Name: Un système d Ex vivo de pancréas embryonnaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Découvrez la culture ex vivo de bourgeons pancréatiques embryonnaires chez la souris pour étudier la morphogenèse et la différenciation cellulaire. Cette méthode permet d'observer le développement pancréatique en temps réel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

La recherche dans le laboratoire Spagnoli. est financé par l&#39;Association Helmholtz, FP7-GRI-2008-ENDOPANC subvention et ERC-2009-Starting Grant hépatopancréatique.

Le protocole décrit ici a été adapté à la technique décrite à l&#39;origine de Percival et Slack 9 et optimisé pour la microscopie confocale. 1. Revêtement de plats Glass Bottom Culture Les étapes suivantes doivent être effectuées dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire. <ol><li> Explants pancréatiques sont cultivées dans des boîtes de Pétri de 35 mm à 20 mm de diamètre en verre micropuits bas (par exemple MatTek Corporation). Utilisez un plat à fond de verre par la culture de l&#39;explant et pendant toute la durée de la culture. A la veille de la dissection et l&#39;isolement des bourgeons pancréatiques, enduire les micropuits à fond de verre avec la fibronectine. </li><li> Diluer la fibronectine dans une culture cellulaire stérile de qualité de l&#39;eau à une pg 50 / ml final et ajouter un volume minimal de celle-ci (~ 150 ul) dans le micropuits 20-mm des plaques MatTek couvrant toute la surface du verre (figure 1E). Placez les platsdans un réfrigérateur 4 ° C pendant une nuit d&#39;incubation. </li><li> Le jour de la dissection, aspirer la fibronectine, rincer le micropuits de culture de cellules de qualité de l&#39;eau et ajouter un volume minimum de 150 pi de BME (Basal Medium Eagle) un milieu supplémenté avec Pen / Strep (1%), Glutamine (1% ) et 50 pg / ml de gentamicine [Moyen Dissection]. Laissez les plats revêtus dans la hotte à flux laminaire jusqu&#39;au moment de la plaque des explants. </li></ol> Si ce n&#39;est pas tous les plats revêtus de fibronectine sont utilisés, ils peuvent être stockés pendant 1 semaine à 4 ° C. Ne laissez pas les plats sécher, de les remplir de milieu de dissection et les placer dans le réfrigérateur. En plus de la fibronectine, du pancréas explants ont bien été cultivées sur des substrats divers, tels que la laminine 9, 10,11 ou matrigel membranes microporeuses 12. En raison de ses effets sur la ramification, nous utilisons la fibronectine 9 comme substrat. 2. Dissection de DBud pancréatique ORSAL partir de E11.5 - E12.5 embryons de souris <ol><li> Timed-souris femelles enceintes à jour embryonnaire (E) 11,5 ou 12,5 sont sacrifiés et les embryons sont recueillis à l&#39;aide d&#39;instruments de dissection préalablement nettoyés avec de l&#39;éthanol à 70%. Placez l&#39;utérus disséqués dans 10 cm des plaques contenant du PBS glacé complété avec 50 ug / ml de gentamicine. </li><li> Sous un stéréomicroscope avec éclairage par le dessus, séparé de l&#39;utérus en segments individuels à l&#39;aide d&#39;embryons de petits ciseaux ou des pinces Dumont, doucement décoller le muscle de l&#39;utérus et de supprimer les embryons individuels, qui sont entourés par la caduque. Utilisez les techniques standards de dissection d&#39;embryons de 13 à exposer les embryons et retirez le sac vitellin et l&#39;amnios. Par la suite, retirer la partie supérieure du corps de l&#39;embryon (au-dessus du foie) et la région de la queue. Cela permettra à l&#39;exposition des organes internes (figure 1B). Transférer le corps médian des embryons dans 10 cm des plaques contenant glacée milieu de dissection BME. </li><li> Maintenantutiliser uniquement transillumination ci-dessous pour visualiser et à disséquer le bourgeon pancréatique dorsal sous la loupe binoculaire. Doucement, ouvrez le milieu du corps de l&#39;embryon en faisant une incision latérale avec une pince. Localisez l&#39;estomac et la rate. Le bourgeon pancréatique dorsal est fixée latéralement à la zone postérieure de l&#39;estomac (figure 1C). En utilisant des pinces Dumont, disséquer loin le bourgeon pancréatique dorsal des structures adjacentes, comme l&#39;estomac et la rate, mais en laissant une certaine mésenchyme autour de l&#39;épithélium (figure 1D). En utilisant une pipette Pasteur en verre, transférer l&#39;œuf isolé dans un plat de 35 mm de Pétri contenant du milieu de dissection froide BME supplémenté avec 10% sérum de veau foetal [Milieu de culture]. Répétez ces étapes jusqu&#39;à ce que tous les pancréas sont isolés. Si pancréas de différents génotypes