Le façonnage d'une bicouche Hydrogel de contrôler la différenciation ASC

L’objectif global de cette procédure est de créer une matrice composite à partir de biomatériaux naturels qui peuvent être utilisés pour délivrer et différencier les cellules souches afin d’aider à la cicatrisation des plaies. Pour ce faire, on isole d’abord des cellules souches dérivées de l’adipe, ou un CS, à partir d’un animal de test. Ensuite, les A SC sont chargés sur des microsphères de chitosane préfabriquées.

Ensuite, le gel de collagène FIBRILLÉ est coulé et les billes A-S-C-C-S-M sont superposées sur le gel de collagène. Enfin, le gel de fibrine PEG est coulé sur le gel de collagène A-S-C-C-S-M, et un milieu est ajouté. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent la migration simultanée bidirectionnelle de A SC de la bille CSM dans les matrices de fibrine de collagène et de PEG.

Grâce à cette procédure, une seule source de cellules souches peut prendre des signaux différentiels des microenvironnements de collagène et de fibrine PEG, et être stimulée de manière différentielle pour produire des facteurs pléiotropes et former un réseau de structures prévasculaires. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les composites monomatériaux ou les substituts cutanés décellularisés, est que ces autres produits ne s’attaquent pas activement à la revascularisation du produit par l’hôte. Nous avons eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons remarqué que le RAD A SE isolé a la propension à se différencier vers un phénotype vasculaire lorsqu’il est cultivé dans une matrice de fibrine de porc.

Cette observation a suscité l’idée qu’une seule source de cellules souches pouvait être utilisée simultanément dans un système composé de différents biomatériaux. Après avoir isolé et cultivé des cellules souches dérivées de l’adipeux ou ASC, préparé des microsphères de chitosane ou CSM et chargé les ASC dans les CSM, préparez du polyéthylène glycol, de l’hydrogel de fibrine en dissolvant le succinyl glut derate peg modifié dans quatre millilitres de sérum physiologique tamponné. Juste avant l’expérience, utilisez un filtre de 0,22 micron pour stériliser la solution.

Dans un puits de culture d’un mélange de six plaques de puits, 500 microlitres de fibrinogène et 250 microlitres de PEG incuberont pendant 20 minutes dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Ensuite, mélangez 250 microlitres d’A-S-C-C-S-M préalablement préparé avec la solution de fibrinogène pégylé, ajoutez immédiatement un millilitre de solution mère de thrombine et, à l’aide d’une pipette, placez rapidement le mélange de gel cellulaire une ou deux fois dans une plaque à 12 puits et incubez dans une chambre humidifiée à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, lavez deux fois la fibrine de peg résultante avec HBSS et incubez avec un milieu essentiel alpha minimal complété par 10 % de FBS dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius en utilisant des techniques de microscopie optique standard sur une période de 11 jours.

Observez la migration des cellules du CSM dans le mélange de gel, A-S-C-C-S-M avec du collagène de type un extrait des tendons de la queue de rat à l’aide de deux hydroxydes de sodium normaux. Ajustez le pH à 6,8 et fibrillez. Ajoutez le mélange de collagène fibrillé, A-S-C-C-S-M dans une plaque à 12 puits et incubez dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Après avoir vérifié que la fibrillation est complète, incubez les gels de collagène A-S-C-C-S-M jusqu’à 11 jours dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Observez la migration des cellules du CSM dans le gel sur une période de 11 jours à l’aide de techniques de microscopie standard pour développer la construction bicouche afin d’étudier les propriétés de migration et de co-induction d’une source unique de cellules souches. À l’aide de deux échafaudages biologiques.

Préparez à la fois le collagène et les gels de fibrine PEG avec les légères modifications suivantes, préparez un millilitre de 7,5 milligrammes par millilitre de collagène. Transférez ensuite le mélange dans un insert de culture tissulaire à six puits et incubez pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Après une fibrillation complète, étendez sur la surface du collagène 200 microlitres de cinq milligrammes d’A-S-C-C-S-M dans un milieu de culture.

Une fois que les microsphères se sont déposées sur le gel, préparez le gel de fibrine PEG en utilisant 250 microlitres de milieu de culture cellulaire. Ensuite, superposez la solution de thrombine de fibrinogène pégylé sur les couches de collagène A-S-C-C-S-M. Une fois terminé, incubez les constructions pendant 30 minutes dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone pour obtenir l’achèvement.

Enfin, placez un millilitre de fluide dans la chambre supérieure au-dessus de la construction et trois millilitres de fluide dans la chambre inférieure. La caractérisation d’un CS intégré dans cet échafaudage a révélé qu’un CSM chargé en SC peut être pris en sandwich entre une couche de collagène et de fibrine de peg simultanément et prendre différemment des indices des deux environnements extracellulaires pour prospérer dans leurs nouvelles conditions. Comme le montre ici, le collagène soutient la capacité des ASC à rester des cellules souches, comme l’a démontré leur expression de stro one en vert, ainsi que leur morphologie de fibroblaste.

En revanche, la fibrine PEG a induit les ASC à se différencier vers un phénotype avasculaire, comme le démontre leur morphologie en forme de tube illustrée ici, avec une lumière et leur expression spécifique des cellules endothéliales de la marque de von Willow et du facteur montré ici en rouge. De plus, comme démontré ici, ces phénotypes observés semblaient se produire au début de la culture et se sont maintenus pendant 11 jours. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les cellules souches dérivées du tissu adipeux de rat, de les charger sur du chito et des microsphères, et de les incorporer dans un hydrogel bicouche à l’aide de biomatériaux approuvés par la FDA.

N’oubliez pas que les biomatériaux et les cellules utilisés dans ce protocole sont dérivés d’animaux et d’humains et peuvent être extrêmement dangereux s’ils sont contaminés par des agents pathogènes de leur hôte. Et des précautions telles que l’équipement de protection individuelle et les techniques de culture cellulaire aseptique doivent toujours être prises lors de l’exécution de ces procédures.