Chargement rétrograde des nerfs, des tracts, et les racines spinales avec des colorants fluorescents
19 avril 2012
Nous décrivons une technique simple et peu coûteuse pour l'introduction de la concentration élevée de colorants fluorescents et sensible au calcium dans les neurones ou de tout appareil neuronal aide d'une pipette d'aspiration en polyéthylène.
L'objectif général de cette procédure est d'introduire une concentration élevée de colorant fluorescent ou sensible aux ions dans des neurones ou tout tractus neuronal à l'aide d'une technique simple et peu coûteuse. Cela est réalisé en fabriquant d'abord deux types de pipettes, de type un et de type deux. Ensuite, on relie un tube en élastomère flexible à la pipette de type un et on applique une pression positive pour aspirer le tractus neuronal cible dans la pipette de type un, en vérifiant qu'un bon scellement est obtenu.
Ensuite, insérez la pipette de type deux dans la pipette de type un et utilisez la pipette de type deux pour aspirer le LCS A résiduel de la pipette de type un. Puis introduisez le colorant, sans inclure de bulles d'air, dans la pipette de type un. La dernière étape consiste à incuber les neurones à l'abri de la lumière pendant six à vingt heures.
En fin de compte, après le retrait de la pipette de type I, le prélèvement est prêt pour des études in vitro, électrophysiologiques ou morphologiques. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l'application en bain, l'injection BOS et l'électroporation réside dans le fait que le D est délivré à une population neuronale définie. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que l'activité, la connectivité, la morphologie et la distribution de neurones définis.
En général, cette technique nécessite de la pratique, en particulier pour s'assurer que le colorant ne s'efface pas dans la pipette de type un et qu'aucune bulle d'air n'y est introduite. Commencez cette procédure en faisant passer le tube en polyéthylène au-dessus de la flamme d'une lampe à alcool afin de produire deux courtes pipettes à extrémités effilées. Tout d'abord, étirez une courte pipette de type un avec une petite pointe capable de maintenir fermement la racine ou le trajet cible.
Ensuite, prenez une pipette de type deux avec une tige plus longue et plus fine, et une pointe très fine pouvant être insérée dans la pipette de type un jusqu’à sa pointe. Ensuite, reliez la pipette de type deux à une aiguille de calibre 19 munie d’un embout EC. Puis, placez la moelle épinière isolée dans un bain.
Super fusionnez-le avec du LCR refroidi tout au long du processus de chargement. Ensuite, placez la pipette de type un sur un porte-électrode de manière à ce que son orifice arrière puisse être facilement relié à une seringue à l’aide d’un tube souple. Dans cette procédure, aspirez d’abord du LCR dans la pipette de type un à l’aide d’une seringue.
Ensuite, dessinez le tractus axonal ou la racine à remplir. Puis retirez le tube souple de l'ouverture arrière. Après cela, fixez la pipette de type deux à une autre seringue.
Insérez-le dans la pipette de type un, qui maintient un tractus axonal ou une racine neuronale sous le microscope. Utilisez la seringue fixée à la pipette de type deux pour aspirer le LCS de sorte que le LCS résiduel recouvre juste le tractus axonal. Retirez ensuite la pipette de type deux de la pipette de type un.
Surveillez le niveau de LCR A pendant quelques minutes afin de vérifier un bon scellement sur le tractus axonal ou les nerfs. Ensuite, dissolvez le colorant dans du LCR A ou dans de l'eau doublement distillée contenant 0,2 % de Triton X-100. Aspirez-le dans la pipette de type deux en appliquant une pression négative faible à la seringue attachée, tout en prenant soin de ne pas aspirer de bulles d'air.