sont isolés, ne les mélangez à l&#39;aide Nunc 4-puits. </li></ol> 3. Placage et de la culture des explants pancréatiques Finale platetion des explants est effectué dans la chambre de culture de tissus et / ou à proximité immédiate de l&#39;incubateur de culture tissulaire pour minimiser le mouvement physique des cultures. <ol><li> Dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire remplacer le milieu de dissection BME dans les plats MatTek fibronectine enduits avec ~ 150 pl de milieu de culture BME préchauffé à 37 ° C. </li><li> Avec précaution, le transfert des explants de pancréas dans des boîtes recouvertes de MatTek (un explant par boîte) pour culture à long terme en utilisant une pipette Pasteur en verre. Pour assurer la diffusion au cours de la culture, le mésenchyme environnant les explants peuvent être légèrement déchiré, si nécessaire, avec une aiguille fine. </li><li> Doucement, placer les cultures dans un incubateur de culture tissulaire (37 ° C, 5% CO 2) pendant quelques heures pour laisser les explants joindre aux micropuits à fond de verre. Une fois qu&#39;ils sont attachés, remplir les plats MatTek avec 1,5 ml à 2 ml de milieu de culture BME pré-chauffé à 37 ° C. Le jour de la dissection est désigné comme jour 0. </li><li> Hommeipulation des cultures d&#39;explants pancréatiques est réalisée dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire. Le milieu de culture BME est changé tous les jours, à moins que les exigences expérimentales dicter le calendrier différent (par exemple, l&#39;incubation des explants avec des agents chimiques). Les explants peuvent être cultivés dans cet état pendant 5 jours à une semaine. </li></ol> 4. Ensemble de montage Protocole de coloration par immunofluorescence pour des explants pancréatiques Toutes les étapes du protocole de fixation (immunofluorescence à l&#39;imagerie) sont réalisées dans le même plat MatTek, ce qui donne de meilleures images d&#39;un plat en plastique à fond. Après fixation, les cultures d&#39;explants pancréatiques n&#39;ont pas besoin d&#39;être conservés dans des conditions stériles. <ol><li> Aspirer milieu de culture BME et laver l&#39;explant une fois avec 2 ml de PBS 1X. </li><li> Pour la fixation explant remplacer PBS avec 2 ml glacée paraformaldéhyde 4% (PFA) et placer le plat sur la glace pendant 20 min. Swirl la plaque délicatement de temps entemps, mais il faut éviter les plates-formes à bascule, comme l&#39;explant pourrait se détacher. </li><li> Retirer et laver PFA trois explants fois avec 2 ml de PBS 1X pendant 10 min chacun à température ambiante (RT). </li><li> Bloc avec 2 ml de solution de blocage (PBS 1X + 0,1% de Triton-X + 3% de sérum d&#39;âne) pendant au moins 30 min à température ambiante. </li><li> Diluer l&#39;anticorps primaire dans la solution de blocage et ajouter ~ 150 pl de la dilution directement dans la cupule 20-mm des plaques de recouvrement de la surface MatTek explant ensemble pour une incubation pendant une nuit à 4 ° C. Afin de minimiser les mouvements physiques, ajouter anticorps primaire aux explants directement dans la chambre froide (4 ° C). Pour éviter l&#39;évaporation, avant d&#39;ajouter l&#39;anticorps, placer les plaques MatTek dans une chambre humide. </li><li> Le lendemain, retirer la solution d&#39;anticorps et laver trois fois avec 2 ml de PBS 1X + 0,1% de Tween-20 (PBT) pendant 30 min à température ambiante chacun. </li><li> Diluer l&#39;anticorps secondaire dans une solution de blocage [selon les recommandations du fabricant, nous utilisons âne Alexa Fluor colorants lutte secondairecorps à 1:750 dilution] et ajouter ~ 150 ul de la dilution directement dans la cupule de 20 mm des plaques de MatTek, couvrant toute la surface des explants, pendant 1-2 heures d&#39;incubation à température ambiante dans l&#39;obscurité. Pour contre-coloration nucléaire, notamment Hoechst avec une dilution d&#39;anticorps secondaire. Pour éviter l&#39;évaporation, avant d&#39;ajouter l&#39;anticorps, placer les plaques MatTek dans une chambre humide. </li><li> Laver trois fois avec 2 ml de PBS 1X + 0,1% de Tween-20 (PBT) pendant 30 min à température ambiante chacun. </li><li> Avant le montage, laver une fois avec du PBS 1X pour éliminer Tween-20. Montez en ajoutant une goutte de milieu de montage aqueux (avec anti-décoloration) dans la cupule de 20 mm des plaques de MatTek. Doucement, couvrir l&#39;explant avec une lamelle de verre. Évitez les bulles d&#39;air. </li><li> Les explants sur des plaques de MatTek peut être consulté en microscopie à contraste de phase standard ou microscopie