Name: Essai Reporter Oct4GiP détudier les gènes qui régulent la souris maintenance des cellules souches embryonnaires et lauto-renouvellement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Apprenez à identifier les gènes régulant le maintien et l'auto-renouvellement des cellules souches embryonnaires de souris grâce à un essai reporter à fluorescence. Cette méthode utilise la cytométrie en flux pour évaluer rapidement le statut d'auto-renouvellement.

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Nous tenons à remercier Brad Lackford pour la lecture et la relecture du manuscrit. Cette recherche a été financée par l&#39;Institut national de l&#39;environnement Sciences de la santé, les National Institutes of Health Research Programme intra-muros Z01ES102745 (à GH).

1. Oct4GiP souris maintien des cellules ES Cellules Oct4GiP ont été aimablement fournies par le Dr Austin Smith. Elles ont été calculées à partir des souris portant un transgène 129/Ola Oct4-GFPiresPac 4,5. Ils sont maintenus dans de la gélatine recouvertes de plaques de culture tissulaire dans le ESGRO qualité moyenne, plus complet clonale (Millipore), ou dans le milieu M15: DMEM (Invitrogen) supplémenté avec 15% de FBS, 1000 U / ml ESGRO (Millipore), 1x non- acides aminés essentiels (Invitrogen), 1x Nucleasides EmbryoMax (Millipore), et 10 uM β-mercaptoéthanol. <ol><li> Manteau plaques avec 0,1% (Sigma) de la gélatine à la température ambiante pendant 30 minutes (0,1 ml de solution de gélatine / cm 2). </li><li> Oct4GiP cellules plaque en revêtues de gélatine à plaques ~ 2 x 10 4 / cm 2. </li><li> Fractionner les cellules tous les deux jours avec de la trypsine 0,05%. </li></ol> 2. transfection de siRNA dans les cellules Oct4GiP Le dosage est le plus journaliste Oct4GiP convenienTLY réalisée dans de la gélatine enduit fond plat 96 - ou 384 puits plaques (Corning ou BD) dans le milieu M15. La procédure générale est décrite dans la figure 1. <ol><li> siRNA-lipidique de montage complexes: <ol><li> Pour la transfection dans des plaques 96 puits, assembler siARN-lipidiques complexes dans U-bas plaques à 96 puits. </li><li> Dans chaque puits, mélanger 10 pi OptiMEM (Invitrogen) et 0,3 ul Lipofectamine 2000 (Invitrogen) et incuber à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Ajouter 5 siARN pmol au mélange lipidique OptiMEM et incuber pendant 15 minutes. L&#39;ARNsi: lipide est de 100 pmol: 6UL. </li><li> Transférer les complexes lipidiques dans siARN-OptiMEM de la plaque en U en bas de la gélatine à revêtement à fond plat plaque avec une pipette à canaux multiples. </li><li> Pour la transfection dans plaques à 384 puits, préparer les complexes siARN-lipidiques en utilisant 0,1 pl Lipofectamine 2000 et 2 pmol siARN dans 10 OptiMEM ul. </li></ol></li></ol> Remarque: La concentration finale en siARNles transfections est de 50 nM. Effectuer biologique 3-4 répétitions pour chaque transfection de siRNA. Mettre en place des mélanges maîtres des complexes siARN-lipidiques dans la plaque de fond en U et dans la partie aliquote à fond plat de gélatine plaque revêtue. <ol start="2"><li> Placage cellule Oct4GiP et la transfection: <ol><li> Pour la transfection dans des plaques 96 puits, collecter les cellules Oct4GiP et les remettre en suspension dans un milieu frais M15 à 9 x 10 4 cellules / ml. </li><li> Ajouter 100 ml de la suspension cellulaire dans chaque puits en utilisant une pipette multi-canaux. </li><li> Mélanger la suspension de cellules avec les pré-aliquotés ARNsi des lipides complexes dans le puits par pipetage de haut en bas 3-5 fois. Changer conseils pour transfections de siRNA différents. </li><li> Pour la transfection dans des plaques de 384 puits, les cellules Oct4GiP Resuspendre à 6 x 10 4 cellules / ml et aliquote de 30 pl de suspension cellulaire dans chaque puits. </li></ol></li></ol> Note: La densité optimale des cellules de placage est généralement de 3 x 10 5 cellules / cm 2, mais il may besoin une optimisation plus poussée des siRNA qui a considérablement influer sur la croissance ou la viabilité cellulaire. Faible densité de placage mènera à la survie des cellules pauvres lors de la transfection. Haute densité de placage mènera à fond élevé en raison de la différenciation cellulaire induite par la confluence de haut. Si nécessaire, densité de placage d&#39;essai entre 2-4 x 10 5 cellules / cm 2. <ol start="3"><li> Changement moyen: <ol><li> Retirer ancien milieu à l&#39;aide multi-canal d&#39;aspiration (Corning) ou sous vide baguette (VP-scientifique). Veillez à ne pas rayer les cellules au fond des assiettes. </li><li> Nourrir les cellules avec le milieu de cellules ES frais (100 pi pour plaque de 96 puits et 