Insérez ensuite la pipette de type deux contenant le colorant dans la solution résiduelle de LCR A présente dans la pipette de type un, puis relâchez lentement le colorant dans le LCR A en appliquant une pression positive douce sur la seringue. Veillez à ne pas introduire de bulles d'air ni provoquer de déplacement du tissu cible à l'intérieur de l'embout. Si une bulle d'air est introduite dans la pipette de type un lors de l'injection du colorant, aspirez-la en avançant l'embout de la pipette de type deux près de la bulle, puis en appliquant délicatement une faible pression négative à l’aide de la seringue attachée.
Une fois qu'une quantité suffisante de colorant a été libérée, retirez la pipette de type deux. Incubez ensuite le tissu à l'abri de la lumière pendant six à 20 heures, selon le type d'expérience. Une fois le temps nécessaire pour le remplissage écoulé, retirez délicatement l'électrode du tissu.
Ensuite, le tissu est prêt pour l'imagerie ou l'histologie. Voici un schéma montrant le chargement simultané de trois dextranes fluorescents conjugués différents dans les motoneurones, les afférents sensoriels et les interneurones médullaires : les motoneurones et les afférents sensoriels sacrés ont été rétrogradés avec le dextran bleu Cascade et le dextran rouge Texas, respectivement par les racines ventrales et dorsales. Le dextran fluorescent vert a été chargé dans les interneurones médullaires dont les axones montent par le funicule ventral.
On voit ici une image confocale d'une section de la moelle épinière sacrée dans laquelle les neurones ont été marqués rétrogradement. Remarquez que les afférents sensitifs marqués sont principalement ipsilatéraux. Avec quelques projections controlatérales, les motoneurones marqués sont ipsilatéraux par rapport à la racine ventrale remplie, tandis que les interneurones marqués sont controlatéraux par rapport à celle-ci, comme l'indique la flèche.
Après avoir suivi cette procédure, des méthodes supplémentaires peuvent être réalisées afin de répondre à des questions clés telles que la connectivité fonctionnelle, l'inhibiteur excitatoire, le type de sinus, la distribution et la production de neurotransmetteurs dans les neurones du champ DI. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la neurophysiologie de la moelle épinière et du tronc cérébral pour cibler des populations neuronales spécifiques à l'aide de colorants sensibles aux ions. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'appliquer des colorants fluorescents et/ou sensibles aux ions sur des neurones et des fibres sensorielles dans la moelle épinière isolée.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Cet article décrit une technique simple et peu coûteuse permettant d'introduire de fortes concentrations de colorants fluorescents et sensibles au calcium dans des neurones ou des faisceaux neuronaux. La méthode utilise une pipette d'aspiration en polyéthylène pour assurer une introduction efficace du colorant.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Imagerie fluorescente
Contexte
- Les colorants fluorescents et sensibles au calcium sont essentiels pour l'étude de l'activité neuronale.
- Les méthodes traditionnelles peuvent être coûteuses ou complexes.
- Cette technique vise à simplifier le processus.
- L'utilisation d'une pipette de suction en polyéthylène améliore l'accessibilité pour les chercheurs.
Objectif de l'étude
- Introduire efficacement de fortes concentrations de colorants dans les neurones.
- Proposer une alternative économique aux méthodes existantes.
- Faciliter une meilleure visualisation de l'activité neuronale.
Méthodes utilisées
- Production de deux types de pipettes pour la procédure.
- Application d'une pression positive pour attirer le tractus neuronal cible dans la pipette.
- Utilisation d'une deuxième pipette pour aspirer le LCS résiduel.
- Introduction du colorant sans bulles d'air, suivie d'une incubation à l'obscurité.
Résultats principaux
- La technique permet une introduction efficace du colorant dans les neurones.
- Des concentrations élevées de colorants peuvent être obtenues à coût minimal.
- Le temps d'incubation varie entre six et vingt heures pour des résultats optimaux.
- La méthode est reproductible et accessible aux chercheurs.
Conclusions
- Cette méthode offre un moyen fiable d'introduire des colorants dans les systèmes neuronaux.
- Elle améliore la capacité d'étudier la dynamique et les fonctions neuronales.
