Name: Solubilisation et Bio-conjugaison de Quantum Dots et des tests de toxicité bactériennes par la courbe de croissance et le comte Plate (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Découvrez la solubilisation et la bio-conjugaison de quantum dots CdTe avec des antibiotiques pour évaluer leurs effets antibactériens sous activation lumineuse. Cette méthode permet de développer de nouveaux agents antibactériens.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été financé par le programme de découverte individuelle du CRSNG, le CRSNG / IRSC Programme de recherche concertée sur la santé (PRCS), et le CRSNG CREATE Programme canadien de formation astrobiologie (CATP).

1. Solubilisation QD Il s&#39;agit d&#39;une méthode appropriée pour le CdTe. Des méthodes similaires peuvent être utilisés avec d&#39;autres types de boîtes quantiques tels que InP / ZnS 20 et CdSe / ZnS 21. <ol><li> Préparer une solution de BQs CdTe dans le toluène à 15 um (densité optique = 2,5 au sommet exciton en premier). </li><li> Transférer 200 ul de ce stock dans un flacon en verre. Ne pas utiliser de plastique! </li><li> Ajouter 800 ul du toluène, 1 mL de tampon de 200 mM de borate (pH 9) et 2 ul de 11,5 M d&#39;acide mercaptopropionique (MPA). </li><li> Boucher le flacon et agiter vigoureusement pendant 30-60 secondes. </li><li> Les phases aqueuses et solvants organiques se sépare spontanément. La phase aqueuse va devenir la couleur des points quantiques. Pour éviter la couche de toluène, le retirer et le jeter. Puis transférer la phase aqueuse dans un flacon propre. </li><li> Purifier les points quantiques solubilisées par lavage / filtrage quatre fois en utilisant un pl 500, 10000 filtre moléculaire centrifugeuse poids de coupure. Les filtres doivent êtrefilé à 3000 xg pendant 13 minutes. Pour au moins les deux dernières lavages, se laver avec le tampon final désiré. </li><li> Après le lavage final, de suspendre les boîtes quantiques lavées dans 50 mM tampon borate à pH désiré et conserver à 4 ° C. Ils seront stables pendant 1-2 semaines. </li><li> Mesurer des spectres d&#39;absorption et d&#39;émission pour estimer la concentration basée sur des formules publiées 22. </li></ol> Les résultats représentatifs: Figure 1 montre une image de points quantiques de CdTe sous un éclairage lampe UV, et les spectres d&#39;émission avant et après solubilisation de l&#39;eau, montrant un changement négligeable de l&#39;échange bouchon. Les valeurs de taille sont le diamètre du noyau mesurée par microscopie électronique. 2. Conjugaison QD antibiotiques Cette partie du protocole est applicable à tout chargé négativement l&#39;eau solubilisée nanoparticules, y compris les points quantiques les plus commerciaux, des particules métalliques, et plus 19. <ol><li> Toute molécule qui travaillera either auto-assemble les points quantiques de charge négative solubilisées, ou qui a un groupe réactif qui peut être conjugué, tel qu&#39;une amine primaire. Dans cet exemple, nous utilisons la polymyxine B (PMB), qui est chargée positivement et s&#39;auto-assemble sans avoir besoin de réactifs de conjugaison. Dissoudre le PMB en H 2 O à 60 uM. (Si l&#39;antibiotique choisi n&#39;est pas soluble dans l&#39;H 2 O, dissoudre dans du DMSO ou de l&#39;éthanol à une concentration de 0,1-1 mM). Ce sera une solution 10x (en H 2 O) ou une solution 100x (dans un solvant). </li><li> Calculer la quantité de solution QD vous aurez besoin pour les expériences de toxicité bactériennes. Pour une plaque de 96 puits avec 0,3 ml par puits dans quadruplicates, 0,5 mL de 200 nM conjugué est nécessaire. Préparer deux tubes contenant 100 pi de 1 uM points quantiques dans 50 mM tampon borate. </li><li> Si le couplage à une amine primaire, de préparer un mg 19 / ml (100 mM) solution de 1-éthyl-3-[3-diméthylaminopropyl] carbodiimide (EDC) dans H 2 O. EDC en solution n&#39;est pas stable; Utiliser immédiatement et jeter le reste. </li><li> Ajouter 50 ul de la solution 10x antibiotiques (en H 2 O) ou 5 ul de la solution 100x (dans un solvant) sur le tube de conjugué. Pour PMB: Conjugaison CdTe à un rapport molaire de 30:1, ajouter 50 ul de 60 uM PMB. Ajouter H 2 O ou de solvant pour le tube de contrôle ne QD. </li><li> Si nécessaire, ajoutez 1 ul de la solution mère d&#39;EDC sur le tube de conjugué. </li><li> Apportez le volume conjugué à 0,5 mL avec le tampon approprié (tampon borate ou de PBS; aucun tampons contenant des amines comme Tris, car ils inhibent EDC). </li><li> Tubes protéger de la lumière avec une feuille d&#39;aluminium, et le lieu ou sur un nutator rocker pendant 1 heure. Si l&#39;agrégation se produit, répétez la conjugaison avec des concentrations plus faibles d&#39;antibiotiques. Titrer vers le haut jusqu&#39;à ce que la concentration des particules ne s&#39;agrègent pas. </li><li> Laver les conjugués en passant par un filtre approprié. 10000 coupure de poids moléculaire fonctionne pour la plupart des antibiotiques, mais pas pour des protéines ou des anticorps. </li&gt; <li> En fonction de la molécule, différentes méthodes peuvent être utilisées pour estimer le nombre de molécules antibiotiques par QD: la spectroscopie d&#39;absorption ou de fluorescence, électrophorèse sur gel, ou spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR). </li></ol> Les résultats représentatifs. Dans cet exemple, la conjugaison PMB est caractérisée par des changements dans le spectre d&#39;émission QD. La figure 2 montre les spectres de BQs CdTe avec plus PMB. 3. Préparation de bactéries pour l&#39;écran de 96 puits; Détermination de la antibiotiques IC 50 Ceci est applicable à presque toute souche bactérienne cultivée dans le milieu approprié 18. La longueur exacte de temps les enregistrements devraient continuer dépend du taux de croissance bactérienne. Dans notre exemple, nous utilisons Escherichia coli cultivées dans un bouillon de lysogénie (LB). <ol><li> Afin de choisir les concentrations appropriées conjugués QD, il est