Solubilisation et Bio-conjugaison de Quantum Dots et des tests de toxicité bactériennes par la courbe de croissance et le comte Plate

L'objectif général de cette procédure est de réaliser un criblage à haut débit des effets antibactériens de nanoparticules, conjuguées ou non à des antibiotiques. Ici, les effets antibactériens de poly mix et B, des points quantiques au tellurure de cadmium conjugués, sont testés pour atteindre cet objectif. Les points quantiques sont d'abord solubilisés dans l'acide mercapto propionique.

Ensuite, les points quantiques sont conjugués au poly mix et au B ; les bactéries ensemencées avec des antibiotiques sont alors traitées à la fois par des points quantiques conjugués et non conjugués à l'antibiotique, et la moitié des échantillons sont soumis à une irradiation par une lumière bleue de 440 nanomètres pendant 30 minutes, ce qui induit la génération d'excitons et d'espèces réactives de l'oxygène afin d'évaluer l'effet des traitements par points quantiques sur la croissance bactérienne et la survie. Des mesures de densité optique sont effectuées et des dénombrements de colonies sont réalisés. Les données obtenues indiquent que l'application de points quantiques en tellurure de cadmium conjugués à un antibiotique, suivie d'une irradiation, produit les effets bactéricides les plus importants parmi les conditions testées.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'effet des points quantiques de tellurure de cadmium et de leur conjuguaison au polyx B sur la croissance d'Escherichia coli, elle peut également être appliquée à d'autres types de nanoparticules et d'antibiotiques sur diverses souches bactériennes. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car tout excès de MPA provoquera l'agrégation des points quantiques, et si elles prélèvent la toline même en petite quantité, elles détruiront le filtre.

Bien que nous allions aujourd'hui démontrer une méthode permettant d'évaluer les effets antibactériens de points quantiques KE IDE conjugués à un antibiotique, une méthode similaire pourrait être utilisée avec d'autres types de points quantiques, tels que le phosphure d'indium, le sulfate de zinc et le sulfure de cadmium sulfate de zinc. Commencez cette procédure en préparant une solution de points quantiques de tellurure de cadmium ou points quantiques CdTe dans le toluène à 15 micromolaire dans un flacon en verre, mesurez la densité optique ou DO par spectroscopie d'absorption en transférant à l'aide d'une pipette 200 microlitres de cette solution mère dans une cuve en verre.

Ne pas utiliser de plastique. Ajouter ensuite 800 microlitres de toluène, un millilitre de tampon borate 200 millimolaire et deux microlitres d'acide mercaptoproprionique à 11,5 molaire ou MPA, boucher le flacon et agiter vigoureusement pendant 30 à 60 secondes. Après agitation, les phases solvantes aqueuse et organique se séparent spontanément.

La phase aqueuse prendra la couleur des points quantiques. Pour éviter la couche de tuilage, retirez-la, puis prélève la phase des points quantiques et transférez-la dans un flacon propre. Pour purifier les points quantiques solubilisés, transférez-les dans un filtre centrifuge de 500 microlitres.

Ajouter 100 microlitres de tampon bore huit 50 millimolaire et centrifuger à 3000 ×g pendant 13 minutes. Effectuer ce lavage quatre fois après le dernier lavage. Suspendre les points quantiques lavés dans 500 microlitres de tampon bore et conserver à quatre degrés Celsius.

Ils seront stables pendant une à deux semaines. Pour estimer la concentration des points quantiques, mesurez les spectres d'absorbance et d'émission. Cette figure montre des points quantiques de CdTe sous éclairage par lampe UV et les spectres d'émission avant et après solubilisation dans l'eau, mettant en évidence un changement négligeable des propriétés optiques suite à l'échange de ligands.

Cette partie du protocole s'applique à toute nanoparticule chargée négativement et sensibilisée à l'eau, y compris la mousse, les points quantiques commerciaux, les particules métalliques et d'autres encore. Dans cet exemple, l'antibiotique polymyxine B ou PMB sera conjugué aux points quantiques à un ratio molaire de 30 pour 1. La PMB est chargée positivement et s'assemble spontanément sans nécessiter de conjugaison. Réactifs : dissoudre la PMB dans l'eau.

À 60 micromolaire. Pour une plaque de 96 puits avec 0,3 millilitre de bactéries par puits en quadruple duplicat. 0,5 millilitre de conjugué à 200 nanomolaires est suffisant pour préparer ceci à 100 microlitres de points quantiques à un micromolaire dans un tampon borate à 50 millimolaires dans un tube micro-centrifuge.

Ensuite, ajoutez 50 microlitres de la solution d'antibiotique PMB 10 x ou 60 micromolaire dans l'eau dans le tube contenant le conjugué. Ajoutez 50 microlitres d'eau dans le tube témoin. Complétez le volume à 0,5 millilitre avec du tampon 50 millimolaire, protégez les tubes de la lumière à l'aide de papier d'aluminium et placez-les sur un agitateur rotatif pendant une heure.