confocale, en fonction des objectifs de l&#39;expérience. Pour l&#39;analyse de microscopie confocale, nous utilisons un Zeiss LSM 700 réglage inversé. Mettre en place des lasers appropriés pour les fluorophores noused. Sélectionnez un objectif qui sera l&#39;image de la zone désirée de l&#39;explant du pancréas. Un 10X objectif à immersion dans l&#39;eau est apte à maintenir l&#39;expiant entier dans le champ de vision. A 40x eau ou à l&#39;huile d&#39;immersion conviennent de se concentrer sur des régions spécifiques du pancréas explant avec une meilleure résolution. Les explants peuvent être optiquement sectionnée puis l&#39;acquisition de Z-piles reconstruit en 3D, en utilisant un logiciel approprié. </li></ol> 5. Protocole d&#39;imagerie des cellules vivantes des explants pancréatiques <ol><li> Configuration de l&#39;environnement de chambre: utiliser une enceinte de protection et une petite chambre d&#39;incubation [avec la température et le CO 2 de contrôle] qui se trouve sur la platine du microscope. Culture approprié du pancréas embryonnaire nécessite une température stable de 37 ° C et sous atmosphère contrôlée de CO 2 5% humidifiée. Chambres convenables sont disponibles auprès de plusieurs fournisseurs (Par exemple, Zeiss, Nikon, Olympus). Monter la boîte de chauffage et allumez-le unu moins 1 h avant l&#39;imagerie commence à permettre à l&#39;équipement de se réchauffer et équilibrer teneur en CO 2 à 5%. </li><li> Pour imagerie time-lapse de cultures d&#39;explants pancréatiques, nous utilisons un Zeiss LSM 700 microscope inversé. Pour les lasers et la sélection objective voir point 4.10. </li><li> Laissez l&#39;explant pancréas fixer ainsi le plat à fond de verre avant de commencer l&#39;imagerie en temps réel. [Nous exécutent habituellement imagerie en temps réel à partir du jour 1]. Dans une hotte à flux laminaire, aspirer et remplacer le milieu par du milieu BME explant culture fraîche de commencer avec des conditions optimales de nutriments. </li><li> Doucement transférer les explants à la salle de microscope et placer le plat MatTek dans la chambre d&#39;incubation dans le porte-échantillon du microscope confocal. </li><li> Préparer l&#39;objectif (par exemple, ajouter de l&#39;huile ou de l&#39;eau-support selon le choix de l&#39;objectif à immersion) et se concentrer sur la région d&#39;intérêt dans l&#39;expiant. Fermer la chambre de l&#39;environnement correctement. Pour éviter toute évaporation pendant time-lapseacquisition avec de l&#39;eau d&#39;immersion objectifs, à la place de l&#39;eau, il est recommandé d&#39;utiliser les fluides visqueux d&#39;immersion qui sont disponibles dans le commerce (par exemple Zeiss Immersol W). </li><li> Mettre en place intensité du laser, les paramètres d&#39;acquisition Z-stack et l&#39;intervalle de temps (voir aussi discussion pour le dépannage). Commencez l&#39;expérience. </li><li> Après l&#39;imagerie, l&#39;exportation Z piles et tous les points dans le temps et de les analyser à l&#39;aide du logiciel approprié (par exemple ImageJ, Volocity, Imaris, Huygens). </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Bourgeons pancréatiques dorsal (avec le mésenchyme environnant) ont été disséqués à partir d&#39;embryons de souris E11.5 et E12.5 entre et plaqué directement sur ​​la vaisselle en verre à fond la culture (figure 1). Les vaisseaux sanguins sont présents dans le mésenchyme environnant l&#39;épithélium et peuvent être visualisées par immunocoloration pour le marqueur endothélial Pecam 12 (données non présentées). Après deux jours de culture, du pancréas und explantserwent une croissance importante et ont commencé à s&#39;organiser en structures ramifiées épithéliales, dont les noyaux étaient positifs pour le facteur de transcription du pancréas, Pdx1 (Figure 2A-C). La moyenne z-épaisseur des explants de pancréas au jour 3 de la culture est de 60-80 um. La surface et le volume des explants peuvent être mesurés en utilisant des logiciels appropriés (p. ex Huygens). Les analyses morphologiques et immunofluorescence ont montré que les explants pancréatiques cultivés en utilisant ce protocole récapitulé dans la différenciation in vivo du pancréas précoce et événements morphogénétiques 5,10,11,14 (figure 2). Explants pancréatiques au jour 4 de la culture a subi typique &quot;tip et le tronc&quot; ségrégation de l&#39;épithélium 8, affichant CPA1 + cellules progénitrices à l&#39;extrémité des branches épithéliales (figure 2C) et + insuline différenciées et de glucagon + cellules organisées en grappes à l&#39;intérieur du tronc (figure 2D ). En outre, la pancréatitec épithélium dans les cultures ex vivo ont montré l&#39;organisation du cytosquelette et de la polarité cellulaire appropriée, avec une localisation apicale de la F-actine (figure 2E, en vert) et b1-integrin au niveau des membranes basales (figure 2E, en rouge). Pour étudier la ramification du pancréas en temps réel, des explants pancréatiques embryonnaires ont été isolées à partir de la double couleur souche rapporteuse de la souris fluorescente membrane-Tomato/membrane-Green 15 (mT / mG; souche de souris est disponible au Laboratoire Jackson) (figure 3). Toujours trames d&#39;une vidéo time-lapse de explants pancréatiques mT / mG en culture sont présentés dans la figure 3. La localisation de la protéine fluorescente mT à des structures membranaires décrit la morphologie des cellules et permet la résolution de fines processus cellulaires, permettant de suivre le remodelage et la migration cellulaire au cours du temps. Après un 12-hr time-lapse expérience du signal de fluorescence mT reste viable et deteCTABLE, même si son intensité est réduite, probablement en raison de photovieillissement (figure 3). Solutions techniques pour éviter ou réduire le photovieillissement et de phototoxicité sont discutés dans la section Discussion. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig1.jpg" /> Figure 1. Représentation schématique de la dissection des bourgeons pancréas dorsal à partir de E12.5 embryon de souris. (A) l&#39;image de fond clair E12.5 embryon de souris. La partie supérieure du corps de l&#39;embryon (au-dessus du foie) et la région de queue sont éliminés afin d&#39;isoler le milieu du corps (B). Les incisions sont représentés par des pointillés rouges. (C) les résultats de dissection supplémentaire de l&#39;exposition de l&#39;estomac et du duodénum région (indiqué par la zone en pointillés). Le bourgeon pancréatique dorsal (voir cercle rouge en pointillés) est à la base de l&#39;estomac et à côté de l&#39;ébauche de la rate. Le bourgeon pancréatique dorsal disséqué (D) est transféré à la pipette Pasteur dans les micropuits d&#39;un fond plat en verre contenant un milieu de culture BME (E, F). Abréviations: STO (estomac), sp (rate), dp (bourgeon pancréatique dorsal), duo (duodénum). Barres d&#39;échelle, 1000 um (A, C). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig2.jpg" /> Figure 2. Tout montage analyse confocale par immunofluorescence des cultures d&#39;explants pancréatiques. (A) des images en fond clair d&#39;explants de pancréas le jour 1 et le jour 2 de la culture ex vivo. Rouge ligne pointillée indique l&#39;initiation de la ramification de l&#39;épithélium. (B) la reconstruction 3D de l&#39;ensemble du montage immunocoloration pour Pdx1 sur la culture du pancréas jour 3. Explants pancréatiques a montré tubules de cellules PDX1 + subissant une vaste ramification de 48 h de culture. (C) Tout montage immunomarquage du pancréas explant jour 3 avec des anticorps contre le marqueur membrane basolatérale E-cadhérine (ECAD), marqueur progéniteur pointe, Carboxypeptidase 1 (CPA1) et phospho-Histone H3 (pHH3). La plupart des cellules mitotiques actif pHH3 + colocalisent aux extrémités périphériques avec CPA1 cellules +. L pointilléeines indiquent la pointe des branches. (D) Le total montage immunomarquage pour les marqueurs de lignage endocrine, de l&#39;insuline (Ins) et le glucagon (gluca) au jour 3. Les flèches jaunes indiquent des grappes de Ins + et + gluca cellules. Encart (D &#39;), supérieur de grossissement de l&#39;une grappe de cellules endocrines. (E) Le total montage immunomarquage d&#39;explant pancréas jour 3 pour Pdx1, β1 des intégrines (β1int) et F-actine (Fait). Les cellules mésenchymateuses (astérisques) sont intercalées entre Pdx1-positives cellules épithéliales. Images présentées dans C, D et E sont simples sections optiques confocaux de Z-série. Barres d&#39;échelle, 100 um (A, B); 50 pm (CE). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig3.jpg" /> Figure 3. Représentant imagerie des cellules vivantes ex vivo d&#39;explants cultivés du pancréas. (AD) trames d&#39;une vidéo time-lapse d&#39;un explant de pancréas d&#39;un embryon mT / mG souris transgénique. Temps d&#39;imagerie est indiquée en heures: minutes. L&#39;explant a été imagé à partir Day 1. Z-stack imagesont été acquises avec un objectif à immersion d&#39;huile 40X toutes les 12 min pour un total de 15 heures. Les lignes pointillées indiquent la pointe des branches et des frontières entre l&#39;épithélium et le mésenchyme. La barre d&#39;échelle, 50 um.