important de connaître laIC 50 de l&#39;antibiotique à être conjugués et si les points quantiques à eux seuls sont toxiques. Cela devrait être commencé 2 jours avant l&#39;expérience de conjugaison. Dans la soirée, des semences de 10 mL de milieu de croissance bactérienne à partir d&#39;une colonie fraîche, en utilisant une technique stérile correcte et la biosécurité. </li><li> Le lendemain, 1-2 heures avant l&#39;expérience, de remplir chacun des puits d&#39;une claire-96 puits à fond plat avec une quantité presque-maximale de milieu de croissance. En utilisant une pipette multicanaux, des semences chaque puits avec 1-50 ul de la culture bactérienne (la concentration dépendra de la rapidité de la souche particulière se développe et devra être calibré par votre laboratoire). </li><li> Mettre la plaque sur le lecteur de plaque et le mettre à lire toutes les 10 minutes pendant 2 heures à une longueur d&#39;onde déterminée (généralement 600 nm). Surveiller la plaque de sorte que les bactéries ne se développent pas trop dense trop vite. </li><li> Lorsque les cellules atteignent tous les OD = 0,1 à 0,15, retirer la plaque du lecteur de plaque et arrêter l&#39;enregistrement. </li><li> Ajouter médicament seul et seul à points quantiquesdes concentrations différentes dans au moins triple. Utilisation d&#39;un côté de la plaque en tant que &quot;noir&quot; contrôle et une moitié d&#39;être éclairé. Un plan suggéré est donnée à la figure 3. Les concentrations doivent couvrir un éventail suffisamment large pour inclure une concentration qui inhibe les bactéries très peu, et celui qui les tue tous. </li><li> Protégez le côté &quot;obscur&quot; de la plaque avec une feuille d&#39;aluminium. Exposer l&#39;autre côté à une lampe à la longueur d&#39;onde désirée. Nous utilisons une coutume de 96 puits, 440-nm lampe fabriqué à partir de 2,4 mW LED (Figure 4) et irradient pendant 30-60 min. Les plaques noires avec des fonds clairs aider à protéger les bactéries non exposées de la lumière parasite. Une colonne vide peut également être utilisé entre les parties exposées et non-exposés. </li><li> Après exposition à la lumière, mettre la plaque dans le lecteur de plaque et l&#39;enregistrement DO 600 toutes les 10 minutes pour 5-12 heures selon le taux de croissance. Maintenir la température &lt;32 ° C si possible pour éviter le dessèchement des cultures. </li><li> Tracer des courbes de croissanceà un moment choisi en fonction de log [concentration] et de déterminer l&#39;IC 50 de l&#39;antibiotique en utilisant l&#39;équation de Hill: </li></ol><img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/3969/3969eq1.jpg" /> où H est le coefficient de Hill, y max est le point culminant de la croissance (idéalement sur ​​un plateau), et y min est le point zéro, idéalement sur ​​un plateau. Il est peu probable que les points quantiques à eux seuls montrent une toxicité beaucoup à des cellules aux concentrations utilisées, de sorte qu&#39;une valeur ne sera pas déterminé. Des résultats représentatifs. À la fin de la période d&#39;enregistrement, les puits clairs indiquent la mort cellulaire complète, et un gradient de densité cellulaire doit apparaître le long des concentrations croissantes de la drogue. Les bactéries doivent montrer les courbes de croissance en forme de S (Figure 5); l&#39;emplacement du plateau maximum varie grandement d&#39;une souche à autre et dépend également de la température. Un point de temps donné peut êtrechoisi comme représentant et les valeurs représentées vs Connexion [antibiotiques] pour donner le IC 50 (figure 5 B). Pour évaluer la toxicité QD, la survie vs Connexion [QD] peut également être tracées, mais la réalisation significative bactéricide avec QDs seul est rare (figure 5 C). 4. Préparation de bactéries pour l&#39;écran de 96 puits avec des antibiotiques ou points quantiques <ol><li> La veille de l&#39;expérience, 10 ml de graines de la culture à partir d&#39;une colonie fraîche dans le milieu approprié riche, en utilisant une technique stérile correcte et la biosécurité. Le conjugué QD-antibiotique doit être préparé à ce jour, à moins qu&#39;il est très instable. </li><li> 1-2 heures avant l&#39;essai, remplir chacun des puits d&#39;une claire-bas plaque à 96 puits avec une quantité pratiquement-maximale d&#39;un milieu de croissance. En utilisant une pipette multicanaux, des semences chaque puits avec 1-50 pl de culture bactérienne. </li><li> Mettre la plaque sur le lecteur de plaque et le mettre à lire toutes les 10 minutes pendant 2 heures à la même longueur d&#39;onde dans la partie 3.</li><li> Lorsque les cellules atteignent tous les OD = 0,1 à 0,15, retirer la plaque du lecteur de plaque et arrêter l&#39;enregistrement. </li><li> Ajouter conjugués QD à différentes concentrations dans au moins quatre exemplaires. Utilisation d&#39;un côté de la plaque en tant que &quot;noir&quot; contrôle et une moitié d&#39;être éclairé. Un plan suggéré est donnée à la figure 6. Une bande de contrôle de bactéries ne devraient toujours être inclus dans les problèmes de cas avec la culture, de la température, etc influer sur les conditions de croissance. Une seule bande de seul médicament et QD ne devrait également être inclus afin de s&#39;assurer qu&#39;elles correspondent à la plaque de contrôle fait précédemment. Le reste des puits sont consacrés à conjugués afin de permettre aux bonnes statistiques. </li><li> Protégez le côté &quot;obscur&quot; de la plaque avec une feuille d&#39;aluminium. Exposer l&#39;autre côté à une lampe à la longueur d&#39;onde désirée. </li><li> Après exposition à la lumière, mettre la plaque dans le lecteur de plaque et l&#39;enregistrement DO 600 toutes les 10 minutes pour 5-12 heures. Maintenir la température &lt;32 ° C si possible pour éviter drying des cultures. </li></ol> Des résultats représentatifs. La combinaison de boîtes quantiques et d&#39;antibiotiques peut être moins toxique que le seul antibiotique; également toxique, ou plus toxique. Ceci peut être quantifié à l&#39;aide des courbes de croissance et IC 50 mesures. La figure 7 montre un exemple de conjugués qui tout aussi toxique que seuls antibiotiques, et un exemple de conjugués qui sont plus toxiques. 