30 pi pour plaque 384 puits) en utilisant une pipette multi-canaux tous les jours. </li></ol></li></ol> 3. Analyse par FACS <ol><li> Dissociation cellulaire: <ol><li> Quatre jours après la transfection, éliminer le milieu de l&#39;aide multi-canal d&#39;aspiration (Corning) ou sous vide baguette (VP-scientifique). </li><li> Pour plaques à 96 puits, rincer les cellules une fois avec 100μl PBS. </li><li> Ajouter 25 trypsine pi 0,25% à chaque puits en utilisant une pipette à canaux multiples. </li><li> Incuber à température ambiante pendant 5 minutes avec agitation occasionnelle, et une inspection visuelle pour s&#39;assurer un complet détachement des cellules. </li><li> Ajouter 90 ul de PBS avec 10% de FBS pour inactiver la trypsine et à dissocier les cellules en une seule suspension cellulaire par pipetage répété. </li><li> Pour plaques 384 puits, dissocier les cellules avec 10 ul de trypsine et de trempe avec 30 ul de PBS avec 10% de FBS. </li></ol></li><li> Analyse FACS: <ol><li> Analyser la fluorescence de la GFP sur l&#39;analyseur BD FACS LSRII équipée avec l&#39;unité de HTS ou autre analyseur équipé de façon similaire FACS (comme Accuri ou Intellicyt). </li><li> Utilisez le mode haut débit sur le HTS et d&#39;analyser les 10 ul de la suspension cellulaire. Régler le seuil de comptage à 1,0 x 10 4 cellules. </li><li> Régler la tension de PMT et le seuil de capturer les cellules dans l&#39;intrigue vs côté-dispersion. Porte de la population de cellules vivantes dans le forward vs côte diagramme de dispersion. </li><li> Créer un histogramme pour le canal GFP. Réglez la porte dans le canal de la GFP de sorte que ~ 10% des cellules semblent être la GFP-négative dans les cellules fictives ou de contrôle-siARN transfectées. </li><li> Déterminer% GFP-négatives des cellules de chaque traitement: les cellules différenciées%% = GFP-cellules négatives. Comparer les cellules différenciées entre expérimentales% et de commande-siRNA transfections en utilisant 2-tailed test-t, et marquer les réponses positives avec des valeurs p &lt;0,01. </li></ol></li></ol> 4. Les résultats représentatifs Oct4, Nanog, et Sox2 ya trois gènes qui jouent un rôle crucial dans le maintien de cellules souches embryonnaires d&#39;auto-renouvellement 6,7,9-11. Figure 2 montre que le dosage journaliste Oct4GiP pouvons facilement détecter la différenciation provoquée par faire taire ces facteurs dans le Oct4GiP cellules ES. La figure 2A montre les cellules ES sont Oct4GiP GFP-positives lorsqu&#39;il est maintenu en tant que ES<html> cellules. Figure 2B montre le diagramme de dispersion de l&#39;avant par rapport à côté et l&#39;histogramme du canal GFP des cellules transfectées avec Oct4GiP le contrôle ou Oct4 des siRNA. Il est nécessaire à la porte des cellules vivantes dans le nuage de points avant vs côté, comme les cellules mortes et les débris sont GFP-négatif et va augmenter de fond. D&#39;autre part, la discrimination doublet d&#39;exclure amas de cellules possibles n&#39;est pas toujours nécessaire. Dans les cellules transfectées de contrôle-siRNA, la grande majorité des cellules doit être GFP-positives. Si évidentes GFP-négatifs populations sont présentes dans les puits de contrôle-siRNA transfectées, les cellules Oct4GiP de départ ou la procédure de transfection peut avoir été compromise et le résultat peut ne pas être interprétable. La figure 2C montre l&#39;histogramme de cellules différenciées (cellules%% =% différenciés GFP-négatifs cellules) de contrôle, Oct4-, Nanog-et-Sox2 siRNA cellules transfectées. <html> d/3987/3987fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Aperçu du test journaliste Oct4GiP. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3987/3987fig2.jpg" /> Figure 2. Dosage journaliste Oct4GiP peut détecter la différenciation des cellules ES causée par Nanog, Oct4, ou Sox2 silence. A) E14Tg2a (de type sauvage, ligne noire) et Oct4GiP (ligne verte), les cellules ont été analysées par FACS. Histogramme de la GFP-canal montre que les cellules sont GFP-Oct4GiP positif. B) les cellules ont été transfectées dans Oct4GiP plaques à 96 puits avec le contrôle ou Oct4-siARN et FACS analysé 4 jours après la transfection. Forward vs diagrammes de dispersion secondaires et les histogrammes de la GFP-canal des cellules transfectées sont indiquées. C) des cellules ont été transfectées avec Oct4GiP le contrôle-, Nanog-, Oct4-ou-Sox2 siARN. Les cellules différenciées% a été déterminée à partir du% GFP-négative cellules 4 jours après la transfection, et a été tracée sous forme de moyenne + / - erreur-type de la moyenne (n = 4).f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Cliquez ici pour agrandir la figure.

