En électroporation in vitro de la lèvre inférieure rhombique d'embryons de souris Midgestation

L'objectif général de cette procédure est de manipuler l'expression génique dans les progéniteurs du cerveau postérieur embryonnaire par l'introduction d'ADN plasmidique par électroporation à des stades précoces de la gestation. Cela est réalisé en isolant d'abord les embryons à 11,5 jours de gestation et en les orientant avec la face dorsale vers le haut dans une solution saline tamponnée au phosphate stérile. La deuxième étape consiste à injecter environ 50 microlitres du plasmide d'expression dans 0,01 % de vert rapide.

Lors d'une injection réussie, l'ensemble du système ventriculaire est rempli par le mélange d'ADN et de vert rapide. Ensuite, l'embryon est soumis à une impulsion électrique. Le côté de l'embryon le plus proche de l'électrode chargée positivement intègre l'ADN plasmidique.

L'autre côté servira de contrôle négatif interne. La dernière étape consiste à placer les embryons en culture tissulaire pendant au moins 24 heures. En fin de compte, le gène électroporé sera exprimé après 24 heures de culture et pourra être évalué par immunohistochimie.

L'avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans la possibilité de manipuler les progéniteurs du cerveau postérieur embryonnaire à des stades gestationnels plus précoces. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine, telles que la manière dont différents gènes uraux peuvent influencer le destin des progéniteurs embryonnaires. Commencez cette procédure en stérilisant les outils de dissection et la hotte à flux laminaire conformément au manuscrit accompagnant.

Pour récolter les embryons, placez une souris femelle euthanasiée, gestante de petits à J11.5, sur le plateau de dissection dans la hotte. Ensuite, vaporisez l’abdomen de la souris avec de l’éthanol à 70 %. Ouvrez la cavité péritonéale et fixez les parois sur le plateau de dissection.

Ensuite, sortez les cornes utérines afin qu'elles reposent dans la cavité péritonéale. À l'aide de pinces, ouvrez soigneusement la paroi de la corne utérine. Utilisez une cuillère de 20 millimètres pour retirer délicatement les embryons dans la vésicule vitelline du placenta.

Après cela, placer les embryons dans une boîte de culture tissulaire de 100 millimètres préremplie avec 10 millilitres de PBS stérile préchauffé à une fois. Dans cette étape, transférer le premier embryon dans une nouvelle boîte de 100 millimètres préremplie avec 10 millilitres de PBS stérile à une fois, préchauffé à 37 degrés Celsius.

Ensuite, retirez soigneusement et jetez la poche vitelline. Placez ensuite l'embryon de manière à ce que son côté dorsal soit orienté vers le haut. Maintenez délicatement l'embryon à l'aide des palettes d'électrode de sept millimètres sous un microscope stéréo.

Placer les électrodes, une de chaque côté du tube neural au niveau du quatrième ventricule du cervelet. Ensuite, utiliser une seringue d'un cm³ pour prélever le mélange d'ADN plasmidique et de 0,01 % Fast screen ; en général, 500 microlitres du mélange devraient suffire pour l'électroporation d'au moins huit à dix embryons. Puis, percer délicatement la lame épithéliale recouvrant le quatrième ventricule à l'aide d'une aiguille tuberculinique de 25 gauge, cinq huitièmes, fixée à la seringue d'un cm³.

Ensuite, injectez environ 50 microlitres du mélange ADN DI dans le ventricule. Les injections réussies se caractérisent par le remplissage complet du système ventriculaire par le mélange ADN DI. Un autre moyen d'administrer le mélange ADN DI consiste à accéder au système ventriculaire en perforant le voile, recouvrant le mésencéphale, à activer le générateur d'impulsions, puis à délivrer cinq impulsions carrées à l'aide d'un générateur d'impulsions électriques et de palettes électrodes de sept millimètres, le tissu le plus proche de l'électrode chargée positivement.

Ensuite, sous hotte laminaire, prenez le plasmide et remplissez les puits d'une plaque de culture de 12 puits avec deux millilitres de milieu DME MF 12 complété avec 10 % de sérum de veau fœtal, 5 % de sérum équin, 1 % de glutamine et 1 % de pénicilline-streptomycine, préchauffé à 37 degrés Celsius. Pincez ensuite l'embryon au niveau de la région médiane à l’aide d’une paire de forceps. Après avoir retiré la partie postérieure de l’embryon, placez la partie antérieure dans l’un des puits remplis de la plaque de culture.

Répétez la procédure pour tous les embryons et remplissez uniquement les puits périphériques de la plaque à 12 puits. Pour éviter toute contamination des cultures, placez les embryons dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures afin d'exprimer le plasmide électroporé. Si un temps de culture plus long est souhaité, remplissez les puits centraux d'une nouvelle boîte de culture à 12 puits avec deux millilitres de milieu D-M-E-M-F 12.

Transférez les embryons à l’aide d’une cuillère stérilisée dans les puits d’une nouvelle plaque. Replacez-les ensuite dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et cultivez-les jusqu’à 48 heures pour fixer les embryons en vue de l’analyse. Remplissez une plaque de 12 puits avec du PBS à une fois, puis transférez les embryons et rincez-les à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.

Ensuite, fixer les embryons dans du paraformaldéhyde à 2 % dans du PBS 1× pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Puis les rincer trois fois dans du PBS 1× à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. À nouveau, après avoir rempli une nouvelle plaque de 12 puits avec du saccharose à 30 % dans du PBS 1×.

Transférez les embryons dans ces puits et équilibrez-les toute la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, incluez les embryons dans le composé optimal pour la température de coupe en utilisant un bain d'éthanol refroidi à la glace sèche ou stockez-les à moins 20 degrés Celsius. Enfin, coupez les embryons en sections de 30 micromètres à l’aide d’un cryostat.

Montez-les sur des lames et conservez-les à moins 20 degrés Celsius à partir de l'histochimie. Les études présentées ici montrent des résultats représentatifs d'immunohistochimie pour la GFP sur des sections transversales d'un embryon électroporé à E 11,5 après 24 heures de culture. Les flèches indiquées ici montrent la plaque du toit qui piège l'anticorps secondaire.

Les résultats montrent que la zone électroporée du bourrelet ROIC inférieur était limitée et ne s'étendait pas sur tout l'axe antéro-postérieur du tube neural. Voici les résultats obtenus pour deux des protéines analysées : MASH1 et Math1. Nous avons observé que la majorité des embryons conservent des niveaux d'expression normaux après électroporation et culture, comparés aux embryons témoins à 11,5 jours. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une à deux heures si elle est correctement exécutée.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez maintenant bien comprendre comment utiliser le test d'électroporation in vitro pour manipuler l'expression génique dans les progéniteurs de la membrane embryonnaire de la souris.