5. Numération sur plaque <ol><li> Choisissez un ou plusieurs puits de la zone traitée plaque de 96 puits qui seront utilisés pour des dilutions en série et le comptage de colonies. </li><li> Faire une dilution en série de chacun des échantillons sélectionnés bactériennes avec une solution de PBS ou de solution saline (NaCl 0,9%). Transférer 20 pl de la solution bactérienne et la diluer avec 180 ul de solution saline, changer la pointe de la pipette, mélanger et transférer 20 ul de solution bactérienne diluée à 180 ul de solution saline. Répétez 6 fois. </li><li> Prenez 10 uL de chaque dilution et la plaque à une échelle appropriée<html> solide plaque de support. Tous les 8 concentrations d&#39;un échantillon peut être étalées sur un 10 cm de Petri plat rond, bien plats rectangulaires sont préférés car il est plus facile d&#39;aligner les choses. </li><li> Laissez sécher sur le banc pendant 15 min. puis incuber à la température appropriée pour vos bactéries pendant 16 heures. </li><li> Compter les colonies et calculer des unités formant colonie (UFC) en fonction de (nombre de colonies x facteur de dilution) / volume plaqué = CFU / ml. </li></ol> La figure 8 montre une plaque UFC par exemple. 6. Les résultats représentatifs <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig1.jpg" /> Figure 1. QDs CdTe. (A) Huit préparations de points quantiques de CdTe illuminé avec une baguette UV (365 nm). (B) des spectres d&#39;absorption et d&#39;émission de cinq tailles sélectionnées avant et après l&#39;eau-de solubilisation. Les lignes en pointillés sont des spectres dans le toluène, les lignes pleines sont dans l&#39;eau. files/ftp_upload/3969/3969fig2.jpg &quot;/&gt; Figure 2. L&#39;analyse spectrale et le gel des QD-PMB conjugués. QDs CdTe Orange-électroluminescentes ont été utilisés pour cet exemple, les effets sur d&#39;autres types de boîtes quantiques devront être évalués pour chaque expérience. (A) d&#39;absorbance typique (ligne grise) et les spectres d&#39;émission (ligne noire) des boîtes quantiques avant la conjugaison de PMB et l&#39;émission (ligne pointillée) après l&#39;addition de 160 équivalents molaires de PMB. (B) Relation entre le rapport de PMB et l&#39;intensité des émissions QD (carrés) et le pic de longueur d&#39;onde de localisation (triangles). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig3.jpg" /> Figure 3. Suggérée disposition de la plaque pour plaque de croissance de contrôle. Une large gamme de concentrations de PMB et QD est représenté. Une moitié de la plaque est irradiée (surlignée en bleu), et une moitié identique est protégé de la lumière. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici</a>pour agrandir la figure. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig4.jpg" /> Figure 4. Personnalisée 96-lampe LED pour l&#39;irradiation plaque uniforme, montrant l&#39;aspect hors et sous tension. Un type à main lampe UV peut également être utilisé, mais ne couvrira pas la totalité de la plaque uniformément. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig5.jpg" /> Figure 5. Exemples de résultats pour la plaque de croissance de contrôle. (A) représentant les courbes de croissance bactérienne avec différentes concentrations en médicament, de 0 à compléter la mort cellulaire. Les symboles ouverts sont PMB seulement avec des concentrations donnée, les symboles pleins sont CdTe-PMB sans irradiation, et les symboles sont remplis de demi-CdTe-PMB avec l&#39;irradiation. L&#39;irradiation n&#39;a eu aucun effet sur les échantillons PMB-seulement, de sorte que ces courbes ont été omis pour plus de clarté. Tous les conjugués PMB-CdTe sont 30:1 PMB: ratios QD. (B) Parcelles de valeurs de la courbe de croissance à 200 min vs Connexion [PMB] et s&#39;inscrit à l&#39;équation. (1). Pour control pour les effets de la lumière, une courbe se fait avec des antibiotiques seulement avec 30 min d&#39;exposition de la lumière. (C) la survie bactérienne à 200 min vs concentration QD, en utilisant les points quantiques de CdTe. Certains toxicité est observée avec exposition à la lumière, mais trop peu pour déterminer une valeur IC 50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig5large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig6.jpg" /> Figure 6. Disposition suggérée pour plaque d&#39;essai conjugué. La moitié bleu en surbrillance de la plaque doit être exposée à la lumière, et la moitié unhighlighted est protégé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig6large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig7.jpg" /> Figure 7. Exemple de résultats pour plaque d&#39;essai conjugué. Valeurs de la courbe de croissance à 200 min étaient plotted et en forme à l&#39;équation. (1). (A) CdTe-PMB conjugués présentent une augmentation de la toxicité sur PMB seul. (B) or nanoparticules Au-PMB conjugués ne montrent aucune augmentation de la toxicité sur PMB seul. <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig8.jpg" /> Figure 8. Exemple d&#39;une plaque UFC. E. coli ensemencées dans une plaque de 96 puits a été traitée avec QD-PMB avec ou sans irradiation pendant 30 min. ensuite incubées à 32 ° C pendant 4 heures. Des dilutions en série de chaque échantillon bactérien ont été faites avec une solution saline, et 10 uL de 100 X 10 X 7 dilutions ont été étalées sur des plaques de gélose. Les plaques ont été incubées à 37 ° C et les colonies ont été comptées après 16 heures. La plaque montre les dilutions le long des lignes comme indiqué; les colonnes sont les suivants: (A) 0,06 uM PMB + 2 nM CdTe, (B) 0,12 uM PMB + 4 nM CdTe (C) 0,2 uM PMB + 6,7 nM CdTe, (D) 0,06 uM PMB + 2 nM CdTe irradiés, (E) 0,12 uM PMB + 4 nM CdTe irradiés, (F) 0,2 uM PMB + 6,7 nM CdTe irrairradiées.

