure 1. La morphologie des colonies ESC Avant et après le retrait du MEF. Embryonnaires humaines colonies de cellules souches à un jour) 1 et B) le jour 2 après le semis sur des boîtes de culture. C) haute densité Embryonnaires humaines colonies de cellules souches (H7) entouré par MEF. Les deux colonies de CSEh sont présentées en pointillés rouges. D) Après le retrait du MEF en utilisant la technique d&#39;aspiration décrits, on se retrouve avec une colonie isolée CSEh avec très peu MEF entourant la colonie intacte. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3951/3951fig2.jpg" /> Figure 2. Expansion Colony ESC 10 jours après le retrait du MEF. La colonie CSEh d&#39;origine immédiatement après l&#39;épuisement du MEF (à gauche) est autorisé à augmenter en une colonie très importante (à droite) approassociés quelque 800 um, 10x. Noter que la colonie originale est reproduite au même grossissement (10x) comme la colonie composite. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3951/3951fig3.jpg" /> Figure 3. Immunocoloration des colonies de CSEh MEF appauvries. Identification par immunofluorescence des colonies jusqu&#39;à 10 jours après l&#39;épuisement du MEF montre que les colonies maintenir leur expression de marqueurs de pluripotence comme évidente ici octobre ¾, SSEA-4 et Tra-1-81 coloration. En outre, ces colonies de CSEh ne présentent pas de différenciation vers un destin mésodermique, indiqué par l&#39;absence de Flk-1. A, E, I et M) sont des images de transmission de la lumière des colonies immunoflouscently tachés, 20, 10, 10 et 2x, . respectivement B, F, J et N) montrent les noyaux -. cellules DAPI colorés de colonies par immunofluorescence tachés, 20, 10, 10 et 2x, respectivement CD) montrent l&#39;expression dehumaine marqueur de cellules souches SSEA-4 uniquement, et l&#39;image composite, 20x. GH) montrent l&#39;expression de cellules souches humaines marqueur octobre ¾ seulement, et l&#39;image composite, KL 10x.) montrent l&#39;expression de marqueurs des cellules souches humaines Tra 1-81 seulement , et l&#39;image composite, 10x. MP) La dernière ligne si les images représentent une colonie décrivant les frontières lisses typiques vus à ce grossissement, 2x, et ces colonies n&#39;étaient pas expressément O) Flk-1, un marqueur précoce de la différenciation du mésoderme, ni ne ils P) contient aucun fibroblastes, comme indiqué par l&#39;absence de coloration DDR2. Vidéo supplémentaire. Retrait fibroblastes par aspiration de feuilles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3951/3951movie1.mp4" target="_blank">Cliquez ici pour voir le film</a> .

<ol><li>Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+inner+cell+mass+cells+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts.</a> Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).</li>
<li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts%3A+somatic+differentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).</li>
<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated%2C+scalable+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Automated, scalable culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions.</a> Biotechnol Bioeng. 102, 1636-1644 (2009).</li>
<li>Kolhar, P., Kotamraju, V. R., Hikita, S. T., Clegg, D. O., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+surfaces+for+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture.</a> J. Biotechnol. 146, 143-146 (2010).</li>
<li>Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+culture+system+using+human+foreskin+fibroblasts+as+feeder+cells+allows+production+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells.</a> Hum. Reprod. 18, 1404-1409 (2003).</li>
<li>McKay, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+feeder+cell+line+for+derivation+and+culture+of+hESc%2FhiPSc%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Human feeder cell line for derivation and culture of hESc/hiPSc.</a> Stem Cell Res. 7, 154-162 (2011).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li>
<li>Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStein%2C+GS+%22Thawing%2C+Seeding%2C+and+Changing+Medium+of+Human+Embryonic+Stem+Cells%22">Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells</a>. Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. , John Wiley & Sons, Inc. (2010).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol. Biol. 767, 107-123 Forthcoming.</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La méthode présentée dans ce manuscrit offre une alternative rapide et moins coûteux à éliminer les cellules nourricières de fibroblastes humains à partir de cultures de cellules embryonnaires. La suppression réussie de fibroblastes est subordonnée à l&#39;existence d&#39;une monocouche serrée confluente de ces cellules qui se développe en plus des cultures de cellules souches. Après 7-10 jours, les colonies de CSEh croissance va pousser les fibroblastes nourriciers vers l&#39;extérieur, générant une monocouche de fibro...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> DDR2 </td><td> Santa Cruz </td><td> 7555 </td><td> Marqueur fibroblastes </td></tr><tr><td> Dapi </td><td> Calbiochem </td><td> 268298 </td><td> Marqueur noyau cellulaire </td></tr><tr><td> SSEA-4 </td><td> Millipore </td><td> MAB4304 </td><td> CSE humaines Marker </td></tr><tr><td> Oct 3/4 </td><td> Santa Cruz </td><td> 9081 </td><td> CSE humaines Marker </td></tr><tr><td> Flk-1 </td><td> BD Pharma </td><td> 555307 </td><td> Marqueur de différenciation précoce </td></tr><tr><td> Tra-1-81 </td><td> Acris </td><td> AM20377AF4-S </td><td> CSE humaines Marker </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Tableau des raisons spécifiquesgents utilisés pour l&#39;immunomarquage CSEh.