Si une agrégation se produit, répétez la conjugaison avec des concentrations plus faibles d'antibiotique. Titrer progressivement la concentration jusqu'à ce que les particules n'agrègent plus, afin de laver les conjugués. Verser les solutions à travers un filtre avec une coupure de poids moléculaire de 10 000, ce qui convient à la plupart des antibiotiques, mais pas aux protéines ou aux anticorps.

Enfin, estimez le nombre de molécules d'antibiotique par point quantique par spectroscopie d'absorbance ou de fluorescence, par électrophorèse sur gel ou par spectroscopie infrarouge transformée de Fourier. Cette figure montre les spectres typiques d'absorbance et d'émission des points quantiques avant la conjugaison avec PMB, ainsi que l'émission après l'ajout de 160 équivalents molaire de PMB.

La relation entre le rapport de la PMB et l'intensité d'émission des points quantiques indiquée par les carrés et la position de la longueur d'onde du pic indiquée par les triangles est montrée ici. Lorsque la concentration de PMB augmente, l'intensité d'émission des points quantiques diminue, entraînant un décalage de la longueur d'onde d'émission maximale. La prochaine étape du protocole est réalisée afin de déterminer la concentration inhibitrice demi-maximale ou IC 50 de l'antibiotique et de la toxicité des points quantiques le soir, deux jours avant l'expérience de conjugaison.

Ensemencer 10 millilitres de milieu LB à partir d'une colonie fraîche d'E. coli. Le lendemain, une à deux heures avant l'expérience, remplir chaque puits d'une plaque claire de 96 puits avec le milieu de croissance. La plaque d'essai doit être organisée comme indiqué ici.

Les échantillons doivent être ensemencés par triplicata et les concentrations d'antibiotiques doivent couvrir un intervalle suffisamment large pour inclure une concentration qui inhibe très peu les bactéries et une autre qui les tue complètement. Des puits contenant des points quantiques aux concentrations utilisées dans les expériences de conjugués doivent également être inclus par triplicata. À l’aide d’une pipette multipuits, ajouter dans les puits appropriés de 1 à 50 microlitres de culture bactérienne.

La concentration dépendra de la vitesse de croissance de la souche particulière et devra être calibrée en conséquence. Pour surveiller la croissance, placez la plaque dans un lecteur de plaques et configurez-le pour effectuer une lecture toutes les 10 minutes pendant deux heures à 600 nanomètres. Lorsque les cellules atteignent toutes une DO de 0,1 à 0,15, retirez la plaque du lecteur de plaques et arrêtez l'enregistrement.

Ensuite, ajoutez les points quantiques PMB dans les puits appropriés et recouvrez en triple la moitié de la plaque avec du papier d'aluminium. Puis placez la plaque sous une lampe personnalisée de 440 nanomètres constituée de LED de 2,4 milliwatts pendant 30 minutes afin d'exposer le côté éclairé de la plaque. Après l'exposition à la lumière, placez la plaque dans le lecteur de plaque et enregistrez l'OD à 600 nm toutes les 10 minutes pendant cinq à douze heures, selon la vitesse de croissance. Maintenez la température inférieure à 32 degrés Celsius si possible, afin d'éviter l'évaporation des cultures, à l'aide d'un logiciel.

Tracez les courbes de croissance à un point temporel sélectionné en fonction de la concentration logarithmique et déterminez la CI50 de l'antibiotique à l'aide de l'équation de Hill affichée à l'écran, où H est le coefficient de Hill, Ymax le point maximal de croissance et Ymin le point zéro, idéalement situé sur un plateau. À la fin de la période d'enregistrement, les puits clairs indiqueront une mort cellulaire complète et un gradient de densité cellulaire devrait apparaître en fonction de l'augmentation des concentrations du médicament.

Les bactéries doivent présenter des courbes de croissance en forme de S, comme illustré ici. La position du plateau maximal varie considérablement d'une souche à l'autre et dépend également de la température. Un point temporel donné peut être choisi comme représentatif, et les valeurs sont alors tracées en fonction du logarithme de l'antibiotique afin d'obtenir la CI50 pour évaluer les points quantiques.

La survie en fonction de la toxicité par rapport au logarithme de la concentration des points quantiques peut également être tracée, mais il est rare d'obtenir une élimination bactérienne significative avec uniquement les points quantiques à la concentration utilisée. Une fois la toxicité des points quantiques et des antibiotiques seuls déterminée, le même protocole peut être appliqué pour évaluer la toxicité de l'antibiotique. Points quantiques conjugués illustrés.