<ol><li>Michalet, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dots+for+live+cells%2C+in+vivo+imaging%2C+and+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics.</a> Science. 307, 538-544 (2005).</li>
<li>Jamieson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+applications+of+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biological applications of quantum dots.</a> Biomaterials. 28, 4717-4732 (2007).</li>
<li>Asokan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+heat+transfer+fluids+in+the+synthesis+of+high-quality+CdSe+quantum+dots%2C+core%2Fshell+quantum+dots%2C+and+quantum+rods%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">The use of heat transfer fluids in the synthesis of high-quality CdSe quantum dots, core/shell quantum dots, and quantum rods.</a> Nanotechnology. 16, 2000-2011 (2005).</li>
<li>Chan, W. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescent+quantum+dots+for+multiplexed+biological+detection+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Luminescent quantum dots for multiplexed biological detection and imaging.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 13, 40-46 (2002).</li>
<li>Chan, W. C. W., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot+bioconjugates+for+ultrasensitive+nonisotopic+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection.</a> Science. 281, 2016-2018 (1998).</li>
<li>Biju, V., Itoh, T., Ishikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivering+quantum+dots+to+cells%3A+bioconjugated+quantum+dots+for+targeted+and+nonspecific+extracellular+and+intracellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Delivering quantum dots to cells: bioconjugated quantum dots for targeted and nonspecific extracellular and intracellular imaging.</a> Chem. Soc. Rev. 39, 3031-3056 (2010).</li>
<li>Boucher, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bad++bugs%2C+no+drugs%3A+no+ESKAPE%21+An+update+from+the+Infectious+Diseases+Society+of+America%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America.</a> Clin. Infect. Dis. 48, 1-12 (2009).</li>
<li>Morones, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bactericidal+effect+of+silver+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">The bactericidal effect of silver nanoparticles.</a> Nanotechnology. 16, 2346-2353 (2005).</li>
<li>Mitoraj, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visible+light+inactivation+of+bacteria+and+fungi+by+modified+titanium+dioxide%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+%26+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Visible light inactivation of bacteria and fungi by modified titanium dioxide.</a> Photochemical & Photobiological Sciences. 6, 642-648 (2007).</li>
<li>Fu, G., Vary, P. S., Lin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatase+TiO2+nanocomposites+for+antimicrobial+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Anatase TiO2 nanocomposites for antimicrobial coatings.</a> J. Phys. Chem. B. 109, 8889-8898 (2005).</li>
<li>Chung, C. J., Lin, H. I., Tsou, H. K., Shi, Z. Y., He, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antimicrobial+TiO2+coating+for+reducing+hospital-acquired+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+B.+Appl.+Biomater%22%5BJournal%5D)">An antimicrobial TiO2 coating for reducing hospital-acquired infection.</a> J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 85, 220-224 (2008).</li>
<li>Nair, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+size+scale+of+ZnO+nanoparticles+and+microparticles+on+toxicity+toward+bacteria+and+osteoblast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci.+Mater.+Med%22%5BJournal%5D)">Role of size scale of ZnO nanoparticles and microparticles on toxicity toward bacteria and osteoblast cancer cells.</a> J. Mater. Sci. Mater. Med. 20, Suppl . 1. S235-S241 (2009).</li>
<li>Heinlaan, M., Ivask, A., Blinova, I., Dubourguier, H. C., Kahru, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+nanosized+and+bulk+ZnO%2C+CuO+and+TiO2+to+bacteria+Vibrio+fischeri+and+crustaceans+Daphnia+magna+and+Thamnocephalus+platyurus%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Toxicity of nanosized and bulk ZnO, CuO and TiO2 to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and Thamnocephalus platyurus.</a> Chemosphere. 71, 1308-1316 (2008).</li>
<li>Rincon, A. G., Pulgarin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+coaxial+photocatalytic+reactor+%28CAPHORE%29+in+the+TiO2+photo-assisted+treatment+of+mixed+Escherichia+coli+and+Bacillus+subtilis+and+the+bacterial+community+present+in+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Catal.+Today%22%5BJournal%5D)">Use of coaxial photocatalytic reactor (CAPHORE) in the TiO2 photo-assisted treatment of mixed Escherichia coli and Bacillus subtilis and the bacterial community present in wastewater.</a> Catal. Today. 101, 331-344 (2005).</li>
<li>Neal, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+can+be+inferred+from+bacterium-nanoparticle+interactions+about+the+potential+consequences+of+environmental+exposure+to+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">What can be inferred from bacterium-nanoparticle interactions about the potential consequences of environmental exposure to nanoparticles.</a> Ecotoxicology. 17, 362-371 (2008).</li>
