La détection de l'ARN viral par fluorescence In situ (FISH)

L’objectif global de cette procédure est de visualiser l’emplacement de l’ARN viral en C deux au sein des cellules. Pour ce faire, cultivez d’abord les cellules qui seront transfectées ou infectées sur des lamelles de verre. La deuxième étape consiste à fixer les cellules avec 4 % d’aldéhyde paraforme après une transfection ou une infection réussie.

Ensuite, incubez les cellules avec un mélange d’hybridation qui marque l’ARN. Pour ce faire, on place la lamelle de couverture, côté cellule vers le bas, sur le mélange d’hybridation sur une lame. La dernière étape de cette procédure consiste à utiliser des anticorps pour colorer les cellules pour le marquage de l’ARN.

En fin de compte, la localisation de l’ARN marqué au sein de la cellule est visualisée par fluorescence dans l’hybridation C deux ou les poissons. Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes telles que l’imagerie de l’ARN et l’utilisation de cellules vivantes est que l’ARN natif peut être détecté par opposition à l’ARN modifié. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette technique auront du mal à s’occuper des patients et à manipuler des bordereaux de protection, à normaliser la méthode et à établir un calendrier précis.

Pendant les incubations, la procédure spécifique de culture des cellules pour la fixation dépendra du type de cellules. Pour les cellules adhérentes, il est d’abord important de les ensemencer sur des lamelles en verre stériles non traitées. Ainsi, la cofluence finale lors de la récolte est d’environ 70 à 80 % Les cellules non adhérentes doivent être cultivées de manière standard jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être collectées.

Ensuite, incubez-les avec des lamelles de recouvrement qui ont été traitées avec de la poly L lysine pour une plaque de culture tissulaire typique en polystyrène à 12 puits de 150 000 cellules par puits 24 heures avant l’infection ou la transfection. Incuber les cellules sur les lèvres de couverture pendant une heure à 37 degrés Celsius pour commencer la procédure de fixation des cellules. Jetez le milieu par aspiration soigneuse et ajoutez délicatement un XPBS préparé et de l’eau distillée deux fois.

Ou DPBS laver les cellules pendant une minute. Dathyl pyro CARBATE ou DEPC traité un XPBS peut également être utilisé. N’utilisez pas de PBS non traité car il peut contenir des enzymes R nase.

Jetez le DPBS et ajoutez-en doucement suffisamment. 4 % de para formaldéhyde Pour couvrir complètement les cellules, incubez pendant 15 à 20 minutes après cela, jetez le paraldéhyde et lavez les cellules avec du DPBS pendant une minute. Jetez le DPBS et ajoutez 0,1 molaire de glycine pendant 10 minutes.

Ensuite, jetez la glycine et lavez les cellules avec du DPBS pendant une minute. Après avoir jeté le DPBS, ajoutez 0,2 % de Triton X 100, incubez pendant cinq à 10 minutes. Si la coloration pour l’enveloppe nucléolaire ou nucléaire des protéines perme avec le triton X 100 pendant cinq minutes au maximum, sinon la localisation de la protéine deviendra diffuse.

Jetez le triton X 100 et lavez-le deux fois dans le DPBS pendant une minute à chaque fois avant de commencer la procédure pour le poisson. Préparez les côtés sur lesquels incuber les capots de couverture en prenant soin de les nettoyer et de bien les étiqueter. Pour une lamelle de 18 millimètres, ajoutez 50 microlitres de solution d’ADN à la lame.

L’aspect le plus difficile de cette procédure est la bonne manipulation des bordereaux de protection. Il est important de s’assurer d’incuber le côté droit de la lamelle et de les manipuler en douceur. Pour éviter la casse, ajoutez la lamelle à la lame, en veillant à la placer côté cellule vers le bas et à incuber pendant 15 minutes à température ambiante Après 15 minutes, placez les lamelles côté vente vers le haut dans une boîte de culture avec un X-D-P-B-S.

Lavez les lamelles pendant une minute. Ce mélange contient les éléments suivants. 50 % d’amide sous forme désionisée un milligramme par millilitre, TRNA deux X-S-S-P-E cinq ARN X dnar hors sonde et DEPC eau jusqu’à un volume final de 50 microlitres.

La sonde est une sonde d’ARN marquée dig genin conçue pour être complémentaire à l’ARN génomique viral. Lieu. Chaque lamelle de recouvrement côté cellule vers le bas sur le mélange d’hybridation sur la lame. L’incubation doit être effectuée dans un plateau contenant un X-S-S-P-E à 50 % FIDE.

Incuber pendant 16 à 18 heures à 42 degrés Celsius. Ensuite, incuber le couvercle de la glissière, côté cellulaire vers le bas dans 50 microlitres de 50 % fide pendant 50 minutes à 42 degrés Celsius. Lavez les lamelles de couverture deux fois dans deux X-S-S-P-E en les incubant face vers le bas dans 50 microlitres de deux X-S-S-P-E pendant cinq minutes chacun à 42 degrés Celsius.