Voici un exemple de disposition pour le test. Notez que les conjugués sont testés à des concentrations croissantes en quadruplé, et qu'une bande témoin contenant uniquement des bactéries, une bande témoin contenant uniquement le médicament, ainsi que des puits d'échantillons contenant uniquement les points quantiques doivent être inclus. Les mesures d'OD à 600 nm peuvent ensuite être utilisées pour générer des courbes de croissance, et les valeurs d'IC50 sont déterminées comme précédemment.

Cette figure montre un exemple de conjugués aussi toxiques que l'antibiotique seul, ainsi qu'un exemple de conjugués plus toxiques. Pour déterminer le nombre d'unités formant des colonies (UFC) pour chaque condition, sélectionnez un ou plusieurs puits de la plaque 96 puits traitée afin d'effectuer des dénombrements par ensemencement en surface. Réalisez une dilution en série de chacun des échantillons bactériens sélectionnés à l'aide d'une solution saline.

Pipetez 180 microlitres de solution saline dans les colonnes appropriées. Transférez 20 microlitres de la solution bactérienne et diluez-les avec 180 microlitres de solution saline. Changez la pointe de pipette, mélangez et transférez 20 microlitres de la solution bactérienne diluée dans 180 microlitres de solution saline.

Répétez ce processus six fois. Ensuite, prélevez 10 microlitres chacun des six derniers dilués et déposez-les en points sur une plaque rectangulaire contenant de l'agar. 36 points peuvent être déposés sur une plaque rectangulaire.

Laisser sécher la plaque pendant 15 minutes sur la paillasse ; après 15 minutes, incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 16 heures suivant l'incubation. Compter les colonies pour déterminer les unités formant des colonies par millilitre. Multiplier le nombre de colonies par le facteur de dilution et diviser par le volume ensemencé afin de déterminer l'effet des traitements sur la croissance bactérienne.

La densité cellulaire d'E. coli a été mesurée à une DO 600. Les courbes de croissance bactérienne représentatives illustrées ici correspondent à différentes concentrations de médicament, allant de zéro à la mort cellulaire complète. Les symboles ouverts représentent uniquement le PMB, avec les concentrations indiquées.

Les symboles pleins correspondent à C-D-T-E-P-M-B sans irradiation et les symboles partiellement remplis correspondent à C-D-T-E-P-M-B avec irradiation. L'irradiation n'a eu aucun effet sur les échantillons contenant uniquement le PMB, de sorte que ces courbes ont été omises pour plus de clarté. Voici les graphiques des valeurs de la courbe de croissance à 200 minutes en fonction du log PMB, ainsi que les ajustements à cette équation permettant de déterminer les valeurs d'IC 50 afin de contrôler les effets de la lumière.

Une courbe est réalisée avec l'antibiotique uniquement, avec une exposition à la lumière de 30 minutes. Cette figure indique la survie bactérienne à 200 minutes en fonction de la concentration de QD en utilisant des QD de CDTE. Une certaine toxicité est observée avec l'exposition à la lumière, mais trop faible pour déterminer une valeur d'IC50.

Cela indique que la toxicité du CDTE seul aux concentrations utilisées dans l'expérience de conjugaison est négligeable. Pour comparer les effets de différents traitements sur la croissance cellulaire, les valeurs de la courbe de croissance à 200 minutes ont été tracées et ajustées à l'équation présentée précédemment, comme illustré ici. Les conjugués C-D-T-E-P-M-B étaient plus toxiques que le PMB seul. En comparaison, les nanoparticules d'or conjuguées A-U-P-M-B ne montrent aucune toxicité accrue par rapport au PMB seul, afin de déterminer l'effet des traitements sur la survie bactérienne.

Le nombre d'unités formant colonies a été déterminé pour E. coli cultivé dans une plaque de 96 puits traitée avec P-M-B-Q-D-P-M-B ou QD seul, en présence ou en absence de rayonnement I pendant 30 minutes, puis incubée à 32 degrés Celsius pendant quatre heures. Des dilutions sériées de chaque échantillon bactérien ont été réalisées avec une solution saline, et 10 microlitres de solutions allant de 100 x à 10 puissance sept x ont été ensemencés sur des géloses. Les géloses ont été incubées à 37 degrés Celsius et les colonies ont été comptées après 16 heures.

Dans cet exemple, les colonnes A à C de la plaque contiennent des bactéries traitées avec des concentrations croissantes de CDTE. Les conjugués sans irradiation et les colonnes D à F correspondent à des bactéries traitées avec des concentrations croissantes de conjugués. Associées à 30 minutes d'irradiation, les dilutions sont indiquées en lignes.

Les données indiquent qu'après irradiation, les conjugués exercent une inhibition plus importante sur la croissance bactérienne par rapport aux conjugués non irradiés. N'oubliez pas que les réactifs ca sont extrêmement toxiques et que des précautions telles que le port de gants, de blouses de laboratoire et de lunettes de protection doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment effectuer un criblage à haut débit de l'effet antibactérien de nanoparticules, avec ou sans conjuguaison à des antibiotiques.