<ol><li>Slack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+biology+of+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Developmental biology of the pancreas.</a> Development. 121, 1569-1580 (1995).</li>
<li>Pan, F., Wright, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+organogenesis%3A+from+bud+to+plexus+to+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland.</a> Dev. Dyn. 240, 530-565 (2011).</li>
<li>Puri, S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Plasticity+within+the+Pancreas-+Lessons+Learned+from+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular Plasticity within the Pancreas- Lessons Learned from Development.</a> Developmental Cell. 18, 342-356 (2010).</li>
<li>Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+endoderm+to+pancreas%3A+a+multistep+journey%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">From endoderm to pancreas: a multistep journey.</a> Cell. Mol. Life Sci. 64, 2378-2390 (2007).</li>
<li>Hick, A. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+primitive+duct+formation+in+the+pancreas+and+submandibular+glands%3A+a+role+for+SDF-1%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1.</a> BMC Dev. Biol. 9, 1-17 (2009).</li>
<li>Villasenor, A., Chong, D., Henkemeyer, M., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+dynamics+of+pancreatic+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis.</a> Development. 137, 4295-4305 (2010).</li>
<li>Kesavan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42-Mediated+Tubulogenesis+Controls+Cell+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cdc42-Mediated Tubulogenesis Controls Cell Specification.</a> Cell. 139, 791-801 (2009).</li>
<li>Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multipotent+Progenitor+Domain+Guides+Pancreatic+Organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A Multipotent Progenitor Domain Guides Pancreatic Organogenesis.</a> Developmental Cell. 13, 103-114 (2007).</li>
<li>Percival, A., Slack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+pancreatic+development+using+a+cell+lineage+label%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of pancreatic development using a cell lineage label.</a> Exp. Cell Res. 247, 123-132 (1999).</li>
<li>Miralles, F., Czernichow, P., Ozaki, K., Itoh, N., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+through+fibroblast+growth+factor+receptor+2b+plays+a+key+role+in+the+development+of+the+exocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Signaling through fibroblast growth factor receptor 2b plays a key role in the development of the exocrine pancreas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6267-6272 (1999).</li>
<li>Puri, S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+embryonic+pancreas+development+using+real-time+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging.</a> Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).</li>
<li>Magenheim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+restrain+pancreas+branching%2C+differentiation+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth.</a> Development. 138, 4743-4752 (2011).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).</li>
<li>Horb, L. D., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cell+division+in+branching+morphogenesis+and+differentiation+of+the+embryonic+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of cell division in branching morphogenesis and differentiation of the embryonic pancreas.</a> Int. J. Dev. Biol. 44, 791-796 (2000).</li>
<li>Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Une fois le sort du pancréas est spécifié, les cellules progénitrices pancréatiques subissent une prolifération extensive, la différenciation et la morphogenèse, à terme, constituer un organe mature et fonctionnelle 2,4. À l&#39;heure actuelle, comment les branches se déroule dans le pancréas et la façon dont elle est reliée à la prolifération et la différenciation des progéniteurs est largement inconnue. Des cultures d&#39;explants pancréatiques représentent un système idéal pour élucider ces processus e...