<li>Kovochich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+toxicity+of+C60+aggregates+toward+mammalian+cells%3A+role+of+tetrahydrofuran+%28THF%29+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Comparative toxicity of C60 aggregates toward mammalian cells: role of tetrahydrofuran (THF) decomposition.</a> Environ. Sci. Technol. 43, 6378-6384 (2009).</li>
<li>Hoshino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+properties+and+cellular+toxicity+of+nanocrystal+quantum+dots+depend+on+their+surface+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Physicochemical properties and cellular toxicity of nanocrystal quantum dots depend on their surface modification.</a> Nano Letters. 4, 2163-2169 (2004).</li>
<li>Dumas, E. M., Ozenne, V., Mielke, R. E., Nadeau, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+CdTe+Quantum+Dots+in+Bacterial+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+NanoBiosci%22%5BJournal%5D)">Toxicity of CdTe Quantum Dots in Bacterial Strains.</a> IEEE Trans. NanoBiosci. 8, 58-64 (2009).</li>
<li>Park, S., Chibli, H., Wong, J., Nadeau, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+activity+and+cellular+toxicity+of+nanoparticle-polymyxin+B+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial activity and cellular toxicity of nanoparticle-polymyxin B conjugates.</a> Nanotechnology. 22, 185101(2011).</li>
<li>Cooper, D. R., Dimitrijevic, N. M., Nadeau, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosensitization+of+CdSe%2FZnS+QDs+and+reliability+of+assays+for+reactive+oxygen+species+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Photosensitization of CdSe/ZnS QDs and reliability of assays for reactive oxygen species production.</a> Nanoscale. 2, 114-121 (2010).</li>
<li>Pong, B. K., Trout, B. L., Lee, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+ligand-exchange+for+efficient+solubilization+of+CdSe%2FZnS+quantum+dots+in+water%3A+A+procedure+guided+by+computational+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Modified ligand-exchange for efficient solubilization of CdSe/ZnS quantum dots in water: A procedure guided by computational studies.</a> Langmuir. 24, 5270-5276 (2008).</li>
<li>Narayanaswamy, A., Feiner, L. F., Meijerink, A., Zaag, P. J. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+temperature+and+dot+size+on+the+spectral+properties+of+colloidal+InP%2FZnS+core-shell+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Nano%22%5BJournal%5D)">The effect of temperature and dot size on the spectral properties of colloidal InP/ZnS core-shell quantum dots.</a> Acs Nano. 3, 2539-2546 (2009).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Les nanoparticules représentent une approche prometteuse pour la création de nouveaux agents anti-microbiens. Analyse de la courbe de croissance est un moyen de contrôler la densité des cellules bactériennes qui distingue les cellules activement croissantes de-croissance des cellules inhibées. Lorsque couplée avec un nombre de plaques, il permet une analyse approfondie du potentiel antibiotique d&#39;un conjugué. Le format de 96 puits permet des variations relativement à haut débit de concentration et d&#39;autres condi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Le numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Borate composant tampon n ° 1 </td><td> Pêcheur </td><td> L&#39;acide borique A-74-1 </td><td></td></tr><tr><td> Borate composant tampon n ° 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B9876 tétraborate de sodium </td><td></td></tr><tr><td> MPA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5801 </td><td></td></tr><tr><td> Vivaspin 500 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9322 </td><td> Divers MWCO disponibles </td></tr><tr><td> Flacons en verre </td><td> Pêcheur </td><td> 03-338C </td><td></td></tr><tr><td> EDC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E6383 </td><td></td></tr><tr><td> Polymyxine B </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1004 </td><td></td></tr><tr><td> Gr bactérienneoissance milieu (LB) Composante n ° 1 </td><td> Pêcheur </td><td> NaCl S271 </td><td></td></tr><tr><td> Milieu de croissance bactérienne (LB) Composante n ° 2 </td><td> BD </td><td> Tryptone 211705 </td><td></td></tr><tr><td> Milieu de croissance bactérienne (LB) Composante n ° 3 </td><td> BD </td><td> 211929 Extrait de levure </td><td></td></tr><tr><td> Lampe pour exposition à la lumière </td><td> Coutume </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Clear-fond plaques à 96 puits </td><td> Pêcheur </td><td> 07-200-567 ou 07-200-730 </td><td></td></tr><tr><td> Spectromètre à fluorescence </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lecteur de plaque d&#39;absorbance </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr><tr><td> BactoAgar pour les milieux solides </td><td> Bioshop </td><td> AGR001.1 </td><td></td></tr><tr><td> Des boîtes de Pétri autour </td><td> Pêcheur </td><td> 08-75-12 </td><td></td></tr><tr><td> Des boîtes de Pétri rectangulaires </td><td> Pêcheur </td><td> 08-757-11A </td><td></td></tr></tbody></table>