<ol><li>Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+differentiation%3A+emergence+of+a+new+era+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine.</a> Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132, 661-680 (2008).</li>
<li>Hu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+a+new+transcriptional+module+required+for+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal.</a> Genes Dev. 23, 837-848 (2009).</li>
<li>Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+potency+by+spontaneous+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Changing potency by spontaneous fusion.</a> Nature. 416, 545-548 (2002).</li>
<li>Ying, Q. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li>
<li>Nichols, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+pluripotent+stem+cells+in+the+mammalian+embryo+depends+on+the+POU+transcription+factor+Oct4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4.</a> Cell. 95, 379-391 (1998).</li>
<li>Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+expression+of+Oct-3%2F4+defines+differentiation%2C+dedifferentiation+or+self-renewal+of+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells.</a> Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).</li>
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<li>Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+the+embryonic+stem+cell+state%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of the embryonic stem cell state.</a> Cell. 144, 940-954 (2011).</li>
<li>Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450, 1230-1234 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Rodda, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+nanog+by+OCT4+and+SOX2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2.</a> J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).</li>
<li>Schaniel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+short+hairpin+RNAs--triggers+of+gene+silencing--into+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Delivery of short hairpin RNAs--triggers of gene silencing--into mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).</li>
<li>Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+subpopulations+in+undifferentiated+ES+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture.</a> Development. 135, 909-918 (2008).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Le dosage journaliste Oct4GiP nous décrivons ci-dessus peut mesurer quantitativement l&#39;étendue de l&#39;auto-renouvellement vs différenciation. Comparé à d&#39;autres méthodes disponibles, tels que les 12 morphologie basée et la prolifération / viabilité à base de tests, il offre une sensibilité plus élevée et le débit, ainsi que d&#39;une mesure plus directe de l&#39;état de la cellule ES. Il est donc bien adapté pour les grands écrans et des analyses épistasie génétique. En effet, nous et d&#39;autres o...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Moyennes ESGRO année complète, ainsi que des clones </td><td> Millipore </td><td> SF001-500P </td></tr><tr><td> DMEM (glucose à haute 1X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> 0,25% de trypsine-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 1001817 </td></tr><tr><td> OPTI-MEM (milieu sans sérum à réduire) </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td></tr><tr><td> ESGRO MLIF (10 units/1ml 7) </td><td> Millipore </td><td> DAM1776540 </td></tr><tr><td> MEM NEAA (non-acides aminés essentiels) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> Nucléosides 100x pour les cellules souches embryonnaires </td><td> Millipore </td><td> 10620-1 </td&gt; </tr><tr><td> Le 2-mercaptoéthanol </td><td> Sigma </td><td> M7522-100ml </td></tr><tr><td> ES-qualifiée sérum de veau fœtal </td><td> Invitrogen </td><td> 10437 </td></tr><tr><td> SiARN Nanog </td><td> Invitrogen </td><td> MSS231181 </td></tr><tr><td> Oct4 siARN </td><td> Dharmacon </td><td> D-046256-02 </td></tr><tr><td> SiARN Sox2 </td><td> Dharmacon </td><td> M-058489-01 </td></tr></tbody></table> SiARN contrôle: duplex siRNA ciblant la luciférase de luciole (5&#39;-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthétisée par Dharamcon.