<table border="1"><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Anticorps: Carboxypeptidase E-cadhérine F-actine Le glucagon Insuline β1-intégrine Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3 </td><td> AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes Immunostar Millipore Millipore Abcam Hybridome banque Signalisation cellulaire </td><td> 1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 </td><td></td></tr><tr><td> Basal Medium Eagle (BME) </td><td> Sigma </td><td> B1522-500ML </td><td> Conservés dans des conditions stériles </td></tr><tr><td> Eau de qualité culture cellulaire </td><td> AAP </td><td> S15-012 </td&gt; <td> Conservés dans des conditions stériles </td></tr><tr><td> Boîtes de culture (à fond de verre), 35 mm </td><td> MatTek Corporation </td><td> P35G 0-20-C- </td><td></td></tr><tr><td> Sérum d&#39;Ane </td><td> Chemicon </td><td> S30-100 ml </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau foetal Or </td><td> AAP </td><td> A15-151 </td><td> Conservés dans des conditions stériles </td></tr><tr><td> La fibronectine </td><td> Invitrogen </td><td> 330100-8 </td><td> Stock sol. 1 mg / ml dans de l&#39;eau de qualité culture cellulaire </td></tr><tr><td> Gentamicine </td><td> Invitrogen </td><td> 15750-037 </td><td> Conservés dans des conditions stériles </td></tr><tr><td> Glutamine </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-024 </td><td> Conservés dans des conditions stériles </td></tr><tr><td> 4-ainsi multipuits </td><td> Nunc </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopes: Microscope confocal inversé (LSM 700) Stéréomicroscope (Discovery V12) </td><td> Zeiss Zeiss </td><td></td><td> Objectifs: C-Apochromat 10X / 0,45 W M27 (travail. dist 1,8 mm;. Profondeur d&#39;imagerie ~ 100 mm), C-Apochromat 40X / 1,2 W Corr M27 (travail. dist 0,28 mm;. ~ Imagerie profondeur 50 um) Transillumination d&#39;en bas et à fibres optiques d&#39;éclairage par le dessus </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde </td><td> Roth </td><td> 0335.3 </td><td> Solution mère 20% </td></tr><tr><td> Pipette Pasteur (verre), 150 mm </td><td> VWR </td><td> HECH567 / 1 </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline / Streptomycine </td><td> AAP </td><td> P11-010 </td><td> Conservé dans c stérileonditions </td></tr><tr><td> Des boîtes de Pétri de 60 mm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 628102 </td><td></td></tr><tr><td> Des boîtes de Pétri de 35 mm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 627161 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS, pH 7,4 </td><td> AAP </td><td> H15-002 </td><td> Conservés dans des conditions stériles </td></tr><tr><td> Printemps Ciseaux lame de 8 mm courbé </td><td> Outils Fine Science </td><td> 15023-10 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X100 </td><td> Roth </td><td> 3051.3 </td><td></td></tr><tr><td> Horloger foreceps Dumont # 5 </td><td> Roth </td><td> K342.1 </td><td></td></tr></table>