solubilisation et bio-conjugaison de quantum dots et des tests de toxicité bactériennes par la courbe de croissance et le comte plate

Solubilization and Bio-conjugation of Quantum Dots and Bacterial Toxicity Assays by Growth Curve and Plate Count

Boîtes quantiques (QDS) sont des nanoparticules semi-conductrices fluorescentes dont la taille dépend de spectres d&#39;émission pouvant être excités par un choix large de longueurs d&#39;onde. QDs ont attiré beaucoup d&#39;intérêt pour l&#39;imagerie, le diagnostic et la thérapie en raison de leur brillante, la fluorescence stable 1,2 3,4,5. BQs peut être conjugué à une variété de molécules bio-actives pour se lier à des bactéries et des cellules mammaliennes 6. Les points quantiques sont également largement étudiée comme agents cytotoxiques pour assassinat ciblé des bactéries. L&#39;émergence de multiplier les souches bactériennes résistantes aux devient rapidement une crise de santé publique, en particulier dans le cas de germes à Gram négatif 7. En raison de l&#39;effet bien connu antimicrobienne de certains nanomatériaux, en particulier Ag, il ya des centaines d&#39;études portant sur ​​la toxicité des nanoparticules à des bactéries 8. Des études bactériennes ont été effectuées avec d&#39;autres types de nanoparticules semi-conductrices ainsi, spécially TiO 2 9,10-11, mais aussi de ZnO 12 et autres, y compris CuO 13. Quelques comparaisons de souches bactériennes ont été effectuées dans ces études, généralement comparant une souche à Gram négatif avec un Gram positif. Avec toutes ces particules, les mécanismes de toxicité sont attribués à l&#39;oxydation: soit l&#39;photogénération d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) par les particules ou le rejet direct d&#39;ions métalliques qui peuvent causer la toxicité oxydative. Même avec ces matériaux, les résultats des différentes études varient considérablement. Dans certaines études, la souche d&#39;essai à Gram positif est censément plus sensible que les 10 à Gram négatif, dans d&#39;autres c&#39;est le 14 en regard. Ces études ont été étudiées en 15. Dans toutes les études de nanoparticules, la composition des particules, la taille, la chimie de surface, l&#39;échantillon vieillissement / ventilation, et de longueur d&#39;onde, la puissance et la durée d&#39;exposition de lumière peuvent tous affecter les résultats de façon spectaculaire. En outre, SYNTHESIsous-produits s et les solvants doivent être considérées 16 17. Techniques de criblage à haut débit sont nécessaires pour être en mesure de développer des agents efficaces de la nanomédecine nouvelles. QDs CdTe ont effets anti-microbiens seuls 18 ou en combinaison avec des antibiotiques. Dans une étude précédente, nous avons montré que le couplage d&#39;antibiotiques pour CdTe peut augmenter la toxicité pour les bactéries, mais de diminuer la toxicité pour les cellules de mammifères, en raison de la production a diminué d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène à partir des conjugués 19. Bien qu&#39;il soit peu probable que le cadmium composés contenant sera approuvé pour utilisation chez les humains, ces préparations peuvent être utilisées pour la désinfection des surfaces ou la stérilisation de l&#39;eau. Dans ce protocole, nous donnons une approche simple pour solubiliser les points quantiques de CdTe avec de l&#39;acide mercaptopropionique (MPA). Les points quantiques sont prêts à utiliser moins d&#39;une heure. Nous démontrons ensuite le couplage à un agent antimicrobien. La deuxième partie du protocoledémontre un test d&#39;inhibition de 96 puits en utilisant des bactéries les boîtes quantiques conjugués et non conjugués. La densité optique est lue pendant plusieurs heures, permettant aux effets de l&#39;ajout QD et exposition à la lumière d&#39;être évalués immédiatement ainsi que, après une période de récupération. Nous présentons aussi un comptage des colonies pour quantifier la survie des bactéries.

