Visualisation et analyse du flux sanguin et la consommation d'oxygène dans la microcirculation hépatique: Application à un modèle de l'hépatite aiguë

Un système optique a été développé pour visualiser la microcirculation hépatique avec des érythrocytes marqués par fluorescence et pour mesurer la pression partielle de l’oxygène dans les micro-vaisseaux avec une imagerie phospho assistée par laser. Cette méthode peut être utilisée pour étudier les mécanismes physiologiques et pathologiques en analysant la structure microvasculaire, le diamètre, la vitesse du flux sanguin et la tension de l’oxygène. Dans la microcirculation hépatique, le sang circule de l’ES porte vers l’ES central, créant un gradient d’oxygène entre les deux.

La concentration d’oxygène dans le foie affecte à la fois l’expression des enzymes et la pathologie, ce qui permet d’analyser le flux sanguin et de mesurer l’oxygène. Sujets de recherche importants. Notre méthode expérimentale consiste à administrer par voie intraveineuse des globules rouges marqués par fluorescence.

Afin de visualiser la microcirculation à l’aide de la fluorescence pour la mesure de la pression partielle d’oxygène, nous administrons par voie intraveineuse de la porphyrine de palladium, qui émet de la phosphorescente dans la circulation sanguine lorsqu’elle est excitée par un laser à un degré dépendant de la concentration d’oxygène environnant. Ce processus permet une analyse quantitative de l’oxygène, la mesure de la pression partielle de la microcirculation hépatique a montré une pression partielle d’oxygène portale et vénale centrale de 59,8 et 38,9 millimètres de mercure respectivement, démontrant une mesure efficace de la concentration d’oxygène. Ensuite, nous avons appliqué cette méthodologie à un modèle d’hépatite.

Nous avons constaté une pression partielle d’oxygène élevée dans l’ES porte sinusoïdale et centrale, mais une diminution de la différence de pression entre l’ES porte et l’ES centrale. Cela est probablement dû à une diminution de la consommation d’oxygène dans la région centrale de Ven en raison de la nécrose hépatocytaire. Ces résultats montrent que notre méthodologie d’utilisation d’un système optique pour mesurer l’hémodynamique hépatique et la consommation d’oxygène est capable d’élucider les mécanismes de diverses maladies du foie dans la microcirculation hépatique.

Le gradient d’oxygène est un paramètre essentiel impliquant l’expression d’enzymes dans les régions périportale et paracentrale, types de maladies hépatiques liées aux microdistributions, il est donc important de quantifier le flux sanguin et la consommation d’oxygène. Pour clarifier les mécanismes, l’avantage de notre méthode est que la mesure optique sans contact et continue permet de quantifier le débit sanguin, les diamètres des vaisseaux blastiques et le gradient d’oxygène dans la microcirculation hépatique. Le sang total a été prélevé sur une souris donneuse et les érythrocytes ont été lavés deux fois avec du PBS par centrifugation à 400 G pendant cinq minutes.

Ensuite, dissolvez deux milligrammes de FITC dans un millilitre de 100 millimolaires d’hydrogénophosphate de sodium DI avant de filtrer à travers une membrane poreuse de 0,2 micron. Ensuite, placez une solution FITC d’un millilitre dans un tube à essai avec une solution adroite de 0,15 millilitre à trois millimolaires, une hydrogénophosphate de sodium DI de 0,25 millilitre de 180 millimolaires et un hydrogénophosphate de sodium DI de 1,5 millilitre de 100 millimolaires et tapotez pour mélanger. Gardez-le à température ambiante pendant deux heures avant de laver les globules rouges tachés deux fois avec du PBS.

Ensuite, placez une petite quantité de suspension de globules rouges sur une lame de verre et confirmez à la fois l’apparence normale des globules rouges et une suspension de fluorescence suffisante 0,1 millilitre de globules rouges dans 0,9 millilitre de PBS et maintenez-le à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que l’utilisation suivante, dissolvez 500 milligrammes de BSA dans 10 millilitres de PBS. Ajoutez ensuite 30 milligrammes de porphyrine de palladium et agitez la centrifugeuse de nuit, la solution pour éliminer toute porphyrine de palladium non résolue et filtrez le SUP natin à travers une membrane de 0,2 micron po éloquent, un millilitre de filtrat dans des tubes à essai et stockez-le à moins 20 degrés Celsius. Veillez à éviter les congélations et décongélations répétées.

Pour visualiser la microcirculation au microscope, découpez un trou de 20 millimètres de diamètre dans une plaque de plastique et couvrez le trou avec un verre de couverture carré de 30 millimètres de côté. Étalez le lobe hépatique principal sur une plaque de plastique en position couchée après avoir canulé une veine de la queue. Ensuite, utilisez plusieurs sections de trois millimètres sur huit millimètres d’une pellicule alimentaire en plastique pour couvrir la zone entourant le lobe afin d’empêcher les mouvements de la respiration et du séchage.