un système d&#39;<em&gt; ex vivo</emla culture&gt; de pancréas embryonnaire

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Le pancréas contrôle les fonctions vitales de notre corps, y compris la production d&#39;enzymes digestives et la régulation de la glycémie 1. Bien que dans la dernière décennie de nombreuses études ont contribué à une base solide pour la compréhension de l&#39;organogenèse du pancréas, des lacunes importantes subsistent dans notre connaissance de la formation du pancréas au début 2. Une compréhension complète de ces événements précoces donnent un aperçu de l&#39;évolution de cet organe, mais aussi sur les maladies incurables qui ciblent le pancréas, comme le diabète ou le cancer du pancréas. Enfin, cette information sera générer un modèle pour l&#39;élaboration de cellules en remplacement des traitements dans le cadre du diabète. Au cours de l&#39;embryogenèse, le pancréas provient de différentes excroissances embryonnaires de l&#39;endoderme intestin antérieur dorsal et ventral à jour embryonnaire (E) 9,5 3,4 chez l&#39;embryon de souris. Les deux excroissances evaginate dans le mésenchyme environnant solide épithéliumbourgeons l, qui subissent la prolifération, la différenciation et de branchement pour générer un organe pleinement matures 2,5,6. Des preuves récentes ont suggéré que la croissance et la différenciation des lignées de cellules pancréatiques, y compris les productrices d&#39;insuline des cellules β, dépend de la bonne tissulaire architecture, remodelage épithélial et le positionnement cellulaire dans l&#39;épithélium pancréatique de branchement 7,8. Cependant, comment morphogenèse de ramification se produit et est coordonné avec la prolifération et la différenciation dans le pancréas est largement inconnue. Ceci est en partie dû au fait que les connaissances actuelles sur ces processus de développement reposait presque exclusivement sur l&#39;analyse des échantillons fixés, alors que les événements morphogénétiques sont très dynamiques. Ici, nous présentons une méthode pour disséquer et de la souris en culture du pancréas embryonnaire ex vivo sur des bourgeons plats à fond de verre, ce qui permet la visualisation directe du pancréas en développement (figure 1). Ce culteure système est idéalement conçu pour la microscopie confocale à balayage laser et, en particulier, imagerie des cellules vivantes. Explants pancréatiques peuvent être préparés non seulement à partir d&#39;embryons de souris de type sauvage, mais aussi à partir de souches de souris génétiquement modifiées (transgéniques ou knock-out par exemple), ce qui permet en temps réel des études de phénotypes mutants. En outre, ce système culture ex vivo est précieux pour étudier les effets des composés chimiques sur le développement du pancréas, ce qui permet d&#39;obtenir des données quantitatives sur la prolifération et la croissance, l&#39;allongement, la ramification, tubulogenèse et la différenciation. En conclusion, le développement d&#39;une méthode in vivo du pancréas culture ex explant combiné avec l&#39;imagerie haute résolution fournit une base solide pour l&#39;observation d&#39;événements morphogénétiques et de différenciation tels qu&#39;ils se présentent dans l&#39;embryon de souris en développement.

Ici, nous décrivons une méthode pour l&#39;isolement, la culture et la manipulation du pancréas embryonnaire de la souris. Cela représente une excellente<em&gt; Ex vivo</em&gt; Système pour l&#39;étude des divers aspects du développement du pancréas, y compris la morphogenèse, la différenciation et la croissance. Explants de bourgeons pancréatiques peuvent être cultivées pendant plusieurs jours et utilisé dans une variété d&#39;applications différentes, y compris l&#39;ensemble de montage immunofluorescence et imagerie en temps réel.

Un système d&#39;<em&gt; Ex vivo</emLa culture&gt; de pancréas embryonnaire

Le pancréas contrôle des fonctions vitales de notre organisme, notamment la production d'enzymes digestives et la régulation de la glycémie1. Bien que dans le ...

L'objectif général de cette procédure est de disséquer et de cultiver des bourgeons pancréatiques embryonnaires de souris ex vivo, permettant ainsi une visualisation directe du pancréas en développement. Cette étape est réalisée en disséquant d'abord des embryons de souris de 11,5 ou 12,5 jours de développement embryonnaire, puis en retirant la région supérieure du corps et la queue afin d'isoler la partie médiane de l'embryon. La deuxième étape consiste à exposer la région du duodénum et de l'estomac pour les localiser, puis à disséquer le bourgeon pancréatique dorsal.Ensuite, le bourgeon est transféré dans le puits micro d'une boîte MacTech et cultivé pendant une semaine au maximum. Enfin, l'explante peut être analysé par imagerie de cellules vivantes, ou bien l'explante peut être fixé, coloré en montage entier et analysé par imagerie en immunofluorescence. En définitive, la différenciation des cellules pancréatiques, l'organisation du cytosquelette, la polarité cellulaire et la morphogenèse ramifiée peuvent être évaluées.La culture ex vivo d'explants de pancréas peut aider à répondre à des questions clés concernant l'organogenèse pancréatique, comme la morphogenèse ramifiée. Com

a-system-for-ex-vivo-culturing-of-embryonic-pancreas

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

La présente étude décrit une approche différenciation dirigée dans l'induction de la différenciation du pancréas de cellules souches embryonnaires humaines. D'une grande importance est le fait que des cellules endothéliales de co-culture de maturation de la médiation sur les cellules souches embryonnaires humaines dérivées des progéniteurs pancréatiques en cellules exprimant l'insuline.