essai reporter oct4gip d&#39;étudier les gènes qui régulent la souris maintenance des cellules souches embryonnaires et l&#39;auto-renouvellement

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Pluripotence et l&#39;auto-renouvellement sont deux caractéristiques qui définissent les cellules souches embryonnaires (cellules ES). Comprendre le mécanisme moléculaire sous-jacent va grandement faciliter l&#39;utilisation de cellules souches embryonnaires pour des études de biologie du développement, la modélisation des maladies, la découverte de médicaments et la médecine régénératrice (examiné en 1,2). Pour accélérer l&#39;identification et la caractérisation de nouveaux régulateurs de l&#39;entretien des cellules ES et d&#39;auto-renouvellement, nous avons développé une fluorescence journaliste basé test pour mesurer quantitativement l&#39;état d&#39;auto-renouvellement des cellules ES de souris en utilisant les cellules Oct4GiP 3. Les cellules Oct4GiP exprimer la protéine fluorescente verte (GFP) sous le contrôle de la région promoteur du gène Oct4 4,5. Oct4 est nécessaire pour les cellules souches embryonnaires d&#39;auto-renouvellement, et est fortement exprimée dans les cellules ES et rapidement régulé à la baisse lors de la différenciation 6,7. En conséquence, expression de la GFP et de la fluorescence dans les cellules reporter fidèlement corréléeavec l&#39;identité des cellules ES 5, et le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) peut être utilisé pour suivre de près l&#39;état d&#39;auto-renouvellement des cellules au niveau unicellulaire 3,8. Couplé avec l&#39;ARNi, le dosage journaliste Oct4GiP peut être utilisé pour rapidement identifier et d&#39;étudier les régulateurs de l&#39;entretien des cellules ES et l&#39;auto-renouvellement 3,8. Comparé à d&#39;autres méthodes de dosage de l&#39;auto-renouvellement, il est plus commode, sensible, quantitative, et de moindre coût. Il peut être réalisé en 96 - ou 384 puits des plaques pour études à grande échelle tels que les écrans à haut débit ou d&#39;analyse épistasie génétique. Enfin, en utilisant d&#39;autres lignes spécifiques de lignée de cellules ES Reporter, le dosage que nous décrivons ici peuvent également être modifiées pour étudier les spécifications sort lors de la différenciation des cellules ES.

Nous décrivons un test de fluorescence journaliste d&#39;identifier rapidement et de caractériser les gènes qui régulent la souris de maintenance de cellules souches embryonnaires et l&#39;auto-renouvellement.

Essai Reporter Oct4GiP d&#39;étudier les gènes qui régulent la souris maintenance des cellules souches embryonnaires et l&#39;auto-renouvellement

La pluripotence et l'auto-renouvellement sont deux caractéristiques déterminantes des cellules souches embryonnaires (CSE). La compréhension du mécanisme moléculaire sous-jacent permettra de...