Visualisez la circulation hépatique à l’aide d’un microscope à transmission et confirmez qu’il n’y a pas de stase du flux sanguin dans le champ de vision pendant au moins 15 minutes. Pour observer le flux sanguin, injectez progressivement. Pointez deux millilitres de globules rouges marqués par fluorescence.

Pour mesurer la pression partielle d’oxygène, injectez 0,2 millilitre de solution de porphyrine de palladium. Les GR étiquetés FITC représenteront un 50e de tous les GR en circulation dans la région visualisée, exciteront le FITC en l’irradiant avec une lampe au mercure passée à travers un filtre passe-bande de 450 à 490 nanomètres et enregistreront la fluorescence avec une caméra CCD. La phosphorescence de la porphyrine de palladium est relativement faible et nécessite un détecteur de haute sensibilité et une pièce sombre.

Les pics d’absorption de porphyrine de palladium sont d’environ 410 et 532 nanomètres, et la deuxième longueur d’onde harmonique de 532 nanomètres est recommandée. Cette longueur d’onde est produite par un laser à impulsions YAG en néodyme, relie le faisceau laser à un microscope inversé et s’ajuste de telle sorte que le faisceau éclaire le centre du plan focal. La résolution spatiale du laser dépend de la taille du spot, qui peut être ajustée en faisant passer le faisceau à travers un sténopé.

Fixez également un filtre passe-long et un tube photomultiplicateur au microscope pour détecter la phosphorescence. Le PMT doit être sensible aux longueurs d’onde rouges, en particulier autour de 700 nanomètres. Échantillonnez le signal phosphorescent et calculez la constante de temps de décroissance en appliquant une fonction exponentielle.

Dans cette expérience, nous avons échantillonné 500 points à 200 kilohertz. Pour calibrer, préparez deux solutions de porphyrine de palladium avec une pression partielle d’oxygène de 150 et zéro millimètre de mercure chacune. Pour les zéro millimètres de solution de mercure, ajoutez 1 % de dihi sodium aux échantillons pour créer les conditions où l’oxygène est absent pendant l’étalonnage.

Maintenez un pH de l’échantillon de 7,4 et une température de 37 degrés Celsius. Positionnez la souris sur la platine du microscope et ajustez les microvaisseaux pour lesquels vous souhaitez visualiser la microcirculation hépatique au point du laser repérer les souris rapides avec un accès libre à l’eau pendant la nuit, injectez de l’acétaminophène à 200 milligrammes par kilogramme intrapéritonéal 24 heures après l’injection, anesthésiez la souris et exposez le foie avec une incision médiane. S’il y a une hépatite, elle sera facilement visible à l’œil nu par nécrose dans la région paracentrale.

Notre mesure de la pression partielle d’oxygène et des micro-vaisseaux hépatiques chez la souris a montré des pressions moyennes d’oxygène pour les portails, les sols sinusaux et les rayons centraux de 59,8, 48,2 et 38,9 millimètres de mercure respectivement. En d’autres termes, le gradient d’oxygène entre le portail et le SE central indique une libération suffisante d’oxygène des globules rouges lorsqu’ils traversent les sinusoïdes. Nous avons préparé des souris atteintes d’hépatite induite par l’acétaminophène pour mesurer les microvaisseaux hépatiques.

À titre d’exemple de modèle de pathologie, nous avons constaté que les pressions partielles d’oxygène dans les V portiques, les sinusoïdes et les E centraux étaient plus élevées dans le groupe acétaminophène par rapport aux souris normales. La différence de pression partielle d’oxygène entre les vees portales et centrales était de 20,9 millimètres de mercure pour les souris normales et de 16,9 millimètres de mercure pour les souris modèles d’hépatite. La différence de pression partielle d’oxygène entre les vees portales et centrales était de 20,9 millimètres de mercure pour les souris normales et de 16,9 millimètres de mercure pour les souris modèles d’hépatite.

Le gradient d’oxygène dans la microcirculation hépatique résulte principalement de l’apport d’oxygène à partir de la veine porte qui est consommé par les hépatocytes, la nécrose des hépatocytes dans la région vénale centrale causée par l’acétaminophène entraîne une diminution de la consommation d’oxygène, une microcirculation en aval, et donc des problèmes liés à l’hémodynamique. L’apport et la consommation d’oxygène sont impliqués dans de nombreuses formes de maladies du foie. Nous avons réalisé un modèle d’hépatite aiguë et avons constaté une augmentation de la tension d’oxygène dans les micro-vaisseaux.

Notre système optique peut être utilisé pour étudier les mécanismes physiologiques et pathologiques en analysant la structure microvasculaire, plutôt la distribution du flux et la consommation d’oxygène.