Le α-test: Rapid portable sans énumération des CD4 utilisant la salive entier

Il existe un besoin urgent de disposer d'une numération abordable des CD4 pour surveiller la maladie à VIH dans les régions à ressources limitées. Cette vidéo démontre un test de dépistage peu coûteux au point de soin, dans lequel les numérations des CD4 sont déterminées en fonction de la présence de l'inhibiteur de protéinase Alpha one PI dans la salive. Pour ce faire, on donne d'abord au sujet ou au patient un bonbon au citron afin de stimuler l'exsudation du liquide séreux dans la salive.

La salive est recueillie dans un récipient pour échantillon et transférée dans une plaque d'analyse à 96 puits. Ensuite, une quantité saturante de protéinase, l'élastase pancréatique porcine, est ajoutée à la salive, où elle se lie et inhibe l'alpha une pi. Puis, un substrat colorimétrique d'élastase est ajouté.

Toute élastase restante non liée clive le substrat, entraînant une modification de couleur passant du transparent au jaune. Du bleu Kumasi est ajouté dans les puits pour colorer les protéines totales, et des mesures colorimétriques sont effectuées à l’aide d’un lecteur de microplaques. Enfin, le rapport entre l’alpha-1-antitrypsine et les protéines totales est déterminé et utilisé pour évaluer précisément les taux de CD4 selon une valeur d’indice.

Plusieurs avantages distinguent cette technique de la méthode existante, à savoir la cytométrie en flux. Le test peut être réalisé sur le terrain sans prélèvement sanguin, qui est traumatisant et coûteux, sans utiliser d'anticorps monoclonaux, qui sont onéreux, sans formation technique spécialisée et sans nécessiter de réfrigération ni de transport d'échantillons. Cette méthode permet de surmonter un obstacle critique à l'intervention contre le sida et devrait avoir un impact majeur sur les coûts, les résultats sanitaires des patients et la fréquence de la transmission du VIH, éléments qui influencent tous de façon significative l'économie mondiale.

Cette méthode peut fournir des informations sur la manière dont l'Alpha et la PI régulent le nombre de cellules T CD4 par l'adhérence et la migration, mais elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme la façon dont d'autres inhibiteurs protéiques régulent l'adhérence et la migration cellulaire d'autres types cellulaires. Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous avons découvert que la PI de type Alpha un était si faible chez les patients infectés par le VIH qu'elle limite effectivement le nombre de cellules T CD4 qui parviennent dans le sang. Commencez ce protocole en préparant les solutions de travail nécessaires pour chaque microplaque qui sera utilisée.

Préparez 60 millilitres de tris tamponné au sel ou TBS 0,05 molaire à un pH de 7,8. En outre, pour chaque microplaque, préparez six millilitres d'élastase pancréatique porcine de type un ou PPE. Agitez bien la suspension de PPE, puis diluez-la dans du TBS à une concentration d’environ 0,01 unité par millilitre.

Ensuite, préparez une solution mère à 0,1 molaire du substrat colorimétrique SA three NA dans le DMSO. Cette solution mère doit être utilisée immédiatement ou conservée à moins 20 degrés Celsius si elle doit être utilisée immédiatement. Préparez six millilitres d'une solution de travail pour chaque microplaque en diluant la solution mère un volume dans cent dans du TBS. Enfin, préparez une solution mère de 10 % de bleu brillant de Kumasi R two 50 dans du TBS et utilisez-la immédiatement ou conservez-la à moins 20 degrés Celsius si elle doit être utilisée immédiatement.

Préparez six millilitres pour chaque microplaque en diluant le stock au 1/1000 dans du TBS. Lors de la manipulation de salive, il est important de prendre les précautions appropriées, comme porter des gants et une blouse de laboratoire, tout en maintenant le sujet de recherche ou le patient en position debout. Placez un SGO dans la bouche pour stimuler l'exsudation sérique.

Le rôle du patient vivant avec le VIH dans cette démonstration est tenu par un assistant de recherche. Un bonbon au citron sans sucre est pratique pour les patients VIH de stade un, souvent édentés et incapables de mâcher du chewing-gum, avaler selon les besoins pendant les trois premières minutes, puis recueillir la salive totale de la bouche dans un récipient d'échantillon pendant les trois minutes suivantes. Cela fournira environ deux millilitres de salive.

Si la salive ne doit pas être utilisée immédiatement, la conserver à moins 80 degrés Celsius le jour du prélèvement, puis réchauffer l'échantillon à 37 degrés Celsius. Une fois décongelée, la salive peut être conservée entre 2 et 4 degrés Celsius pendant un maximum de trois jours. Chaque échantillon et témoin sera ensemencé en triple exemplaire dans une plaque de 96 puits à fond plat afin de préparer le test, en ajoutant 130 microlitres de TBS dans chacun des puits d'échantillon et des puits témoins.

Ensuite, éviter le mucus, qui est visqueux et ne contient pas d'exsudat séreux. Transférer 20 microlitres de salive dans chacun des trois puits de test et des trois puits de contrôle négatif. Puis ajouter 20 microlitres de TBS dans les puits de contrôle positif en mélangeant à l’aide d’une pipette.