Enfin, lavez les lamelles dans un X-D-P-P-S pendant une minute. Pour commencer cette procédure, bloquez les lamelles en plaçant le côté cellulaire vers le bas dans 50 microlitres d’une solution de blocage X Roche pendant 30 minutes à température ambiante lorsque le blocage est terminé, placez chaque lamelle côté cellule vers le bas dans 50 microlitres d’une solution d’anticorps primaires qui contient tous les anticorps primaires pour l’expérience à leurs concentrations appropriées. Incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius après une heure.

Placez la lamelle, côté cellulaire vers le haut, dans une boîte de culture contenant du DPPS et lavez les lamelles pendant 10 minutes. Ensuite, pipetez 50 microlitres de solution secondaire d’anticorps sur une lame pour chaque lamelle. Les anticorps conjugués au sol Alexa peuvent être utilisés pour générer une gamme de couleurs et sont utilisés à une dilution de un à 500 dans une solution de blocage x et une solution X-D-P-B-S Placez chaque lamelle de couverture côté cellule vers le bas dans la solution d’anticorps secondaire et incubez pendant une heure à 37 degrés.

Lavez les lamelles de couverture deux fois pendant 10 minutes chacune. Dans le DPBS sec, le couvercle se glisse côté cellule vers le haut sur un morceau de papier buvard. Assurez-vous de couvrir les lamelles pour éviter l’exposition à la lumière et le blanchiment.

Une fois que tout le liquide s’est évaporé, montez les cales de recouvrement sur des lames neuves. À l’aide de huit microlitres de support immunitaire, tapotez doucement la lamelle pour éliminer les bulles d’air, appliquez du vernis à ongles sur les bords de la gaine pour la fixer en place. La visualisation de l’ARN et des protéines par des techniques de microscopie est également essentielle au succès de cette procédure.

Les réglages du microscope utilisé peuvent aider ou entraver la visualisation. Par conséquent, il est essentiel que les paramètres du microscope soient correctement réglés et qu’ils soient cohérents d’un échantillon à l’autre dans une expérience donnée. Un résultat représentatif de la visualisation de l’ARN viral par les poissons et de la localisation des protéines par immunofluorescence est illustré par cette figure.

Dans ce premier panel où les cellules hela sont transfectées avec le VIH, l’ARN viral pour le VIH en vert est visible dans tout le cytoplasme affiché de manière diffuse pour la plupart, bien que de petits points cytoplasmiques ne soient pas rares, la spécificité peut être vue en comparant les cellules positives aux cellules environnantes qui ne présentent aucune fluorescence, comme illustré par l’image en médaillon noir et blanc qui ne représente que la coloration de l’ARN viral. La coloration rouge reflète l’immunofluorescence de la protéine de liaison à trois domaines Ross GA PSH ou G trois bp, qui marque principalement le cytoplasme lorsque les cellules hélicoïdales sont transfectées avec le VIH, un qui n’a pas la protéine régulatrice rev. L’ARN viral produit est retenu dans le noyau.

Cela peut être visualisé comme un signal vert vif dans le noyau et une absence de signal fluorescent d’ARN dans le cytoplasme. La distribution de l’ARN viral du VIH peut également être altérée par la surexpression de certaines protéines cellulaires. Par exemple, la surexpression de la protéine lysosomale en interaction de RAB sept ou protéine réelle impliquée dans le trafic des vésicules endosomiques conduit à la relocalisation de l’ARN génomique viral suivi en vert vers le centre d’organisation microtubiale.

Ici, les endosomes sont marqués par la première lampe et colorés en rouge. En revanche, la surexpression d’un delta N supprimé en phase terminale qui est incapable de se lier à P un 50 collé du complexe moteur dine disperse les endosomes tardifs dans le cytoplasme sur l’expression de P 50 dyin bloque la grande sous-unité du moteur dine et libère des endosomes tardifs, mais aussi l’ARN génomique viral et les protéines structurelles HIV V one vers la périphérie cellulaire. Lorsque le VIH 1 est exprimé dans les cellules hélicoïdales, puis que les cellules sont collectées et analysées à différents moments, l’ARN viral apparaît dans la cellule dès trois heures après la transfection et l’infection et devient facilement observable par cette technique de poisson dès 12 heures.

Ici, l’expression de l’ARN viral est suivie en vert tandis que la protéine cellulaire H-N-R-N-P-A est colorée en rouge Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 20 minutes le premier jour et en quatre heures et demie le deuxième jour si elle est correctement exécutée. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de manipuler délicatement les lamelles pour éviter de les casser et pour éviter la lumière une fois que l’anticorps secondaire a été appliqué. N’oubliez pas que lorsque vous travaillez avec le VIH V 1 et tout autre agent pathogène de niveau supérieur, il est extrêmement dangereux avant la fixation et des précautions telles qu’une formation adéquate et un confinement doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.