L'objectif général de l'expérience suivante est de déterminer rapidement le rôle du gène d'intérêt dans le maintien de l'auto-renouvellement des cellules souches embryonnaires de souris, ou cellules ES. Ceci est réalisé en premier lieu en préparant le mélange maître de transfection qui sera utilisé pour inhiber les gènes d'intérêt. Dans un deuxième temps.Le mélange maître de transfection est transféré dans une plaque revêtue de gélatine et les cellules T 4G IP sont ajoutées. Les cellules sont ensuite cultivées dans des conditions normales de culture de cellules ES, permettant ainsi à l'effet de l'inhibition génique de se manifester. Après quatre jours de culture, les cellules sont détachées de la plaque et leur statut d'auto-renouvellement est déterminé par cytométrie en flux. Enfin, les différences dans le pourcentage de cellules négatives pour la GFP entre les cellules T 4G IP transfectées avec un ARNi témoin et celles transfectées avec un ARNi expérimental peuvent être évaluées à l'aide de facts.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'analyse de la morphologie cellulaire ou celle des marqueurs de lignage, est qu'elle offre une sensibilité et un débit plus élevés, et est donc mieux adaptée aux criblages génétiques à moyenne ou grande échelle ou à l'analyse d'épistasie génétique. Cette méthode peut grandement faciliter l'étude du rôle du gène dans le maintien et l'auto-renouvellement des ESL. Elle peut également être adaptée aux événements de spécification spontanée survenant durant la différenciation des ESL.Les cellules T 4G IP sont cultivées dans des plaques revêtues de gélatine. Elles sont ensemencées à environ deux fois 10 à la puissance quatre par centimètre carré et repiquées tous les deux à trois jours pour la transfection. Dans des plaques à 96 puits à fond plat, commencez par revêtir la plaque avec 0,1 % de gélatine, puis préparez le mélange maître d'Optum et de Lipectomy 2000 et répartissez-le dans une plaque à 96 puits à fond rond.Incuber la plaque pendant cinq minutes à température ambiante, puis ajouter cinq picomoles d'I a au mélange optimal de lipides et incuber pendant 15 minutes supplémentaires. Ensuite, retirer la gélatine de la plaque à 96 puits, fond plat, et utiliser une pipette multicanal pour transférer les complexes lipidiques i a en milieu optimal depuis la plaque fond en U vers les plaques fond plat. Maintenant, récupérer les cellules OC 4G IP et les resuspendre dans du milieu M 15 frais à une concentration de neuf fois 10 puissance quatre cellules par millilitre.Ensuite, utilisez une pipette multipuits pour ajouter 100 microlitres de la suspension cellulaire dans chaque puits d'une plaque à fond plat de 96 puits, puis pipetez de haut en bas trois à cinq fois pour mélanger la suspension cellulaire avec le pré-Eloqua. Sir, des complexes lipidiques, en changeant les embouts pour différents sir avant la transfection. Placez ensuite les plaques dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, et cultivez les cellules pendant quatre jours. Chaque jour de culture, utilisez un aspirateur multipuits pour éliminer le milieu ancien, en prenant soin de ne pas rayer les cellules au fond des plaques.Ensuite, utilisez une pipette multicanal pour nourrir les cellules avec 100 microlitres de milieu frais pour cellules ES quatre jours après la transfection. Éliminez le milieu à l’aide d’un aspirateur multicanal et rincez les cellules une fois avec 100 microlitres de PBS. Ensuite, utilisez une pipette multicanal pour ajouter 25 microlitres de trypsine 0,25 % à chacune.Incuber correctement les cellules pendant cinq minutes à température ambiante avec une agitation occasionnelle. Ensuite, inspecter visuellement la plaque pour s'assurer du détachement complet des cellules une fois celles-ci détachées. Ajouter 90 microlitres de PBS contenant 10 % de FBS pour inactiver la trypsine, puis passer la solution cellulaire plusieurs fois en pipette pour dissocier les cellules en une suspension monocellulaire.Enfin, utilisez le mode haut débit de l'unité HTS d'un analyseur de fax pour analyser 10 microlitres de la suspension cellulaire. Réglez le seuil de comptage à 1,0 fois 10 à la puissance quatre cellules et ajustez la tension du PMT pour visualiser les cellules sur le graphique de diffusion avant par rapport à la diffusion latérale. Définissez la fenêtre d'analyse pour la population de cellules vivantes sur le graphique de dispersion avant par rapport à la dispersion latérale, puis créez un histogramme pour le canal GFP.Régler la porte dans le canal GFP de manière à ce qu’environ 10 % des cellules apparaissent négatives pour la GFP dans les cellules témoins ou transfectées avec un SINA contrôle afin de déterminer le pourcentage de cellules différenciées en fonction du pourcentage de cellules négatives pour la GFP. Pour chaque traitement, comparer le pourcentage de cellules différenciées entre les échantillons expérimentaux et les contrôles transfectés avec un ARNi.Cette première figure montre que les cellules de type sauvage E 14 TG deux A, représentées par l'histogramme noir, sont négatives pour la GFP, tandis que les cellules T 4G IP, représentées par l'histogramme vert, sont positives pour la GFP lorsqu'elles sont maintenues sous forme de cellules souches embryonnaires dans les deux figures suivantes. Les diagrammes de diffusion avant par rapport à la diffusion latérale et les histogrammes du canal GFP des cellules T 4G IP, quatre jours après transfection avec des siARN contrôle ou T quatre, sont présentés dans les diagrammes de dispersion. Les cellules vivantes sont d'abord sélectionnées sur le diagramme de diffusion avant par rapport à la diffusion latérale, car les cellules mortes et les débris sont négatifs pour la GFP et présentent un fond accru, comme observé sur les données d'histogramme ; dans les cellules transfectées avec des irna contrôle, la grande majorité des cellules sont positives pour la GFP.Ces histogrammes montrent le pourcentage de cellules différenciées issues des cellules contrôles nano OCT4 et SOX2, transfectées par ARNsi, et des cellules OCT4G IP quatre jours après la transfection. Dans tous les cas, comme prévu, les cellules transfectées par ARNsi se sont révélées présenter des niveaux de différenciation plus élevés que les témoins. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure de temps de manipulation par plaque de 96 puits.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser le test rapporteur GIP d'Oxford pour déterminer rapidement le rôle de votre gène d'intérêt dans le maintien des ESL chez la souris.