À cette étape, il est important d'éviter de faire tourbillonner l'échantillon afin de ne pas créer de bulles lors du pipetage de la salive, et d'éviter de pipeter les particules solides et les mucosités. Ensuite, agiter doucement le flacon contenant la solution de travail de l'élastase pancréatique PO ou PPE afin de bien mélanger, puis ajouter 50 microlitres de cette solution dans les puits d'échantillon et les puits de contrôle positif, ainsi que dans les puits de contrôle négatif.

Ajouter 50 microlitres de TBS. Il n'est pas nécessaire de mélanger, car le volume ajouté est suffisamment important pour permettre une répartition uniforme dans le mélange de salive. Incuber la plaque pendant 10 minutes à température ambiante.

Après l'incubation, ajouter 50 microlitres de la solution travail du substrat d'élastase SA trois NA à chaque puits. Incuber ensuite pendant 45 minutes supplémentaires à 23 degrés Celsius. Après 45 minutes écoulées, ajouter 50 microlitres de la solution travail de Kumasi blue à chaque puits.

Ensuite, lisez l'absorbance dans un lecteur de microplaques à 405 nanomètres pour détecter le clivage de SA trois NA et à 595 nanomètres pour détecter le bleu de kumasi, qui représente la teneur totale en protéines. Pour calculer l'indice alpha un PI, utilisez d'abord la formule suivante afin d'obtenir l'absorbance normalisée pour chaque longueur d'onde, en divisant la différence entre la moyenne de l'échantillon et la moyenne du témoin négatif par la différence entre la moyenne du témoin positif et la moyenne du témoin négatif. Puis, pour obtenir l'indice alpha un PI, divisez l'absorbance normalisée à 405 nanomètres par l'absorbance normalisée à 595 nanomètres, comme indiqué ici, afin de déterminer si le test alpha pourrait être approprié comme test de dépistage au point d'intervention pour surveiller les comptages de CD quatre dans les régions endémiques à ressources limitées.

La salive stimulée a été collectée auprès de 20 femmes et de 11 hommes séropositifs fréquentant une clinique pour des soins de routine au Cameroun. Conformément aux observations préliminaires réalisées lors du développement du test alpha à partir d'échantillons de salive recueillis à New York, l'indice alpha un PI et la salive recueillie au Cameroun étaient corrélés aux taux de CD4 avec une valeur de R² de 0,91 et une valeur de P inférieure à 0,0001. Cette relation était décrite par une courbe sigmoïde à trois paramètres, ce qui est conforme à une relation dose-réponse. Les intervalles de confiance à 95 % et les intervalles de prévision sont représentés respectivement par des lignes bleues et rouges.

Dans une étude précédente, nous avons déterminé que les lymphocytes T CD4 positifs présentent un cycle sinusoïdal avec une périodicité de 23 ± 3,5 jours chez les sujets infectés par le VIH-1 et chez les sujets atteints de la forme héréditaire du déficit en alpha-1-PI, PIZZ. Voici un exemple représentatif d'analyse informatique de courbe sinusoïdale du cycle des CD4 chez un témoin sain non infecté par le VIH, présentant une périodicité de 27 jours. L'analyse informatique de la courbe sinusoïdale des variations des lymphocytes T CD4 positifs chez six sujets a fourni des valeurs d'amplitude crête à crête et d'axe d'oscillation conformes aux attentes. L'axe d'oscillation était corrélé à l'amplitude avec une valeur R² de 0,96 et une valeur p de 0,009.

Chez les patients ayant un faible nombre de lymphocytes T CD4 positifs, les variations cycliques du nombre de lymphocytes T CD4 étaient faibles, tandis que chez les patients ayant un nombre élevé de lymphocytes T CD4 positifs, les variations cycliques étaient importantes, car la droite de régression représentée ici estime l'axe d'oscillation, et cet axe d'oscillation est corrélé à l'amplitude. L'amplitude peut être calculée à partir de la droite de régression afin d'estimer dans quelle mesure le nombre de lymphocytes T CD4 positifs devrait varier, par rapport à cette droite, en raison du cycle. En superposant l'amplitude calculée et l'intervalle de confiance, on a observé que l'amplitude indiquée par la ligne verte se situe à l'intérieur de l'intervalle de confiance à 95 % indiqué par la ligne bleue.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 90 minutes, du prélèvement de la salive à l'obtention du nombre de cellules CD4 pour le patient. Cette procédure est destinée à être utilisée comme test de dépistage pour surveiller les taux de CD4. Si un patient présente des changements importants dans les taux de CD4, un suivi à l’aide de la cytométrie en flux doit être effectué afin de confirmer la validité des mesures des taux de CD4 et d’aider à prendre des décisions thérapeutiques.

Dans la prochaine étape du développement, le test sur microplaque sera transformé en technologie de bandelette réactive, ce qui permettra d'effectuer des analyses sans instrument ni électricité. La transmission du VIH par la salive est peu probable, mais les patients infectés par le VIH souffrent souvent d'autres maladies infectieuses telles que la tuberculose et l'hépatite C ; n'oubliez donc pas que manipuler la salive, tout comme le sang, peut présenter un danger extrême en raison de particules infectieuses inconnues. Des précautions doivent toujours être prises, telles que le port de gants et d'autres équipements de protection individuelle lors de la réalisation de cette procédure.