Extériorisation Mésentère Rat: Un modèle pour étudier la dynamique cellulaires impliqués dans l'angiogenèse

L'objectif de l'expérience suivante est d'identifier les dynamiques cellulaires spatiales et temporelles impliquées dans l'angiogenèse, définie comme la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants. À l'aide d'un modèle simple et reproductible, stimuler d'abord l'angiogenèse en extériorisant brièvement le mésentère de rat, puis prélever les tissus mésentériques à différents moments après la stimulation. Ensuite, marquer immunologiquement les coupes de tissus.

Par exemple, utilisez un marqueur de cellule endothéliale pour visualiser l'ensemble du remodelage du réseau vasculaire au sein d'un tissu et créer une visualisation bidimensionnelle essentielle des réseaux microvasculaires en croissance. Ce modèle est intéressant car il produit une augmentation marquée de plusieurs paramètres angiogéniques pris ensemble, sur une période relativement courte. La visualisation des réseaux au niveau cellulaire unique et la corrélation de ces paramètres avec un marquage multicellulaire se sont révélées extrêmement utiles pour identifier de nouveaux phénotypes cellulaires impliquant la bourgeonnement capillaire.

Cette méthode pourrait aider à répondre à des questions clés concernant la dynamique cellulaire impliquée dans la croissance du réseau microvasculaire. Cela inclut le moment et l'endroit où certaines cellules sont présentes au cours du processus de bourgeonnement capillaire. Les principaux avantages de cette méthode sont sa simplicité, la nécessité d'une intervention chirurgicale minimale et la production d'une réponse angiogénique robuste sur une période relativement courte.

En outre, cette méthode tire parti du mésentère de rat, un tissu qui permet l'observation d'un réseau intact jusqu'au niveau cellulaire. Selon notre expérience, elle est très facile à apprendre et, par conséquent, reproductible d'un chercheur à l'autre lors de la démonstration de la procédure. Aujourd'hui, Peter Stapler, étudiant diplômé dans notre laboratoire, se préparera à la chirurgie selon les indications détaillées dans le texte accompagnant.

Après avoir rasé la zone abdominale du rat, placer le rat anesthésié sur le dos sur un tapis chauffant afin de maintenir sa température corporelle, nettoyer la zone abdominale avec des lingettes stériles imbibées d'alcool à 70 % et d'iodine, effectuer une petite incision longitudinale au niveau de la peau environ un pouce sous le sternum, puis au niveau de la ligne alba, poser le champ opératoire pré-découpé sur la région abdominale de manière à ce que l'ouverture s'aligne avec l'incision. Appliquer doucement une pression autour de l'incision pour faire apparaître l'intestin grêle. À l'aide d'appliquateurs en coton, extraire délicatement une section de l'intestin grêle en posant le mésentère sur la platine en plastique contenant du sérum physiologique stérile, puis localiser l'iléon.

Identifier six à huit fenêtres mésentériques vascularisées, la membrane mince et translucide située entre les paires artère-veine, qui vascularisent l'intestin grêle. Enregistrer l'heure de début de l'intervention et régler une minuterie sur 20 minutes. Marquer les deux fenêtres mésentériques situées au centre à l'aide d'un fil de suture stérile de calibre 7-0 dans la zone grasse proche de l'intestin.

Reconstituez périodiquement la solution saline dans la boîte de Pétri à l’aide d’une seringue stérile de cinq millilitres afin de garantir que le tissu reste immergé et humide. Après la période d’extériorisation, replacez le mésentère dans la cavité abdominale. Fermez le muscle abdominal à l’aide d’un point de suture monofilament de calibre cinq zéro, en surjet interrompu.

Ensuite, fermer la peau avec quatre points séparés de suture monofilament zéro, nettoyer la zone de suture avec des compresses alternées en utilisant la gaze stérile imbibée d’alcool à 70 % et d’iode, appliquer un gel lubrifiant sur les deux yeux du rat et le replacer dans sa cage pour la récupération. Le jour d’intérêt, après la stimulation, anesthésier et euthanasier le rat conformément aux directives institutionnelles. Ensuite, rouvrir la cavité abdominale et recouvrir la zone abdominale avec un morceau de film plastique. Maintenant, extraire délicatement l’intestin grêle et localiser les deux fenêtres marquées à l’aide de forceps et de ciseaux microchirurgicaux.

Découper chacune des fenêtres mésentériques extériorisées, en incluant une bordure de tissu adipeux. S'efforcer d'éviter de sectionner les paires artère-veine situées dans la bordure grasse des fenêtres afin de minimiser un éventuel remplissage sanguin des fenêtres. Également limiter la section du tube digestif, qui pourrait entraîner une fuite de contenu intestinal.

En contactant les fenêtres, immergez immédiatement chaque fenêtre dans du PBS. Utilisez ensuite des pinces pour étaler les tissus sur une lame d'objectif chargée positivement. Montez deux tissus par lame. Une fois que les tissus sont partiellement séchés, retirez l'excès de graisse à l'aide d'une lame de scalpel.