suppression des fibroblastes rapide de haute densité embryonnaires humaines cultures de cellules souches

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Souris fibroblastes embryonnaires (MEF) ont été utilisés pour établir des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) après l&#39;isolement des cultures blastocyste 1. Ce système d&#39;alimentation maintient CSEh à partir de subir une différenciation spontanée lors de l&#39;expansion cellulaire. Cependant, cette méthode de co-culture demande beaucoup de travail, nécessite un personnel hautement qualifié, et la pureté des rendements CSEh faible 4. De nombreux laboratoires ont tenté de minimiser le nombre de cellules nourricières dans les cultures de CSEh (c.-à matrice incorporant boîtes revêtues ou d&#39;autres types de cellules nourricières 5-8). Ces systèmes de culture modifiés ont montré une certaine promesse, mais n&#39;ont pas supplanté la méthode standard pour la culture des CSEh avec la mitomycine C traités par les fibroblastes de souris embyronic afin de retarder indésirables différenciation spontanée des cultures de CSEh. Par conséquent, les cellules nourricières utilisés dans l&#39;expansion de CSEh doivent être retirés au cours d&#39;expériences de différenciation. Bien que plusieurs techniques sont disponibles pour la purification de la coopération CSEhlonies (FACS, MACS, ou l&#39;utilisation de vecteurs résistants aux médicaments) de mangeoires, ces techniques demandent beaucoup de travail, coûteux et / ou destructive à l&#39;CSEh. L&#39;objectif de ce projet était d&#39;inventer une méthode de purification qui permet la récolte d&#39;une population pure de CSEh. Nous avons observé que dans une culture confluente CSEh, la population MEF peut être enlevé en utilisant une aspiration simple et rapide de la feuille MEF. Cette suppression est tributaire de plusieurs facteurs, y compris latéral de cellule à cellule de liaison de MEF qui ont une faible affinité de liaison à la boîte de culture styrène, et la capacité des colonies de cellules souches à pousser les fibroblastes vers l&#39;extérieur lors de la génération de leurs propres &quot; niche ». Le CSEh ont ensuite été examinés pour SSEA-4, Oct3 / 4 et Tra 1-81 expression jusqu&#39;à 10 jours après le retrait du MEF pour assurer le maintien de la pluripotence. En outre, les colonies de CSEh ont été en mesure de poursuivre sa croissance dans de grandes formations après le retrait du MEF, offrant un niveau supplémentaire de l&#39;expansion sur les CSEh.

Malgré les efforts en cours pour les cultures de transition vers d&#39;alimentation sans conditions, la dérivation et la culture de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) restent largement tributaires des co-cultures avec mangeoires embryonnaires de souris (MEF). Ici, nous montrons une nouvelle méthodologie pour éliminer rapidement départs à partir de cultures de CSEh avant l&#39;expérimentation.

Suppression des fibroblastes rapide de haute densité embryonnaires humaines cultures de cellules souches

Des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) ont été utilisés pour établir des cultures de cellules souches embryonnaires humaines (hESC) après l'isolement du blastocyste1. Ce système de cellules nourricières...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'isoler des colonies de cellules souches humaines de manière rapide et efficace. Cela est réalisé en cultivant des cellules embryonnaires humaines sur une couche dense de fibroblastes embryonnaires de souris. Au fil du temps, l'expansion de la population de cellules souches augmente le nombre de cellules souches humaines, tout en leur permettant de former des colonies en forme d'îlots dans le MES.Ensuite, la couche de méthylcellulose est éliminée par aspiration, laissant derrière elle les colonies individuelles de cellules souches embryonnaires humaines. Les résultats de la coloration immunohistochimique pour les marqueurs des cellules souches montrent qu'il s'agit d'une méthode d'isolement efficace permettant d'éliminer les cellules nourricières et de préserver l'intégrité des colonies. J'ai eu l'idée de cette méthode pour la première fois lors de la co-culture de cellules dans notre laboratoire, lorsque j'ai souhaité sauvegarder les cultures de cellules souches provenant de systèmes de culture trop confluentes.Le problème que la plupart des personnes rencontreront avec ce système est le manque d'expérience en culture de cellules so

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JoVE Journal

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Cet article décrit un protocole pour l'isolement et l'entretien des cultures de fibroblastes primaires de la peau et les tissus pulmonaires de rongeurs sauvages.

Établir des cultures primaires de fibroblastes adultes à partir de rongeurs

Le comportement des fibroblastes sous-tend un spectre d’entités cliniques, mais ils restent mal caractérisés, en grande partie en raison de leur hétérogénéité inhérente. La recherche traditionnelle sur les fibroblastes repose sur la manipulation in vitro, masquant le comportement des fibroblastes in vivo. Nous décrivons un protocole basé sur FACS pour l’isolement des fibroblastes de peau de souris qui ne nécessite pas de culture cellulaire.