Cellules endothéliales co-culture de maturation de la médiation de l&#39;homme les cellules souches embryonnaires à des cellules productrices d&#39;insuline du pancréas dans une approche différenciation dirigée

Dans cette publication, nous décrivons une procédure rapide et pratique pour les cellules acineuses pancréatiques primaires culture du pancréas murin isoler et. Cette méthode constitue une approche intéressante à étudier la physiologie des cellules pancréatiques exocrines normales / non transformé primaires fraîches.

Isolement et culture de cellules primaires de souris acineuses du pancréas

Un protocole d'isoler, les grappes de la culture, et de l'image cellules des îlots (CCI) dérivées de cellules pancréatiques fœtales humaines est décrite. La méthode décrit les étapes nécessaires pour générer CCI du tissu, de la culture en monocouche ou en suspension sous forme d'agrégats, et l'image des marqueurs de prolifération et les décisions du destin cellulaire du pancréas.

L&#39;isolement, la culture, et de l&#39;imagerie de l&#39;homme causés par des amas de cellules pancréatiques

Le procédé de culture en trois dimensions décrite dans ce protocole récapitule le développement du pancréas de progéniteurs embryonnaires dispersées de pancréas de souris, y compris leur expansion substantielle, la morphogenèse et la différenciation dans un organe ramifié. Ce procédé se prête à l'imagerie, la perturbation fonctionnelle et la manipulation de la niche.

In Vitro pancréas organogenèse du dispersées progéniteurs embryonnaires de souris

Dans les essais de colonies in vitro pour détecter l' auto-renouvellement et la différenciation des cellules progénitrices isolées à partir de pancréas de souris adultes sont mis au point. Dans ces essais, les progéniteurs du pancréas donnent naissance à des colonies de cellules dans un espace en 3 dimensions dans un milieu semi-solide contenant de la méthylcellulose. Les protocoles pour la manipulation des cellules individuelles et la caractérisation des colonies individuelles sont décrites.

In Vitro Colony Assays pour Caractériser les cellules progénitrices Tri-puissants Isolée des adultes murins Pancréas

Nous décrivons ici un protocole pour isoler les îlots intacts de souris néonatales. Pancreata ont été partiellement digéré avec de la collagénase, suivi d'un lavage et cueillette à la main. 20 - 80 amas d'îlots peuvent être obtenus par le pancréas de souris nouveau-nés, qui sont appropriés pour de nombreuses études d'îlots.

Isolation efficace des îlots fonctionnels de néonatales Pancréas souris

Nous présentons ici un protocole pour produire de l’insuline exprimant 3D pancreatoids murin de progéniteurs pancréatique flottant e10.5 dissocié et le mésenchyme associé.

Génération d’insuline exempte d’échafaudage, en trois dimensions exprimant Pancreatoids de souris progéniteurs pancréatique In Vitro

Nous présentons ici un protocole détaillé afin de différencier les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) dans les protéines de boîte homéotique pancréas/duodénum 1+ (PDX1+) pour la génération des lignées du pancréas, les cellules basé sur la croissance de monocouche de type non colonie de dissocier les cellules individuelles. Cette méthode convient pour la production homogènes cellules dérivées d’hPSC, la manipulation génétique et dépistage.

Génération efficace du pancréas/duodénum homéotique Protein 1+ postérieure Foregut/pancréatique progéniteurs de hPSCs dans les Cultures de l’adhérence

Nous décrivons une méthode pour isoler des cellules endocrines du pancréas embryonnaires, néonatals et postnatals suivies par séquençage de RNA unicellulaires. Cette méthode permet des analyses du développement de la lignée endocrine du pancréas, de la cellule hétérogénéité et transcriptomique dynamique.

Analyse transcriptomique unicellulaire de cellules endocrines pancréatiques de souris

Nous proposons un protocole mini-invasif pour la transplantation intramusculaire d’îlots de cellules souches pancréatiques dérivées de cellules souches humaines dans des souris immunodéficientes pour une implantation in vivo et une analyse en aval.

Transplantation intramusculaire de cellules endocrines pancréatiques dérivées des cellules souches pluripotentes humaines chez la souris

Découvrez la culture ex vivo de bourgeons pancréatiques embryonnaires chez la souris pour étudier la morphogenèse et la différenciation cellulaire. Cette méthode permet d'observer le développement pancréatique en temps réel.

Un système d'

Explorer plus de vidéos