Fixer les échantillons dans du méthanol pendant 30 minutes à moins 20 degrés Celsius en les plaçant au congélateur. Sécher les lames sous vide pour éliminer l'excès de solution tampon. En outre, délimiter les tissus avec un stylo à cire pour éviter l'écoulement incontrôlé des solutions d'anticorps en dehors du tissu.

Ajoutez maintenant environ 200 microlitres de solution d'anticorps primaire diluée pour recouvrir entièrement le tissu. Incubez pendant une heure à température ambiante, puis lavez les tissus avec du PBS contenant 0,1 % de sapin en effectuant trois changements de tampon. Ensuite, ajoutez la solution d'anticorps secondaire peroxydase streptavidine et incubez à température ambiante pendant une heure ; après trois lavages, incubez les échantillons dans le réactif Vector Nova Red pendant 15 minutes.

Rincez à l'eau pour monter les lames. Plongez 10 fois dans de l'éthanol à 95 %, puis effectuez des étapes successives de déshydratation. Laissez sécher les lames, recouvrez les tissus d'une fine couche, ajustez la quantité et la position des lamelles après séchage sous vide et marquage.

Les lames. Recouvrez les échantillons de tissu avec une solution d'anticorps primaire diluée. Incubez pendant une heure à température ambiante.

Laver trois fois avec du PBS contenant 0,1 % de saponine, 10 minutes par lavage. Ensuite, ajouter l'anticorps secondaire et incuber pendant une heure. Effectuer les lavages dans du PBS contenant 0,1 % de saponine, monter les lames dans du PBS avec du glycérol et sceller avec du vernis à ongles.

Ici, nous détaillons la modification d'une boîte de Petri courante afin de l'utiliser comme plateau chirurgical. De la pâte à modeler jaune a été utilisée pour offrir une surface lisse à travers laquelle le mésentère peut être tiré par l'ouverture préalablement découpée. Là encore, les fenêtres mésentériques montrées ici sur le plateau pendant la période d'extériorisation sont définies comme les membranes minces et translucides situées entre les paires artère-veine qui vascularisent l'intestin à cet endroit.

L'étiquetage par PCAM permet d'identifier tous les types de vaisseaux le long de la hiérarchie des réseaux microvasculaires en cours de remodelage à des points temporels spécifiques après l'externalisation. Ces images peuvent être utilisées pour quantifier des paramètres angiogéniques à des points temporels précis. Après la stimulation.

L'étiquetage PCAM permet de distinguer les artérioles des veinules. Notez que les artérioles nourricières présentent généralement des diamètres plus petits et une morphologie allongée des cellules endothéliales par rapport aux veinules appariées. Les caractéristiques typiques des réseaux remodelés incluent la surface vascularisée, la bourgeonnement capillaire et la densité vasculaire.

La quantification de ces divers paramètres angiogéniques caractérise le déroulement temporel de la croissance du réseau. La bourgeonnement capillaire à partir de vaisseaux préexistants atteint un maximum entre le troisième et le cinquième jour, puis revient à un niveau non stimulé au dixième jour. Cette augmentation transitoire du bourgeonnement est suivie, dans notre laboratoire, par une augmentation de la surface vascularisée et de la densité vasculaire.

Ce système modèle a été utilisé pour identifier de nouveaux changements phénotypiques cellulaires à des points temporels spécifiques au cours de ce processus de remodelage. La coloration immunofluorescente par marquage PCA met en évidence les cellules endothéliales en rouge, tandis que le marquage de la bêta-tubuline de classe trois colore en vert les nerfs et les parasites le long des vaisseaux angiogéniques. Fait intéressant, dans les tissus non stimulés, l'expression de la bêta-tubuline de classe trois est spécifique aux nerfs.

En revanche, au pic de la bourgeonnement capillaire, la tubuline bêta de classe trois est exprimée par les cellules périvasculaires. Ce type de résultat met en évidence l'utilité de ce modèle angiogénique simple et robuste pour identifier de nouveaux types cellulaires impliqués dans le processus angiogénique. Au jour 10, le profil d'expression de la tubuline bêta de classe trois commence à revenir au scénario non stimulé.

Ce modèle pourrait également être utilisé potentiellement pour des études de lignage cellulaire. La faisabilité de l'incorporation cellulaire dans le tissu mésentérique en cours de remodelage est appuyée par ces études préliminaires, au cours desquelles des cellules de la moelle osseuse prémarquées ou des cellules souches mésenchymateuses ont été superfusionnées sur des fenêtres mésentériques pendant la période d'extériorisation de 20 minutes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser notre modèle d'intériorisation du mésentère de rat pour étudier la dynamique cellulaire impliquée dans la croissance du réseau microvasculaire.

Cette technique simple peut être réalisée en environ 45 minutes à une heure. N'oubliez pas qu'il est essentiel de manipuler délicatement le mésentère et d'éviter de percer les vaisseaux après une intervention chirurgicale. Un marquage immunohistochimique peut être effectué pour identifier plusieurs types cellulaires le long des vaisseaux sanguins.

Vous pouvez également marquer les vaisseaux lymphatiques et les nerfs. Cela nous permet d'étudier non seulement les changements phénotypiques cellulaires impliqués dans l'angiogenèse, mais aussi la coordination entre l'angiogenèse, la neurogenèse et l'angiogenèse lymphatique.