Murin fibroblastes dermiques Isolation par FACS

Nous décrivons une procédure expérimentale simple et rapide pour générer des fibroblastes primaires des oreilles et de la queue de souris. Le procédé ne nécessite pas de formation spécifique des animaux et peut être utilisé pour la production de cultures de fibroblastes des oreilles stockées à température ambiante pendant jusqu'à 10 jours.

Cultures Génération fibroblastes primaires de souris oreilles et la queue tissus

La dérivation robuste des cellules de la tige pluripotente induite par l'homme (hiPS) a été réalisée en utilisant une reprogrammation médiée par vecteur de virus Sendai non-intégrant (SeV) des fibroblastes dermiques. La maintenance cellulaire de hiPS et l'expansion clonale ont été réalisées en utilisant des conditions de culture sans xénon et chimiquement définies avec une matrice recombinante de la laminine humaine 521 (LN-521) et un milieu E8 (E8) essentiel.

Intégration de la dérivation libre de cellules souches pluripotentes induites par l&#39;homme à l&#39;aide de Laminin 521 Matrix

Ici, nous décrivons une méthode cliniquement pertinente, haute efficacité, exempte d’engraissement pour reprogrammer les fibroblastes humains primaires sur les cellules souches pluripotentes induites à l’aide de mis à jour l’ARNm codant pour des facteurs de reprogrammation et mature microARN-367/302 imite. Est également inclus les méthodes pour évaluer l’efficacité de reprogrammation, développez colonies clonales iPSC et confirmer l’expression du marqueur de pluripotence TRA-1-60.

Base d’ARN reprogrammation des fibroblastes humains de primaires sur les cellules souches pluripotentes induites

Ce manuscrit décrit un protocole basé sur le FACS pour l’isolement des fibroblastes papillaires et réticulaires de la peau humaine. Il contourne la culture in vitro qui était inévitable avec le protocole d’isolement couramment utilisé par les cultures explant. Les sous-ensembles de fibroblastes qui émanent sont fonctionnellement distincts et présentent une expression et une localisation différentielles dans le derme.

Isolement des fibroblastes papillaires et réticulaires de la peau humaine par tri cellulaire activé par fluorescence

Ce protocole décrit une méthode rapide pour générer simultanément des cultures de mlanocytes et de fibroblastes à partir de la peau de souris de 0 à 4 jours. Ces cultures primaires peuvent être maintenues et manipulées in vitro pour étudier une variété de processus physiologiquement pertinents, y compris la biologie des cellules de la peau, la pigmentation, la cicatrisation des plaies et le mélanome.

Génération rapide de cultures de murine primaire et de fibroblaste

Nous présentons un protocole pour isoler les fibroblastes adultes primaires d'une manière facile, rapide et fiable, performable par les débutants (p. ex., les étudiants). La procédure combine la digestion des tissus enzymatiques et l'agitation mécanique avec des ondes ultrasoniques pour obtenir des fibroblastes primaires. Le protocole peut facilement être adapté à des exigences expérimentales spécifiques (p. ex., tissus humains).

Isolement du fibroblaste primaire adulte à ultrasons

La reprogrammation cellulaire nécessite l'introduction de gènes clés, qui régulent et maintiennent l'état cellulaire pluripotent. Le protocole décrit permet la formation de colonies de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) à partir de fibroblastes dermiques humains sans méthodes virales/intégratrices, mais en utilisant des ARN non modifiés (NM-ARN) combinés à des facteurs d'évasion immunitaire réduisant les mécanismes de défense cellulaire.

Isolement des fibroblastes dermiques humains adultes de la peau abdominale et génération de cellules souches pluripotentes induites à l'aide d'une méthode de non-intégration

Nous présentons ici une méthode qui combine l’utilisation de l’effacement épigénétique chimique avec des indices liés à la mécanosension pour générer efficacement des cellules pluripotentes de mammifères, sans avoir besoin de transfection de gènes ou de vecteurs rétroviraux. Cette stratégie est donc prometteuse pour la médecine translationnelle et représente une avancée notable dans la technologie des organoïdes de cellules souches.

Une stratégie en deux étapes qui combine la modification épigénétique et les indices biomécaniques pour générer des cellules pluripotentes de mammifères

Présenté ici est un protocole pour générer des tissus conjonctifs modifiés pour une culture parallèle de 48 tissus dans une plaque multi-puits avec des doubles pôles, adapté aux études mécanistes, à la modélisation des maladies et aux applications de dépistage. Le protocole est compatible avec les fibroblastes de différents organes et espèces et est illustré ici avec les fibroblastes cardiaques primaires humains.

Tissu conjonctif humain dérivé de fibroblastes pour les applications de dépistage

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