L'analyse de la maturation des cellules dendritiques pulmonaire et de la migration au cours de l'inflammation allergique des voies respiratoires

Le but de cette procédure est d’évaluer la maturation et la migration des cellules dendritiques pulmonaires ou des DC au cours de l’inflammation allergique des voies respiratoires induite par Val Boomin chez la souris. Ceci est accompli en sensibilisant d’abord les souris avec Val Boomin, suivi d’un défi des voies respiratoires avec un Val Boomin marqué fitsy. Ensuite, le poumon et les ganglions lymphatiques médiastinaux sont prélevés.

Enfin, une suspension unicellulaire est préparée à partir des tissus pulmonaires et ganglionnaires. En fin de compte, l’état de maturation et le nombre absolu de cellules dendritiques lues par Pullman trouvées dans le ganglion lymphatique médiastinal après le défi FITC Val Boomin peuvent être évalués par analyse cytométrique en flux. Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés sur les réponses immunitaires pulmonaires, par exemple si les cellules dendrétiques subissent une maturation, une exposition à l’antigène en baisse et si elles migrent vers les ganglions lymphatiques cotants.

Et s’ils migrent, quel est le taux de migration. Commencez par ajouter la solution Val Boomin Dropwise fraîchement préparée dans un rapport de un pour un dans un tube d’alun pendant le vortex. Remuez le mélange pendant 30 minutes, puis remplissez une seringue d’un millilitre avec 0,2 millilitre du mélange.

À l’aide du pouce sur l’index d’une main, saisissez la souris à injecter par le bout du cou près de la base du crâne. Injectez ensuite la solution d’alun Val Boomin dans la cavité péritonéale de la souris avec l’autre main. Sept jours après la deuxième injection de Val dans l’alun, tenez un val anesthésié chez un animal sensibilisé à l’alun en position verticale, puis à l’aide de pointes de pipette stériles, pipetez 100 microlitres et une solution de val dans fxi fraîchement préparée sur le NAS de la souris de manière goutte à goutte.

Commencez par fixer un cathéter de calibre 20 à une seringue d’un millilitre. Ensuite, après avoir confirmé l’euthanasie de la souris, ouvrez la cavité thoracique de l’animal jusqu’au cou pour exposer et canuler la trachée de la souris. Il est absolument essentiel de laver les poumons et de profuser le cœur pour s’assurer que tous les macrophages alvéolaires contaminants et les cellules mononucléées présentes dans le sang périphérique ont été éliminés.

Et assurez-vous d’effectuer ces deux étapes suivantes avec soin et, bien sûr, d’une main ferme. Administrez maintenant du PBS glacé avec de l’EDTA trois fois à travers le cathéter pour rincer les voies respiratoires inférieures et éliminer les cellules des espaces alvéolaires. Ensuite, après avoir ajusté une seringue de 10 millilitres avec une aiguille de calibre 20, perfuser les poumons avec 10 millilitres de PBS contenant de l’héparine via le ventricule droit du cœur.

L’élimination de toutes les cellules sanguines restantes du système vasculaire pulmonaire est considérée comme terminée lorsque les poumons deviennent blancs. Ensuite, retirez les ganglions lymphatiques médiastinaux et placez-les dans une boîte séparée. Prévenir l’extinction en minimisant l’exposition à la lumière du tissu.

Ensuite, disséquez les poumons perfusés et placez-les dans une boîte de Pétri à l’aide de ciseaux, hachez les poumons. Ensuite, digérez le tissu pulmonaire à 37 degrés Celsius en 250 unités par millilitre de collagénase D.Après 25 minutes d’incubation, ajoutez de l’EDTA au mélange pendant cinq minutes pour arrêter l’activité de la collagénase. Enfin, passez les fragments de poumons digérés à travers une passoire cellulaire de 100 microns et les érythrocytes se trouvent avec un tampon hypotonique.

Séparez les ganglions lymphatiques médiastinaux à l’aide de fines aiguilles et digérez-les avec de la collagénase comme cela vient d’être démontré pour les poumons, puis filtrez le tissu à travers une passoire cellulaire après une intrapéritonéale, une sensibilisation et des voies respiratoires. Val en pleine lutte. La présence de cellules inflammatoires peut être évaluée par coloration à l’hémat, à la toïne et à l’éosine dans des coupes pulmonaires représentatives du contrôle.

Chez les animaux traités à l’aide d’une solution saline, les tissus sont dépourvus d’inflammation comme le montre le graphique du haut. En revanche, les cellules inflammatoires sont omniprésentes dans toutes les sections pulmonaires de Val chez les animaux sensibilisés et déficients, comme on peut le voir dans le fond. La coloration graphique périodique par décalage acide peut être utilisée pour évaluer la production de mucus, comme le montre ce graphique du bas.

L’induction d’une inflammation allergique des voies respiratoires suite à val in challenge chez des souris sensibilisées est confirmée par la présence de mucus. À l’inverse, une absence totale de production de mucus est démontrée par le contrôle. Les souris traitées à l’aide d’une solution saline, comme le montre le graphique du haut, après avoir été mises en difficulté, les dcs pulmonaires subissent une maturation et une migration ultérieure vers les ganglions lymphatiques drainants.

Ici, une analyse représentative des ganglions lymphatiques médiastinaux de souris montre qu’une augmentation modeste mais constante de la proportion de cellules positives au CD 11 C est détectée chez les animaux sensibilisés et provocés par Val Boomin par rapport aux souris traitées au sérum physiologique. De plus, l’analyse du nombre absolu de cellules C positives de Val 11 C positif CD 11 B positif de Val Boomin s’ajuste à des cellules C positives des ganglions lymphatiques médiastinaux de Val chez les souris sensibilisées et provocées montre qu’une augmentation plusieurs fois plus élevée du nombre de DC se produit chez les souris exposées par rapport aux animaux traités au sérum physiologique. Après avoir regardé cette vidéo, nous devrions avoir une très bonne compréhension de notre technique d’analyse de la maturation et de la migration des cellules dendritiques pulmonaires.

Et une fois que vous comprenez vraiment cette technique, vous pouvez la modifier pour évaluer les réponses des cellules dendritiques pulmonaires à d’autres agents pathogènes ainsi qu’à d’autres facteurs expérimentaux.