L'analyse de la maturation des cellules dendritiques pulmonaire et de la migration au cours de l'inflammation allergique des voies respiratoires

L'objectif de cette procédure est d'évaluer la maturation et la migration des cellules dendritiques pulmonaires, ou DC, au cours d'une inflammation allergique des voies respiratoires induite par le Val Boomin chez la souris. Cela est réalisé en sensibilisant d'abord les souris au Val Boomin, puis en les exposant par voie respiratoire au Val Boomin marqué avec fitsy. Ensuite, les poumons et les ganglions lymphatiques médiastinaux sont prélevés.

Enfin, une suspension de cellules uniques est préparée à partir des tissus pulmonaires et ganglionnaires. En définitive, le statut de maturation et le nombre absolu de cellules dendritiques Pullman détectées dans le ganglion lymphatique médiastinal après un défi par FITC Val Boomin peuvent être évalués par analyse en cytométrie en flux. Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés concernant les réponses immunitaires pulmonaires, telles que la maturation des cellules dendritiques suite à une exposition à un antigène, et leur migration vers les ganglions lymphatiques de drainage.

Et si elles migrent, quelle est la vitesse de migration. Commencez par ajouter, goutte à goutte, une solution fraîchement préparée de Val Boomin, en rapport un pour un, dans un tube contenant de l’alun tout en vortexant. Agitez le mélange pendant 30 minutes, puis remplissez une seringue d’un millilitre avec 0,2 millilitre de ce mélange.

À l’aide du pouce et de l’index d’une main, saisir la souris à injecter par le repli de la nuque, près de la base du crâne. Puis, avec l’autre main, injecter la solution de Val Boomin dans l’alun dans la cavité péritonéale de la souris. Sept jours après la deuxième injection de Val dans l’alun, maintenir un animal anesthésié et sensibilisé au Val dans l’alun en position verticale, puis, à l’aide de pointes de pipette stériles, prélever 100 microlitres de solution fraîchement préparée de Val dans la solution fxi et les déposer goutte à goutte sur le NAS de la souris.

Commencez par fixer un cathéter de calibre 20 à une seringue d'un millilitre. Ensuite, après avoir confirmé l'euthanasie de la souris, ouvrez la cavité thoracique de l'animal jusqu'au niveau du cou afin d'exposer et de canuler la trachée de la souris. Il est absolument essentiel de laver les poumons et de perfuser le cœur pour s'assurer que tous les macrophages alvéolaires et les cellules mononucléées contaminants présents dans le sang périphérique ont été éliminés.

Et assurez-vous d'effectuer ces deux prochaines étapes avec précaution et, bien sûr, d'une main ferme. Administrez maintenant du PBS glacé contenant de l'EDTA trois fois à travers le cathéter afin de rincer le tractus respiratoire inférieur et d'éliminer les cellules des espaces alvéolaires. Ensuite, après avoir fixé une seringue de 10 millilitres équipée d'une aiguille de calibre 20, perfusez les poumons avec 10 millilitres de PBS contenant de l'héparine par le biais du ventricule droit du cœur.

On considère que l'élimination de toutes les cellules sanguines résiduelles de la vascularisation pulmonaire est terminée lorsque les poumons deviennent blancs. Ensuite, retirez les ganglions lymphatiques médiastinaux et placez-les dans un plat séparé. Évitez la photobléaching en minimisant l'exposition de tissu à la lumière.

Ensuite, disséquer les poumons perfusés et les placer dans une boîte de Pétri ; à l’aide de ciseaux, hacher finement les poumons. Puis, digérer le tissu pulmonaire à 37 degrés Celsius dans 250 unités par millilitre de collagénase D. Après 25 minutes d’incubation, ajouter de l’EDTA une solution pendant cinq minutes pour arrêter l’activité de la collagénase. Enfin, faire passer les fragments de poumons digérés à travers un tamis cellulaire de 100 microns et lyser les érythrocytes à l’aide d’un tampon hypotonique.

Séparez délicatement les ganglions lymphatiques médiastinaux à l’aide d’aiguilles fines et digérez-les avec de la collagénase, comme vient d’être démontré pour les poumons, puis filtrez le tissu à travers un tamis cellulaire après la sensibilisation intrapéritonéale et le défi par voie aérienne. La présence de cellules inflammatoires peut être évaluée par coloration à l’hématoxyline et à l’éosine sur des sections pulmonaires représentatives provenant de témoins.

Chez les animaux traités au sérum salé, les tissus sont dépourvus d'inflammation, comme le montre le graphique supérieur. En revanche, les cellules inflammatoires sont omniprésentes dans les coupes pulmonaires des animaux sensibilisés et exposés au Val, comme on peut le voir dans le graphique inférieur. La coloration à l'acide périodique de Schiff peut être utilisée pour évaluer la production de mucus, comme illustré dans ce graphique inférieur.

L'induction d'une inflammation allergique des voies respiratoires après une provocation à l'ovalbumine chez des souris sensibilisées à l'ovalbumine est confirmée par la présence de mucus. En revanche, une absence complète de production de mucus est observée chez les témoins traités au sérum physiologique, comme illustré dans l'illustration supérieure. Après la provocation par l'ovalbumine, les cellules dendritiques pulmonaires subissent une maturation puis migrent vers les ganglions lymphatiques drainants.

Ici, une analyse représentative de ganglions lymphatiques médiastinaux de souris montre qu'une augmentation modeste mais constante de la proportion de cellules positives pour CD11c est détectée chez les animaux sensibilisés et provoqués par Val Boomin par rapport aux souris traitées au sérum physiologique. De plus, l'analyse du nombre absolu de cellules positives CD11c, CD11b et Val Boomin FITC provenant des ganglions lymphatiques médiastinaux des souris sensibilisées et provoquées révèle une augmentation de plusieurs ordres de grandeur du nombre de cellules dendritiques chez les souris provoquées par rapport aux animaux traités au sérum physiologique. Après avoir visionné cette vidéo, nous devrions avoir une très bonne compréhension de notre technique d'analyse de la maturation et de la migration des cellules dendritiques pulmonaires.

Et une fois que vous comprenez bien cette technique, vous pouvez l'adapter pour évaluer les réponses des cellules dendritiques pulmonaires à d'autres pathogènes ainsi qu'à d'autres facteurs expérimentaux.