Les nanoparticules telles que les points quantiques à semi-conducteurs (QDS) peut être utilisé pour créer des agents photo-activables pour les applications anti-microbiens ou anti-cancer. Cette technique montre comment l&#39;eau solubiliser en tellurure de cadmium (CdTe) QDs, les conjuguer à un antibiotique, et d&#39;effectuer un test d&#39;inhibition bactérienne basée sur les courbes de croissance et numération sur plaque.

Solubilisation et Bio-conjugaison de Quantum Dots et des tests de toxicité bactériennes par la courbe de croissance et le comte Plate

Les points quantiques (QD) sont des nanoparticules semi-conductrices fluorescentes dont les spectres d'émission dépendent de leur taille et qui peuvent être excitées par un large choix de longueurs d'onde. ...

L'objectif général de cette procédure est de réaliser un criblage à haut débit des effets antibactériens de nanoparticules, conjuguées ou non à des antibiotiques. Ici, les effets antibactériens de poly mix et B, des points quantiques au tellurure de cadmium conjugués, sont testés pour atteindre cet objectif. Les points quantiques sont d'abord solubilisés dans l'acide mercapto propionique.Ensuite, les points quantiques sont conjugués au poly mix et au B ; les bactéries ensemencées avec des antibiotiques sont alors traitées à la fois par des points quantiques conjugués et non conjugués à l'antibiotique, et la moitié des échantillons est soumise à une irradiation par une lumière bleue de 440 nanomètres pendant 30 minutes, ce qui induit la formation d'excitons et d'espèces réactives de l'oxygène afin d'évaluer l'effet des traitements par points quantiques sur la croissance bactérienne et la survie. Des mesures de densité optique sont effectuées et des dénombrements de colonies sont réalisés. Les données obtenues indiquent que l'application de points quantiques au cadmium tellurure conjugués à un antibiotique, suivie d'une irradiation, produit les effets bactéricides les plus importants

solubilization-bio-conjugation-quantum-dots-bacterial-toxicity-assays

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Cette vidéo démontre la détection bactérienne quantitative multiplexée à l’aide de microsphères de polystyrène magnétique carboxylé teintes en ensembles distincts. La procédure comprend la formation de complexes billes et bactéries, la séparation magnétique et l’analyse en flux, permettant une quantification précise et simultanée de plusieurs bactéries dans le même puits de réaction.

Détection quantitative de bactéries multiplexées à l’aide de microsphères magnétiques marquées à un colorant

Un protocole pour la quantification et la comparaison simultanées de trois composants cellulaires et extracellulaires dans des biofilms est présenté. La méthodologie implique l’utilisation d’une microscopie confocale à balayage laser, d’un logiciel d’analyse structurelle et de visualisation de biofilm et d’un logiciel d’analyse statistique.

