Suppression des fibroblastes rapide de haute densité embryonnaires humaines cultures de cellules souches

L'objectif général de l'expérience suivante est d'isoler des colonies de cellules souches humaines de manière rapide et efficace. Cela est réalisé en cultivant des cellules embryonnaires humaines sur une couche dense de fibroblastes embryonnaires de souris. Au fil du temps, l'expansion de la population de cellules souches augmente le nombre de cellules souches humaines, tout en leur permettant de former des colonies en forme d'îlots dans le MES.

Ensuite, la couche de méthylcellulose est éliminée par aspiration, laissant derrière elle les colonies individuelles de cellules souches embryonnaires humaines. Les résultats de la coloration immunohistochimique pour les marqueurs des cellules souches montrent qu'il s'agit d'une méthode d'isolement efficace permettant d'éliminer les cellules nourricières et de préserver l'intégrité des colonies. J'ai eu l'idée de cette méthode pour la première fois lors de la co-culture de cellules dans notre laboratoire, lorsque j'ai souhaité sauvegarder les cultures de cellules souches provenant de systèmes de culture trop confluentes.

Le problème que la plupart des personnes rencontreront avec ce système est le manque d'expérience en culture de cellules souches humaines. Nous avons trouvé cette technique particulièrement utile lorsque nous devons isoler un grand nombre de cellules souches embryonnaires humaines pour des expériences, par rapport à d'autres méthodes telles que le tri ou la sélection manuelle de colonies de cellules souches. Cette méthode est plus rapide et plus efficace pour isoler des colonies à partir de cultures à haute densité.

Les fibroblastes embryonnaires de souris doivent être traités au mitomycine C ou irradiés avant d'être mis en co-culture avec des cellules souches embryonnaires afin de les empêcher de se diviser. Deux heures avant la mise en place des meph, recouvrir chaque boîte de culture de 60 millimètres traitée au plasma de deux millilitres de gélatine à 0,05 %, décongeler un flacon de mes traités, centrifuger pendant cinq minutes à 1 500 tr/min et ensemencer. Une culture d'environ 20 000 cellules par centimètre carré sur la boîte recouverte de gélatine, puis incuber la culture toute la nuit pour les cellules adhérentes. De nouvelles cultures peuvent être initiées à partir de cellules cryoconservées ou en transférant les cultures actuelles sur des boîtes traitées au méth. Lorsqu'on débute avec une plaque contenant de grandes colonies de cellules souches embryonnaires humaines, rincer une fois avec trois millilitres de solution saline tamponnée au phosphate réchauffée.

Ajoutez trois millilitres d'une solution de collagénase IV à un milligramme par millilitre et incubez de cinq à 10 minutes. À 37 degrés Celsius, les cellules ne deviendront pas distinctes ni ne s'arrondiront comme on le voit avec la trypsine. À l'aide du bord d'une pipette de cinq millilitres, créez un motif en grille sur les colonies et fragmentez-les en petits agrégats cellulaires.

Maintenant, en tenant l'extrémité de la pipette perpendiculairement à la plaque de culture, grattez le fond de la plaque et détachez toutes les cellules de la surface. Transférez les cellules dans un tube conique, puis récoltez les cellules par centrifugation à 1000 tr/min pendant cinq minutes et aspirez le milieu. Ensuite, aspirez le milieu des fibroblastes embryonnaires de souris ensemencés la veille.

Ensuite, ensemencez les cellules souches embryonnaires humaines à un ratio de un à trois par rapport à la plaque d'origine et ajoutez trois millilitres de milieu pour cellules souches embryonnaires humaines. Les cellules HECH sont cultivées à forte densité pendant 10 à 14 jours. Placez la pointe d'une pipette d'aspiration au bord de la plaque et utilisez l'aspiration pour soulever délicatement le bord de la feuille de méthylcellulose.

Retirez le milieu de la boîte. Laissez la pointe saisir la feuille de cellules, puis déplacez lentement la pointe de manière incurvée au-dessus de la plaque. Si la feuille obstrue principalement la pipette, retirez la feuille de la culture.

Tapotez le dessus de la boîte de culture avec un aspirateur pour achever la dissociation des cellules et retirez les cellules par une aspiration complète. Remplacez immédiatement le milieu de cellules souches embryonnaires humaines et remettez la culture dans un incubateur à cellules après ensemencement dans les boîtes de culture. Ce système de co-culture donne des colonies denses de cellules souches embryonnaires humaines entourées de fibroblastes embryonnaires de souris.

La technique d'aspiration élimine les MES et produit de petites colonies indisturbées de cellules souches embryonnaires humaines. Avec très peu de MES entourant la colonie intacte, les colonies de cellules souches embryonnaires peuvent subir une expansion importante pour devenir de très grandes colonies. Par exemple, cette colonie de cellules souches embryonnaires humaines montrée immédiatement après l'épuisement de la méth a donné lieu à une très grande colonie, identifiée par immunofluorescence jusqu'à 10 jours après la méth.

La privation montre que les colonies conservent leur expression des marqueurs de pluripotence et n'exhibent aucune différenciation vers le destin mésodermique. Ces images en lumière transmise montrent la morphologie de colonies marquées par immunofluorescence à différentes amplifications. Le DAPI marque les noyaux des cellules.

Il est important de noter que les cellules souches embryonnaires humaines expriment les marqueurs des cellules souches humaines SSEA4, TRA-1-60 et TRA-1-81. Notez que les images montrent une colonie présentant des bords typiquement lisses. Elles n'expriment pas FLK1, un marqueur précoce de la différenciation mésodermique, et ne contiennent aucun fibroblaste, comme en témoigne l'absence de coloration pour DDR2.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler des colonies de cellules souches humaines en utilisant des techniques de culture permettant de manipuler les environnements naturels. Une fois cette méthode maîtrisée, l'opération peut être réalisée en quelques secondes. De plus, n'oubliez pas de veiller à ce que vos cultures ne s'assèchent pas lors du retrait du milieu et des couches de débris.