- L'approche est bénéfique à la fois pour la recherche et les applications pédagogiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette technique permet une délivrance précise de colorants fluorescents et sensibles aux ions à des populations neuronales définies, soutenant la réduction des risques mécanistiques dans la validation des cibles et l'analyse des voies biologiques. En maintenant une concentration élevée de colorant tout au long du chargement, elle améliore la fiabilité du signal pour les tests fonctionnels et morphologiques ultérieurs. L'approche peu coûteuse et reproductible renforce la standardisation et la montée en échelle des tests dans les flux de travail de découverte précoce.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation de voies neuronales spécifiques afin de clarifier les hypothèses relatives à la connectivité et à la fonction.
- Valeur opérationnelle : Fournit une population neuronale définie pour des études reproductibles sur l'engagement ciblé.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des lectures quantitatives de fluorescence pour évaluer l'absorption du colorant et l'efficacité du marquage neuronal.
- Valeur opérationnelle : Facilite la préparation des tests grâce à une délivrance standardisée du colorant sans bulles et à des protocoles d'incubation reproductibles.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Facilite la modélisation de systèmes pertinents pour les maladies en permettant la visualisation des populations de motoneurones, de neurones sensoriels et d'interneurones dans des préparations de la moelle épinière.
- Valeur opérationnelle : Assure une continuité entre la découverte et la validation préclinique grâce à un marquage neuronal fiable pour l'électrophysiologie et l'imagerie.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre à la biologie de la découverte en permettant une marquage neuronal ciblé, soutenant la vérification d'hypothèses et la clarification des voies. Elle s'étend à l'analyse en fournissant des préparations prêtes à l'essai avec des résultats quantitatifs dépendants des colorants. La technique contribue à l'analytique grâce à des mesures quantifiables de l'intensité et de la distribution de la fluorescence. Elle soutient la recherche translationnelle en préservant l'intégrité neuronale pour des études de continuité précliniques. La réutilisation en milieu industriel est rendue possible par le système peu coûteux et adaptable basé sur des pipettes, applicable à plusieurs trajets neuronaux.
- Découverte en biologie : Permet la vérification d'hypothèses et la clarification des voies grâce à l'étiquetage défini des faisceaux neuronaux.
- Screening : Assure la préparation des tests par l'introduction standardisée de colorants à concentration élevée, sans dilution.
- Analytique : Permet des mesures quantitatives de l'intensité de fluorescence et de la distribution neuronale pour l'analyse comparative entre conditions.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique en préservant la morphologie et la fonction neuronales après marquage.
- Réutilisation en milieu professionnel : Offre une plateforme réutilisable et peu coûteuse pour un marquage neuronal reproductible dans divers modèles expérimentaux.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive en réduisant l'ambiguïté mécanistique dans les études sur la connectivité et l'activité neuronales.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et l'évolutivité grâce à une préparation standardisée des pipettes et un dépôt contrôlé du colorant.
- Valeur stratégique : Affine les décisions d'aller/arrêt en fournissant des données fiables sur l'engagement des cibles neuronales et la modulation des voies.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque grâce à un marquage neuronal cohérent et de haute fidélité à toutes les étapes de la découverte.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microchirurgie et en visualisation microscopique pour une manipulation adéquate des pipettes et une gestion précise des tissus.
- Suppose l'accès à des tubes en polyéthylène, des systèmes de seringue et une microscopie à fluorescence pour le chargement et la détection du colorant.
- Exige une standardisation interéquipes des techniques de tirage des pipettes et des conditions d'incubation afin d'assurer une étiquetage cohérent.
- Implique des adaptations à envisager lors de l'application de la méthode à différents faisceaux neuronaux ou à des systèmes modèles présentant des diamètres axonaux variables.
- Comprend des limites pratiques, telles que la nécessité d'éviter l'introduction de bulles d'air et de maintenir l'intégrité du scellement durant le chargement du colorant.