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Cette vidéo montre la procédure pour générer des cellules souches pluripotentes induites à l'aide de lentivirus inductibles qui expriment Oct4, Sox2, c-Myc et Klf4.

Générer des cellules iPS de MEFS travers l&#39;expression forcée de Sox-2, Oct-4, c-Myc et Klf4

Inductible Stemgent Dox souris Lentivirus TF Set peut reprogrammer des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) pour souches pluripotentes induites (iPS). Ici nous démontrons le protocole de DOX-expression inductible de facteurs de transcription de souris reprogrammation Oct4, Sox2, Klf4 et c-Myc pour générer des colonies iPS qui expriment des marqueurs communs MES pluripotence.

Génération de cellules souches pluripotentes induites par la reprogrammation des fibroblastes embryonnaires de souris avec un facteur de transcription Quatre, doxycycline inductible système de transduction lentiviraux

La protéine SC1 agit par inhibition double de Ras-GAP et d'ERK1. Nous avons évalué la fonction de SC1 dans le maintien de l'auto-renouvellement des cellules souches embryonnaires murines en l'absence de LIF, et avons montré que SC1 est capable de maintenir l'auto-renouvellement des cultures de cellules souches embryonnaires murines.

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Cette vidéo présente une technique d’évaluation de l’activité de l’acide rétinoïque chez les embryons de souris. Après avoir isolé des cellules d’embryons de souris, les cellules sont co-cultivées avec des cellules rapporteures d’acide rétinoïque (AR). Les cellules embryonnaires produisent de l’AR, qui induit l’expression de la bêta-galactosidase dans les cellules rapporteures, indiquant l’activité de l’AR dans les cellules embryonnaires.

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Un seul dosage de l'expression du gène cellulaire est nécessaire pour la compréhension des hétérogénéités de cellules souches.

Profilage individuel embryonnaires humaines Cellules souches par RT-PCR quantitative

Dans cette étude, nous générons des cellules souches pluripotentes induites à partir de cellules de liquide amniotique de souris, en utilisant un système de transposon non viral.

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Ici, nous présentons un protocole quantitatif et évolutif pour effectuer des écrans de petites molécules ciblés pour les régulateurs de la kinase de la transition pluripotente à apprêt naïf.

Une méthode simple pour identifier les kinases qui réglementent la pluripotence des cellules souches embryonnaires par un dépistage des inhibiteurs à haut débit

Nous avons décrit en détail deux protocoles de base chimique pour la culture des cellules souches embryonnaires de souris. Cette nouvelle méthode utilise des mécanismes synergiques de promouvoir l’oxydation induite par le Tet (par la vitamine C) et réprimant la synthèse de novo de la 5-méthylcytosine (par PD0325901) pour maintenir l’hypométhylation de l’ADN et la pluripotence des cellules souches embryonnaires de souris.

Une méthode de Culture Alternative pour maintenir l’hypométhylation génomique des cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de MEK inhibiteur PD0325901 et vitamine C

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Évaluation quantitative optimisée de la stabilité de l’ARN d’amélioration dans les cellules souches embryonnaires de souris

Ce protocole fournit un pipeline de calcul rationalisé pour quantifier les transcrits d’amplificateurs naissants. En intégrant l’accessibilité de la chromatine, les caractéristiques de la chromatine et les données transcriptionnelles, il permet une détection précise et une analyse spécifique du brin de l’activité des amplificateurs dans des régions intragéniques complexes, tout en restant accessible aux chercheurs sans formation approfondie en bioinformatique.

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Apprenez à identifier les gènes régulant le maintien et l'auto-renouvellement des cellules souches embryonnaires de souris grâce à un essai reporter à fluorescence. Cette méthode utilise la cytométrie en flux pour évaluer rapidement le statut d'auto-renouvellement.

Essai Reporter Oct4GiP détudier les gènes qui régulent la souris maintenance des cellules souches embryonnaires et lauto-renouvellement (Vidéo) | JoVE Journal

Essai Reporter Oct4GiP d'étudier les gènes qui régulent la souris maintenance des cellules souches embryonnaires et l'auto-renouvellement

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