Quantification simultanée de cellulaire et extracellulaire Composants des biofilms

Les bactéries peuvent accumuler des mutations néfastes ou bénéfiques au cours de leur vie. Dans une population de cellules, les individus qui ont accumulé des mutations bénéfiques peuvent rapidement surpasser leurs semblables. Ici, nous présentons une procédure simple pour visualiser la compétition intraspécifique dans une population de cellules bactériennes au fil du temps en utilisant des individus marqués par fluorescence.

Surveillance de la compétition intraspécifique dans une population de cellules bactériennes par cocultivation de souches marquées par fluorescence

Nous fournissons des instructions détaillées pour la préparation de points quantiques ciblés monovalents (mQD) à partir d’ADN phosphorothioate de longueur définie. L’emballage de l’ADN se produit à haut rendement et, par conséquent, les produits ne nécessitent pas de purification. Nous démontrons l’utilisation de l’étiquette SNAP pour cibler les mQD sur les récepteurs de surface cellulaire pour les applications d’imagerie de cellules vivantes.

La production et le ciblage des monovalent Quantum Dots

Les infections à biofilm montrent une tolérance élevée à la chimiothérapie. Aucun test unique ne permet de saisir la complexité des biofilms. Au lieu de cela, des tests complémentaires sont nécessaires. Nous présentons une plateforme de criblage (développée pour S. aureus) qui combine des tests de viabilité, de biomasse et de matrice de biofilm. Il permet la découverte de médicaments anti-biofilm, y compris l’évaluation des effets chimiothérapeutiques à long terme.

Une plate-forme de dosages anti-biofilm Adaptés à l&#39;exploration des bibliothèques de composés naturels

Un test en temps réel à haut débit a été mis au point pour identifier simultanément (1) les antimicrobiens à pénétration de cellules eucaryotes ciblant un pathogène bactérien intracellulaire, et (2) évaluer la cytotoxicité des cellules eucaryotes. Une variante de la même technologie a ensuite été combinée à la technologie de distribution numérique pour permettre des études faciles, à haute résolution, dose-réponse et en synergie bidimensionnelle et tridimensionnelle.

High Throughput, en temps réel, à double lecture Test de intracellulaires activité antimicrobienne et eucaryotes cytotoxicité cellulaire

Un simple test ATP-instruments de mesure et vivre/morts méthode de coloration ont été utilisés pour quantifier et visualiser les Neisseria gonorrhoeae survie après traitement par ceftriaxone. Ce protocole peut être étendu pour examiner les effets antimicrobiens de n’importe quel antibiotique et peut être utilisé pour définir la concentration minimale inhibitrice d’antibiotiques dans les biofilms bactériens.

Examen quantitatif de la sensibilité aux antibiotiques d’essais commerciaux de Neisseria gonorrhoeae utilisation d’ATP à l’aide de granulats et de Live/Dead coloration

Les antibiotiques étiquetés fluorescents sont des outils puissants qui peuvent être utilisés pour étudier de multiples aspects de la résistance aux antimicrobiens. Cet article décrit la préparation des antibiotiques fluorescents marqués et leur application à l’étude de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries. Les sondes peuvent être utilisées pour étudier les mécanismes de résistance bactérienne (p. ex., efflux) par spectrophotométrie, cytométrie du débit et microscopie.

Visualisation de la résistance bactérienne à l’aide de sondes antibiotiques fluorescentes

Ce manuscrit décrit une méthode d’utilisation de la microscopie à fluorescence unicellulaire pour visualiser et quantifier la compétition bactérienne en coculture.

Quantification de la concurrence interbactérienne à l’aide de l’imagerie par fluorescence unicellulaire

Ici, nous présentons un protocole pour évaluer l’efficacité antibactérienne d’un polymère à élution d’antibiotique afin de simuler une application clinique prophylactique en utilisant un test de viabilité microbienne luminescente en temps réel disponible dans le commerce. Cette méthode permet de surveiller l’activité longitudinale des matériaux à élution de médicaments et peut être largement adaptée pour tester les plateformes d’administration de médicaments antimicrobiens.

Une nouvelle méthode pour déterminer l’activité antibactérienne longitudinale de matériaux à élution médicamenteuse

Ce protocole fournit un cadre systématique pour évaluer comment les phytochimiques peuvent renforcer les effets bactéricides des biocides traditionnels en utilisant la modélisation de l’activité bactéricide et des tests d’interaction combinatoire, qui visent à identifier des mélanges synergiques améliorant le contrôle microbien et réduisant l’utilisation globale de biocides.

In Vitro Évaluation des effets potenciatrics des molécules d’origine végétale sur les biocides conventionnels

Découvrez la solubilisation et la bio-conjugaison de quantum dots CdTe avec des antibiotiques pour évaluer leurs effets antibactériens sous activation lumineuse. Cette méthode permet de développer de nouveaux agents antibactériens.

Solubilisation et Bio-conjugaison de Quantum Dots et des tests de toxicité bactériennes par la courbe de croissance et le comte Plate (Vidéo) | JoVE Journal

Solubilisation et Bio-conjugaison de Quantum Dots et des tests de toxicité bactériennes par la courbe de croissance et le comte Plate

Explorer plus de vidéos